HUESO BOVINO COMO FUENTE DE MATRIZ ÓSEA

HUESO BOVINO COMO FUENTE DE MATRIZ ÓSEA DESMINERALIZADA
BOVINE BONE LIKE SOURCE OF DEMINERALIZED BONE MATRIX
BUSTAMANTE CANO JJ*, RIVERA POSADA J**, CANO QUINTERO W***,
ROBLES ROBLES R, GONZÁLEZ MONTAÑA JR, PRIETO MONTAÑA F.
Universidad de León.24007. León. E-mail: dmvjgm@unileon.es
* Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Pamplona.Colombia.
** Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Antioquia. Colombia.
*** Interkim SA. Girardota, Antioquia, Colombia.
RESUMEN
La matriz de hueso desmineralizado ha mostrado la capacidad de inducir la formación de
hueso en lugares ectópicos y como material de injerto óseo osteoinductivo. Igualmente ha
sido mezclado con diferentes transportadores de forma que permita su manipulación
durante el implante en aplicaciones que requieran recuperación ósea. La desmineralización
del hueso, disminuye la respuesta inmune y expone los diversos factores de crecimiento de
la matriz, los cuales tienen participación directa en las funciones de osteogénesis,
osteoconducción, remodelación, realización y homeostasis en el microambiente celular
óseo.
Este estudio explora un método práctico que permita obtener una matriz orgánica después
de remover la fase mineral del hueso, de tal manera que aquella promueva una efectiva
osteoinducción en modelos vivos. La operación inicial de desmineralización comenzó con
la recolección en matadero de huesos frescos de bovino. Posteriormente el hueso es
pulverizado hasta el tamaño deseado de partícula, seguido por desengrasado/desinfección y
tratamientos de desmineralización con ácido. Finalmente la muestra es liofilizada. La
caracterización se realizó mediante un análisis de espectroscopia de infrarrojos.
PALABRAS CLAVE: Matriz ósea, bovino, osteoinducción.
SUMMARY
Demineralized bone matrix has shown the capacity to induce bone formation in ectopic
places and as material of osteoinductive bone graft. It has been mixed with a carrier’s
variety like allow different forms of manipulation for a variety of carriers that need osseous
recovery. Bone demineralization diminishes the immune response and exposes the diverse
factors of growth of the bone matrix, which have direct participation in the functions of
osteogenesis, osteoconduction, remodelling and homeostasis in the cellular osseous
microatmosphere.
This study explores a method that allows to obtain an organic matrix after removing the
mineral phase of the bone like it promotes an effective osteoinduction in animal models.
The initial bone demineralization operation began with fresh bovine bones taked from
slaughterhouse. First, bone is pulverized to the desired average particle size, followed by
deffating/disinfecting and acid demineralization treatments. After the sample is liophilized
and then is realized its characterization with an infrared analysis.
Key words: bone matrix, bovine, osteoinduction.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años se ha prolongado la vida humana y han mejorado las perspectivas de
vida animal. La síntesis de materiales biocompatibles, ha permitido reemplazar alguna parte
del cuerpo cuando ésta está deteriorada. La regeneración ósea es la técnica de elección para
reparar defectos de pequeño y mediano tamaño en maxilares y huesos largos, empleándose
como tratamiento complementario para la colocación de implantes oseointegrados.
Aún no existe un sustituto de hueso ideal, y por ello continuamente se están realizando
investigaciones. En la mayoría de los casos son productos caros, lo que no permite que
estén al alcance de todas las personas y menos aún en la práctica veterinaria.
La matriz de hueso desmineralizada es un material de injerto que promueve la formación
ósea y que ha sido ampliamente usado en aplicaciones ortopédicas y odontológicas en todo
el mundo. Se ha obtenido de hueso humano, rumiante, roedor y de otras especies.
Para la obtención del hueso desmineralizado pueden seguirse varios procedimientos
(Reddie et al, 1972; Concannon et al, 1997; Rabie et al, 2000; Han et al, 2005). Aunque el
descrito por Concannon, resulta ser el más práctico.
El presente estudio explora un método de síntesis de dicha matriz orgánica, la cual después
de verificar sus características será utilizada para producir una pasta ósea maleable (en
combinación con proteinas morfogenéticas óseas, colágeno e hidroxiapatita), con el fin de
comprobar sus propiedades osteoinductivas en un modelo in vivo y así contribuir en la
satisfacción de las necesidades del cirujano en el campo de la cirugía plástica y ortopédica.
MATERIAL Y MÉTODOS
Como hemos indicado el método propuesto
por Concannon,es el más usado para la
obtención de hueso desmineralizado. El
hueso molido se desmineraliza en ácido
clorhídrico 0,6 N (25 meq de HCl/g de hueso)
durante un periodo de tres horas realizando el
cambio de la solución cuando ésta se satura.
El hueso desmineralizado es entonces
deshidratado en etanol al 70% durante un
periodo de 10 minutos, luego se decanta, se
liofiliza y se guarda a temperatura ambiente.
Proponemos un método similar con ligeras
modificaciones que permite una mejor
extracción
de
los
lípidos,
una
desalcoholización más eficiente de la solución
y que además puede ser realizado en sencillos
laboratorios.
