Diapositiva 1 - Departamento de Quimica Biologica

ARN
ARN2009
2009
Procesamiento del ARN
Elba Vazquez
Departamento de Química Biológica
Email: elba@qb.fcrn.ub.ar
Poliadenilación
hnARN precursor de ARNm
extremos 3’ con cadena de residuos AMP
Cola de poli(A)
Medida de la cola de Poli(A)
Corte de ARN con RNasa A y T1
preserva A’s
hnARN núcleo
ARNm cit
Poli (A) 150-200 nt
Sheiness y Darnell, 1973
Poliadenilación
(a) Poli(A) interior
(b) Poli(A) 3’ terminal
ARN…ApApApAp…ApXpYpz
ARN…ApApApAp…A-OH
RNasa A & T1
ApApApA..Ap
ApApApA..A-OH
HO-
nAp
nAp + A-OH
AMP/A = 200
Poliadenilación
• poli(A) no se forma por transcripción del ADN
• Enzima en núcleo: poli(A) polimerasa (PAP)
• poli(A) es agregada a precursores del ARNm
• poli(A) en citoplasma sufre turn over
Poli(A) puede ser agregada post-transcripcionalmente
Función del Poli(A)
• Protege al ARNm de la degradación
• Estimula la traducción del ARNm.
Protección del ARNm
RNAm polyA+/en oocitos de X
[3H] histidina
sínt de globina
Seph G100
ARNm poli(A) más estable que ARN sin poli(A)
Revel y col,1974
Protección del ARNm
Traducción de
ARNm poli(A)+
y poli(A)– de
globina en
función del
tiempo
poli(A) protege ARN de degradación
Revel y col,1974
Transducibilidad y estabilidad del ARNm
Poli(A) aumenta transducibilidad de todos los ARNm
sin afectar la estabilidad
Munroe y Jacobson, 1990
¿Qué paso de la traducción es aumentado
por poli(A)?
- Asociación entre el ARNm y los ribosomas
Poli(A)+ ARNm forman polisomas más eficientemente
[32P]Poli(A) ARNm + [3H]Poli(A)- ARNm
pico de monosomas
Izq: picos de polisomas
Eficiencia de la formación de
polisomas en función de la long
de la cola
Munroe y Jacobson, 1990
Poliadenilación
La poliadenilación y la terminación de la
transcripción no están necesariamente ligadas
Poliadenilación
La transcripción ocurre más allá del sitio de poliadenilación
Clivaje y poliadenilacion requiere
Señales que actúan en Cis
Factores que actúan en Trans
Señales en Cis
• Cuales son los sitios de poli(A)?
• Que pasa si estos sitios son mutados?
Señales de poliadenilación
¾Secuencia AAUAAA 20nt upstream sitio poli(A)
Deleción de AATAAA previene la poliadenilación en ese sitio
¿Es AATAAA invariable?
Wickens, 1990
Señales de poliadenilación
¿Es AATAAA por si misma suficiente para poliadenilación?
• Inhibición por deleción de secuencias próximas
downstream del sitio de poliadenilación
• Región rica en GT o T
20nt (GT/T)
AATAAA-------------------• Posición de GT/T respecto de AATAAA y
distancia entre GT y T
AATAAA 23-24pb GTGTGTGTGTTTTTTTT
Elementos en Cis de la region 3’ poly(A)
AAUAAA
G/U
AAUAAA
Elemento altamente conservado localizado 10-30 nts
upstream del sitio de poli(A)
Esencial para el clivaje y poliadenilación
Región G/U-rich (G/U Box)
Elemento downstream menos conservado
Requerido para la reacción de clivaje
Mutaciones de AAUAAA
¾ Deleción o mutación de AAUAAA resulta en fallas de clivaje y
poli(A) in vivo o in vitro.
¾ RNAs largos, heterogéneos se detectan in vivo usando genes
reporteros con mutaciones en AAUAAA.
¾ Estos ARNs se extienden varios cientos de nts del sitio mutado
(análisis de protección de la RNasa)
¾ No se unen a columnas de celulosa oligo-dT
No hibridan con primers oligo-dT
no tienen cola de poli(A)
GU-rich
¾ El elemento GU-rich es importante para la
reacción de clivaje
¾ No se requiere para la reacción de
poliadenilación porque no está en el pre-mRNA
después del clivaje
5’
AAUAAA
5’
AAUAAA
GU-rich
A
AA
GU-rich
Señales de poliadenilación
•
Sitio de poliadenilación sintético (SPA)
Secuencia no relacionada = eficiencia
Proudfoot y col., 1989
Señales de poliadenilación
¾ Competencia entre la señal natural y SPA
SPA compite porque tiene motivos GT Y T
(señal natural tiene solo
sitios GT)
¾ SPA insertado en intrones y exones
La señal de poliadenilación funciona si está localizada en exones
Proudfoot y col., 1989
Poliadenilación
• Ocurre 10-30 nt río abajo del sitio de la
secuencia consenso AAUAAA
• Catalizado por la Poli (A) polimerasa
• Se agregan entre 80-250 residuos A
Poliadenilación y clivaje
AAUAAA / U-rich
¾ Las secuencias de los dos elementos y sus
distancias especifican el sitio de clivaje y poli(A)
¾ También especifican la fuerza de la señal de
poli(A)
¾ El sitio de clivaje generalmente ocurre
inmediatamente 3’ al dinucleótido CA que está
posicionado a la distancia correcta de cada
elemento core.
