practica #1

PRACTICA #1
IDENTIFICACION DE BACTERIAS POR
REACCIONES SEROLOGICAS
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Conocimiento teórico de las principales técnicas serológicas utilizadas en el
diagnóstico microbiológico y desarrollo de una técnica de aglutinación en placa
para obtener bases aplicativas.
INTRODUCCION
En los vertebrados reside la capacidad de los sistemas inmunitarios para distinguir
entre células o sustancias de su propio organismo y las que tienen otro origen.
Entre los extraños se incluyen células de otros organismos, virus, bacterias,
toxinas, toxoides, vacunas, etc. Cuando estos materiales penetran en el organismo
son reconocidos como sustancias extrañas.
La Inmunología estudia principalmente el desarrollo de la resistencia del
hospedador frente a enfermedades causadas por microorganismos, es decir, la
inmunidad adquirida específica. Las células germinales de la médula ósea que
participan en las respuestas inmunitarias, se diferencian en una de dos posibles
poblaciones de linfocitos:
1.- Linfocitos B, o Células B. Reciben ese nombre, porque las células
precursoras maduran en un pequeño órgano linfoide llamado Bolsa de Fabricio en
las aves (en los mamíferos hay tejidos linfoides equivalentes, como las placas de
Peyer del tracto digestivo) y se transforman en linfocitos B. Sólo el 20 % de los
linfocitos circulantes son Células B; el resto de las células están en el tejido
linfoide. Viven días o semanas. Las Células B son las responsables de la
respuesta inmunitaria humoral, ya que al entrar en contacto con el antígeno,
originan células plasmáticas productoras de anticuerpos. También pueden originar
células con memoria, linfocitos de larga supervivencia que están en reposo
después de haber sido estimulados por un antígeno; cuando se renueva el
contacto con un antígeno igual, producen la llamada "respuesta secundaria" que
es más rápida y vigorosa que la "respuesta primaria", porque hay una mayor y
más rápida producción de anticuerpos. El resultado es que el individuo responda
con mayor prontitud e intensidad a una segunda exposición al antígeno.
2.- Linfocitos T, o Células T, que también se originan a partir de precursores
producidos en médula ósea por las células germinales. Se desarrollan en el Timo,
de donde toman su nombre. Abandonan el timo y se concentran en bazo, ganglios
linfáticos y también van a la sangre. Viven durante varios meses. Como
consecuencia de la activación antigénica, los Linfocitos T dan lugar a las células
Efectoras responsables de la respuesta inmunitaria celular. Los linfocitos T
participan en la muerte o eliminación de materiales extraños y microorganismos
invasores, e incluso células cancerosas. Son las principales responsables del
rechazo de trasplantes y de reacciones alérgicas cutáneas. Se encargan de
movilizar a los macrófagos en la destrucción de patógenos y de estimular a las
células B para intensificar la producción de anticuerpos (hay una "cooperación
celular").
Aunque más difícil de medir, la inmunidad celular también está reforzada por una
segunda exposición a un antígeno, lo que es representado por una nueva y mayor
población de células T con memoria, capaces de responder a la segunda aparición
del antígeno.
En el laboratorio clínico, la Serología permite el estudio de las reacciones
antígeno-anticuerpo que se encuentran en el suero sanguíneo. Las reacciones
serológicas son específicas entre un antígeno y un anticuerpo y pueden ser
usadas para el trabajo de diagnóstico. Cuando uno de los componentes es
conocido, el desconocido puede ser detectado con un alto grado de sensibilidad y
exactitud. Las pruebas serológicas de reacción antígeno-anticuerpo, amplían la
capacidad diagnóstica del clínico y orientan la terapéutica. Hay muchas técnicas
disponibles.
PRUEBAS SEROLOGICAS MAS COMUNES:
- Prueba de AGLUTINACION:
En las reacciones de aglutinación el antígeno es una célula o una partícula. la
adición del anticuerpo homólogo provocará la aglutinación o la agregación, dando
como resultado la formación de agregados visibles de células o partículas. Pueden
llevarse a cabo en portaobjetos o en tubos de ensayo. La mayoría de estas
pruebas se efectúan en tubo, con diluciones seriadas del suero conteniendo el
anticuerpo (antisuero), añadiendo una cantidad fija del antígeno (la célula o la
bacteria). Después de la incubación se observa la formación de agregados,
determinándose el título.