A partir de huesos bovinos recogidos
directamente en el matadero, se hierve el
hueso para eliminar lípidos y fluidos
sanguíneos y posteriormente se pone a secar
hasta que presente un porcentaje bajo de
humedad. Tras tener el hueso bien seco, se realiza una pretrituración con un martillo para
poder dejar el tamaño adecuado para el siguiente paso. Se introduce la muestra en un
molino Thomas-Willey, con intención de lograr un tamaño de partícula adecuado (no
superiores a 150 µm) para el siguiente paso teniendo al final un total de 80 gramos de
muestra.
Este tamaño de partícula se define tamizando en mallas finas (micras)- (ROTAP DE
MALLAS 270-240-200-150-120-80-70-40-20-10 PLATO DE RESIDUO FINAL), ya que
a menor tamaño de la partícula se obtiene mayor superficie de contacto con los reactivos.
Luego de tener la muestra en polvo se adiciona en una solución de ácido clorhídrico 0,6 N,
y se toman 3,3 litros que corresponden a la cantidad de muestra de hueso molido (80
gramos). Se dejan en homogenización por espacio de tres horas, iniciando con 1 litro y cada
hora cambiando la solución ya que esta se satura. En total se obtuvieron tres muestras de 1
litro respectivamente. Posteriormente se procede a deshidratar con etanol cada una de las
muestras obtenidas, para más tarde proceder a la liofilización a temperatura ambiente.
La muestra líquida se filtra con papel filtro (Schleicher & Schuell, 125 mm 5893) y se
obtiene la muestra para liofilización.
La prueba de Soxhlet o de verificación de grasa permite mediante extracción con éter de
petróleo y calentamiento moderado la cuantificación de los lípidos presentes en la muestra.
La cantidad de calcio presente se valoró mediante absorción atómica.
El análisis de la muestra por medio de un espectrofotómetro permite determinar las
absorbancia de dicha muestra, y es realizada a 512 nm que es el adecuado para muestras
sólidas según la normas. La medición del tamaño de la partícula se realizó, como hemos
indicado mediante las mallas ROTAP.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los lípidos presentes en la muestra son 0,556%, cantidad muy baja, por lo que no afectó al
procedimiento químico de obtención del hueso desmineralizado.
La absorbancia a 512 nm fue de 1.518 mg/g (mg de Ca(PO3)2/g de HCl 0,6 N). El calcio
presentó valores de 2,58%. Según Reddi (1972) la descalcificación preferiblemente debe
dar resultados menores del 10%, siendo el ideal 0,5%. No se logró descalcificación
completa, lo que a su vez puede provocar una posible interferencia en extracción de
proteínas, pero está dentro del rango aceptado para su utilización como material
osteoinductor.
El tamaño de las partículas se situó en 150 µm. Bolander y Balian (1986) trabajaron con
100-300 µm, mientras que Reddi et al (1972) con tamaños entre 74-420 µm. Es preferible
menor tamaño de partícula (100-150 µ), puesto que ello aumenta la superficie de contacto
(Le Geros, 1991).
Por todo lo expuesto podemos afirmar que el producto obtenido es adecuado para la
producción de pasta ósea, que tras combinarse con proteínas morfogenéticas óseas,
colágeno e hidroxiapatita, pueda ser usado en osteoinducción. La pasta así formada debe,
posteriormente, ser utilizada en implantes óseos in vivo.
BIBLIOGRAFÍA
Bolander ME, Balian G. The use of demineralized bone matrix in the repair of segmental
defects. Augmentation with extracted matrix proteins and a comparison with autologus
grafts. The Journal of Bone and Joint Surgery, 1986; 68 (8): 1264-1274.
Bowman SM, Zeind J, Gibson LJ, Hayes WC, McMahon TA. The Tensile Behavior of
Demineralized Bovine cortical Bone. J. Biomechanics 1996; 29 (11): 1497-1501.
Broz JJ, Simske SJ, Greenberg AR. Material and compositional properties of selectively
demineralized cortical bone. Journal of Biomechanics. 1995; 28 (11): 1357-1368.
Concannon MJ, Boschert MT, Puckett CL. Bone induction using demineralized bone in the
rabbit femur: A long term study. Plastic and Reconstructive Surgery. 1997; 99 (7): 1983–
1988.
Han B, Tang B, Nimni, ME. Quantitative and sensitive in vitro assay for osteoinductive
activity of demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2003; 21: 648 654.
Han B, Yang Z, Nimni M. Effects of moisture and temperature on the osteoinductivity of
demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2005; 23: 855-861.
Le Geros R: Calcium phosphate biomaterials in preventive and restorative dentistry, in
calcium phosphates, in RZ Legeros (ed): Oral Biology and Medicine. Basel, Switzerland,
Karger, 1991: 154-192.
Rabie AB, Wong R, Hägg U. Composite autogenous bone and demineralized bone matrices
used to repair defects in the parietal bone of rabbits. British Journal of Oral and
Maxillofacial Surgery. 2000; 38: 565–570.
Reddi AH, Huggins C. Biochemical sequences in the transformation of normal fibroblasts
in adolescents rats. Proc. Nat. Acad. Sci. 1972; 69 (6): 1601-1605.
Walsh WR, Christiansen DL Demineralized bone matrix as a template for mineral-organic
composites. Biomaterials 1995; 16: 1363-1371.