CA
5’
AAUAAA
GU-rich
AAUAAA /
GU-rich
¾ Distancia entre los dos elementos > 50 nts
eficiencia de clivaje y poliadenilacion
más del 90%.
¾ Distancias mayores resultan en la pérdida del
reconocimiento del sitio de poli(A)
¾ Porque la distancia es tan importante?
Factores en Trans reconocen y se unen a las
señales en cis de clivaje y poli(A)
Factores en Trans
Requeridos para clivaje y poliadenilación
• CPSF-Cleavage and Polyadenylation
Specificity Factor
• CstF- Cleavage Stimulation Factor
• PAP- Poly (A) Polymerase
• PAB II- Poly(A) Binding Protein II
• Otras proteínas: CFI y CFII
Reconocimiento de los sitios de poli(A)
• CPSF- reconoce AAUAAA
• CstF- reconoce al elemento GU-rich
CPSF
CstF
AAUAAA
G/U
Interacciones de los factores
• CstF-77 interacciona con CPSF-160
puente de complejos unidos a AAUAAA y GU-rich
distancia es importante
interacciones proteína-proteína entre los complejos
CPSF y CstF
Los dos factores actúan en forma cooperativa y
aumentan estabilidad de la unión
Maquinaria de Poliadenilación
Shatkin & Manley. Nature Struc. Biol. (2000) 7:838
Clivaje del Pre-ARNm
• Requiere RNA polimerasa II
Pre-ARNm 32P +
Factores + PAP
RNA polimerasa II A y O estimulan el clivaje
Hirose y Manley, 1998
Clivaje del Pre-ARNm
Requiere RNA polimerasa II: ¿Cuál dominio?
CTD-GST
cromatog afinidad
ensayo de clivaje
fosforilación o no
IIB: sin
CTD
CTDP estimula el clivaje
Hirose y Manley, 1998
Analysis of the requirement for RNA polymerase II
CTD heptapeptide repeats in pre-mRNA splicing and
3’-end cleavage
RNA (2004) 10: 581-589
Pol II con CTD de 22 heptadas puede transcribir y procesar un preARNm conteniendo intrones constitutivos y ESE dependientes
RNA (2004) 10: 581-589
La deleción de CTD a 22 repeticiones reduce la inclusión de un exón
alternativo
RNA (2004) 10: 581-589
CTD es necesario para contrarrestar los efectos negativos de ESS
sobre la inclusión de v5
Conclusión: longitud de CTD es el principal determinante del procesamiento eficiente
RNA (2004) 10: 581-589
CstF
• CstF-50 se une al CTD de RNA Pol II ligando
el complejo CstF a la trascripción
PAP- Poly (A) Polymerase
• Agrega residuos A al extremo 3’ clivado
• No tiene especificidad de secuencia y
tiene baja velocidad de polimerización por
si solo
• Interacciona con CPSF-160 y permanece
unido al RNA vía CPSF durante las
reacciones de clivaje y poli(A)
• PAP polimeriza en etapas
Iniciación de la Poliadenilación
Pre-ARNm clivado
Fase I: agregado de las primeras 10 A’s
Lenta y dependiente de AAUAAA
Fase II: elongación
Rápido y dependiente del oligo
¿Cuál es la señal que causa
Poliadenilación?
AAUAAA + 8nt
Sustrato: ARN* cortos con secuencia AAUAAA + 8nt ext 3’
CPSF
Wickens y col, 1990
Las dos fases de la Poliadenilación
Sustratos: 58nt terminales de ARNm* con secuencia AAUAAA o aberrante
A40: con poly(A)
X40: sin poly(A)
Sheets y Wickens, 1989
CPSF se une a AAUAAA
Primera fase: depende de la señal AAUAAA y CPSF hasta que poly(A) llega a
10nt.