El título es un valor relativo representado por el recíproco de la máxima dilución
que provoca aglutinación. Por ejemplo, si un antisuero aglutina a una dilución
1:256, pero no a 1:512, su título es 256.
Ejemplo de esta técnica es la Prueba de Vidal para diagnóstico de Salmonella, la
Prueba de Weill-Felix para Rickettsias, etc.
- PRECIPITACION:
Aquí se utiliza un antígeno soluble y un anticuerpo homólogo. la reacción se
manifiesta por la formación de un precipitado visible en la interfase de los reactivos.
Generalmente la cantidad del anticuerpo (antisuero) es constante y la del antígeno
es variable. A medida que la cantidad del antígeno aumenta, el precipitado se
incrementa hasta alcanzar un máximo, cuando las proporciones de ambos son
óptimas. A partir de aquí, si continúa incrementándose la cantidad del antígeno,
entonces disminuye el precipitado. Por ello las pruebas de mayor utilidad son las
que se realizan hasta alcanzar las proporciones óptimas.
Difusión Simple: En un tubo pequeño se deposita la solución del antígeno sobre
una solución del antisuero, mismas que al difundir forman un anillo de precipitación
en la interfase.
Doble difusión: En el método de Ouchterlony los reactivos difunden desde pocillos
excavados en una placa de agar. Las bandas de precipitación aparecen entre los
dos pocillos correspondientes a antígeno y anticuerpo.
Inmunoelectroforesis:
Cuando se aplica la electroforesis al estudio de las reacciones antígeno anticuerpo,
se le denomina electroforesis. Es un proceso electroquímico en el que las
partículas o macromoléculas coloidales suspendidas, con una carga eléctrica neta,
emigran en solución o en el gel de agar, bajo la influencia de una corriente
eléctrica. Las cargadas positivamente emigran hacia el cátodo, mientras que las
negativas van hacia el ánodo. Cuando se deposita una solución que contiene
antígenos proteicos en un pocillo excavado dentro de una lámina de agar y se
aplica la corriente eléctrica, los antígenos se distribuyen en manchas separadas a
lo largo de una línea. Cuando se suspende la corriente comienza la difusion de
esas sustancias a partir de las manchas correspondientes. Si se depositan los
anticuerpos en una zona rectangular excavada en paralelo a la linea de distribucion
de los antigenos, se produce una reaccion de precipitacion, adecuada para
estudiar la naturaleza de las macromoleculas que se difunden. En este caso los
anticuerpos se difunden en un frente lineal, mientras que los antigenos se difunden
circularmente, como si estuvieran impregnando un disco, dando zonas de
precipitación en forma de arco. En el suero aparecen 2 o más arcos.
Gel de agar
cátodo
o
pozo con
antígeno
zona de reacción
‫ں‬
o
pozo
con suero (Ac)
+
ánodo
- FIJACION DEL COMPLEMENTO:
Esta prueba es útil en aquéllos casos en que la interacción antígeno-anticuerpo no
se traduce en un efecto observable, como precipitación o aglutinación.
Se basa en la presencia de anticuerpos fijadores de complemento en el
suero. Estos anticuerpos, en presencia del complemento, son capaces de provocar
la lisis de células específicas. La finalidad de esta prueba es detectar anticuerpos
específicos en suero en forma indirecta.
I) Reacción positiva:
1. Antígeno + Suero conteniendo el Anticuerpo homólogo + Complemento.
Incubación.
2. El complemento se agota durante la reacción antígeno-anticuerpo (pero no hay
cambios
visibles).
3. Adición de eritrocitos de carnero + Hemolisina anti-eritrocitos de carnero
(anticuerpo
hemolítico). Incubación.