Segunda fase: Depende de poly(A) en el ext 3’
Keller y col. 1991
PAB II- Poly A Binding Protein II
• PAB II se une a la cola de poli(A) naciente
(10 a 20 residuos) y forma un complejo
cuaternario con CPSF, PAP y el ARN
sustrato
• El complejo estabiliza la unión de PAP al
extremo 3’ del ARN
• La síntesis procesiva ocurre en un solo
paso rápido con el agregado de 200-300
residuos A
Elongación del Poly(A)
Seph G100
PAGE
Act estimulatoria de la
poliad = PABPII
Wahle, 1991
CPSF y PABII en Poliadenilación
Elongación requiere PABII
Indep de AAUAAA, depende de poly(A)
Act
por CPSF
Wahle, 1991
PAB II- Poly A Binding Protein II
¾ El control de la longitud resulta de la interrupción
de las interacciones entre RNA, CPSF y PAP
¾ PAB II trabaja cooperativamente con CPSF para
mantener a PAP sobre el ARN primer
¾ Estas interacciones se interrumpen cuando la
cola alcanza una determinada longitud
Como se recluta el complejo de poliadenilación
en los sitios de reconocimiento de poli(A)?
Componentes de CPSF y CstF interaccionan con RNAP II CTD
Modelo de Poliadenilación
CPSF
CFI y CFII
PAP
PABII
CStF
Wahle, 1991
Poli(A) Polimerasa
RBD: RNA binding domain
PM: Polymerase module
NLS: nuclear localization signal
S/T: serine/threonine rich regions
Manley y col. 1991
Extremo C-terminal de Poli(A) Polimerasa
Mut: AAAAAA
Expresión de full length o 3’ deleted PAP I cDNA por transcripción in
vitro con SP6 RNA polimerasa
Requiere ARN wt y SF (CPSF) para operar PAP
Solo la full length y la versión de 538 aa de PAP
causan poli(A)
Manley y col. 1991
Factores involucrados en el procesamiento
del extremo 3’ en mamíferos
The
EMBO J
(2008)
27: 482498
Network del procesamiento co-transcripcional para regular al
expresión génica y mantener la estabilidad genómica
Turn over del Poli(A)
ARN poli(A)+ Nuclear
ARN poli(A)+ citoplasmático
En citoplasma Poli(A) es intecambiado
(turns over)
Tendencia al acortamiento
Sheiness y Damell, 1973
Poliadenilación citoplasmática
ARNs maternos: deadenilados
Maduración: adenilación parcial
D7: ARNm de Xenopus
maduración poliadenilación
específica
P: progesterona
D7 ARN tiene una secuencia requerida para
la poliadenilación maduración específica
UUUUUAU upstream
Wickens y col. 1989
Poliadenilación maduración específica
SV40 con UUUUUAU upstream AAAUAA
Elemento citoplasmático de poliadenilación:
UUUUUAU
Wickens y col. 1989
Poliadenilación maduración específica
¿AAUAAA también es necesario?
AAUAAA es requerido para poliadenilación
nuclear y citoplasmática
Wickens y col. 1989
Efectos del Cap y Poli(A) en el splicing
¾Los procesos de capping, poliadenilación y splicing
están relacionados
¾El cap es esencial para el splicing OUT del primer
intrón
¾La Poli(A) es esencial para el splicing OUT del último
intrón
mRNA capping, splicing, 3’ end formation, and
transcription all closely
linked and functionally interconnected:
Efecto del cap sobre el splicing
a: primer
intrón lazo
La ausencia del cap inhibe el splicing del primer intrón
Shimura y col. 1987
Complejo de unión al CAP (CBC)
El reconocimiento del cap está en un paso temprano
en la formación del spliceosoma. CBC está involucrado
Mattaj y col. 1994
Efecto del poli(A) sobre el splicing
Los sustratos poliadenilados son spl más rápido y
eficientemente
Niwa y Berget, 1991
Efecto del poli(A) sobre el splicing de un
sustrato con dos intrones
Poli(A) es requerido para la remoción del último intrón,
el más cercano a la colita de poli(A)
Niwa y Berget, 1991
Regulación del procesamiento en 3’
en el desarrollo y enfermedades
The EMBO J (2008) 27: 482-498
Procesamiento del ARNm
Procesamiento diferencial del ARNm
Múltiples productos son derivados de un
gen por procesamiento diferencial
Transcripto primario
1 ARNm
maduro
1 polipéptido
Transcripto primario
= ARNms
maduros
= polipéptidos
procesado en más de 1 forma
contiene señales moleculares para todas las formas de
procesamiento alternativo
¾Poliadenilación alternativa
variedad
de transcriptos de un solo gen
¾Más de la mitad de los genes humanos
tienen sitios múltiples de poli(A)
¾Puede ocurrir de manera tejido específica
¾Factores en trans y elementos en cis
regulan la poliadenilación alternativa en
diferentes tejidos
Procesamiento alternativo
Procesamiento alternativo
Procesamiento de ARNr y ARNt
Pre-ARNr
clivaje enzimático
ARNr maduro
clivaje enzimático
transcripto
primario ARNt
adición de CCA
modificación de bases
ARNt maduro
bacterias
vertebrados
Procesamiento de pre-ARNr
Procesamiento de ARNt
Bacterias y eucariotas