4. No hay hemólisis, porque no queda complemento disponible para que ocurra la
reacción
antígeno-anticuerpo (eritrocitos de carnero con el anticuerpo homólogo:
hemolisina antieritrocitos). Se deduce que si se agotó previamente el complemento, fue
porque se utilizó
en la primera reacción Ag-Ac.
II) Reacción negativa:
1.) Antígeno + Suero que no contiene el anticuerpo homólogo + Complemento.
2.) Incubación
3.) El complemento no se gastó (no se utilizó), porque no hubo reacción antígenoanticuerpo.
4.) Adición de eritrocitos de carnero + hemolisina-antieritrocitos de carnero
5.) Incubación
6.) Hemólisis de eritrocitos de carnero. Esto es debido a que el complemento no
fué utilizado al no ocurrir la reacción Ag-Ac previamente, por lo tanto siguió
quedando disponible para que ocurriera la segunda reacción Ag-Ac (eritrocitos de
carnero con la hemolisina antieritrocitos).
- RADIOINMUNOENSAYO (RIA):
Es una microtécnica de gran sensibilidad para la determinación de cantidades
pequeñas de antígeno:
1. Primer paso. Competencia entre el antígeno no marcado (no radiactivo) a
ensayar, en concentración desconocida + antígeno marcado (radiactivo) en
concentración conocida. Esta competencia se establece al adicionar una cantidad
limitada de anticuepo específico para el antígeno marcado.
2. Se incuba varias horas.
3. En el segundo paso, se adiciona al sistema un suero conteniendo anti-
anticuerpo específico, y por lo tanto, capaz de fijarse al anticuerpo integrante de los
complejos inmunitarios formados durante el primer paso. Esto conduce a la
precipitación de los complejos antígeno-anticuerpo.
Si el antígeno que se ensaya en el primer paso ha reaccionado con el anticuerpo,
el antígeno radiactivo indicador no podría reaccionar con el anticuerpo. En este
caso la radiactividadad en el precipitado sería muy baja. Sin embargo, si el
antígeno que se ensaya no reacciona con el anticuerpo, el anticuerpo quedará libre
para reaccionar con el antígeno indicador radiactivo. Con ello la radiactividad del
precipitado será elevada. Esta técnica es importante para detectar el antígeno del
virus de la Hepatitis B, en suero del donante de sangre.
- ENSAYO INMUNOENZIMATICO (ELISA):
Esta técnica de inmunoabsorción de enzima-ligada (enzyme-linked-immunosorbent
assay) se utiliza para el diagnóstico serológico de infecciones vírales y para la
detección de otros antígenos microbianos. Además de ser tan sencillo como el
RIA, es de menor costo, mayor rapidez y seguridad y tiene la misma confiabilidad.
Es muy sensible y se pueden detectar antígenos y anticuerpos a niveles de 10 a la
menos 10 gr, o de una parte por 10 a la 4 millones.
Procedimiento en microplaca:
El antígeno se fija por adsorción pasiva a pocillos de poliestireno. Se añde el
antisuero a probar y se incuba. Si los anticuerpos que contiene el antisuero son
homólogos, quedarán fijados al antígeno. Después se añaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana marcados con enzima, que se fijarán a los complejos
antígeno-anticuerpo formados en el primer paso. Finalmente se añade el sustrato
de la enzima cuya degradación determina un cambio de color proporcional a la
concentración de anticuerpo presente en la muestra ensayada, que se puede
apreciar por observación o medir en el colorímetro. Es aplicable en la
determinación de muchos hongos, parásitos y virus tales como herpes 2, rubeola,
etc.
- ANTICUERPOS FLUORESCENTES:
Se basa en la capacidad de ciertos colorantes de presentar fluorescencia cuando
se exponen a la luz ultravioleta. Por ejemplo los isocianatos de fluoresceina y de
rodamina. Los anticuerpos pueden conjugarse con estas moléculas, constituyendo
anticuerpos marcados. Las observaciones se llevan a cabo en un microscopio de
campo oscuro con luz ultravioleta.
Método directo: Se mezclan en un portaobjetos microorganismos con suero
conteniendo anticuerpos fluorescentes y se observan al microscopio de
fluorescencia, solo se observan los microorganismos (antígenos) que reaccionan
con los anticuerpos marcados.
Método indirecto: En primer lugar el anticuerpo no-fluorescente es enlazado a su
antígeno. A continuación se aplica un segundo anticuerpo (antisuero-humano)
marcado con fluoresceína.
MATERIALES Y METODOS
I. REACCION DE AGLUTINACION EN PLACA:
Prueba de Reacciones febriles:
Esta prueba representa un método de laboratorio útil para seguir la secuencia de
ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de
aglutinación entre los antígenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los
anticuerpos contra estos antígenos presentes en el suero del paciente.
La técnica comprende:
1. - Reacción de Widal para diagnóstico de la fiebre tifoidea, entérica y ondulante.
La reacción mide el título de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una
suspensión de antígenos conocidos de Salmonella typi , S.paratyphi A y
S.paratyphi B.
2. - Reacción de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B.
melitensis).
- Reacción de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo,
tienen componentes antigénicos idénticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OXK). En esta prueba se utilizan antígenos de Proteus para diagnóstico de tifo.
Antígenos comerciales:
Brucella (B. abortus)
Tífico O (somático)
Paratífico A (flagelar)
Paratífico B (flagelar)
Tífico H (flagelar)
Proteus OX-19
Sueros control comerciales :
control negativo
control positivo
1.
2.
Elija un brazos del paciente para localizar una vena adecuada.
En el brazo elegido se coloca una ligadura de hule látex, aproximadamente a
6 cm por encima de la vena.
3. Se limpia toda la zona con una torunda impregnada con alcohol. Deje secar
antes de sangrar, para evitar posibles reacciones alérgicas y que no arda.
Introduzca la aguja del vacutainer la muestra sanguínea:
4. Se revisan ambos paralelamente a la vena para no perforarla, cuidando que el
en el visel de la aguja, el orificio quede hacia arriba.
5. Se introduce el tubo para recolección de muestra, en el soporte del vacutainer
y automáticamente se obtendrán 3 ml.
6. Saque la aguja de la vena y presione con la torunda hasta que no salga más
sangre del paciente.
7. Deje coagular la sangre y centrifugue.
8.
Separe el suero con una pipeta pasteur y deposítelo en un tubo limpio, para
las pruebas serológicas.
PRUEBA CUANTITATIVA
# POZO
1
2
3
4
5
6
7
ml SUERO
PROBLEMA
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
0.02 de Suero
control (+)
0.02
suero
control (-)
ANTIGENO
AGLUTINACION TITULO
1 gota
1 gota
1 gota
1 gota
1 gota
1 gota
4+
4+
3+
2+
1+
3+
1 gota
No aglutina
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:80
Interpretación de los resultados: Se observa la aglutinación macroscópica y se
valoran los resultados en la siguiente forma:
(4+) 100% aglutinación
(3+) 75 %
"
(2+) 50 %
"
(1+) 25 %
"
0
Los enfermos de brucelosis aguda mostrarán un título de aglutininas 1:80 o mayor.
Pueden persistir por meses o años.
Un título tífico somático (O) significativo es 1:80, pero mayor es importante.
Para el tifo, el menor título significativo es 1:80. Un aumento cuádruple se
considera importante.
Para las reacciones febriles se toman dos muestras con un intervalo de siete días.
Si en la segunda muestra se encuentra un título más elevado que en la primera,
indicará una infección activa. Si por el contrario en la segunda muestra se
encuentra un título menor que en la primera, indica que el paciente está en
recuperación y los anticuerpos detectados son de memoria.
Anote el resultado de las pruebas febriles, por ejemplo tífico “O” positivo 1:80,
Proteus negativo, etc.
Discuta los resultados, indicando en las reacciones positivas, cómo se puede
saber en base al título obtenido, si el resultado de una titulación alta es a
consecuencia de una enfermedad activa o de inmunoglobulina (IgG) de
memoria.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES