Determinación de ácido abscísico, ácido indolacético, zeatina

Determinación de ácido abscísico, ácido indolacético, zeatina y
ribósido de zeatina en hojas desarrolladas de Gerbera jamesonii
cv Bolus y su variación con la edad
2
C. Olivella 1*, M. Vendrell 2, R. Savé1
Dpto. de Tecnologia Hortícola. Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA).
Centre de Cabrils. Carretera de Cabrils s/n. 08348 Cabrils (Barcelona).
Centre d’Investigació i Desenvolupament (CID). Consell Superior d’Investigacions Científiques
(CSIC). C/. Jordi Girona Salgado, 18. 08028 Barcelona.
carme.olivella@correu.gencat.es
1
RESUMEN
Muchos de los procedimientos utilizados en la determinación de hormonas vegetales han sido establecidos
para la cuantificación de las mismas en una amplia variedad de tejidos. Sin embargo, se han desarrollado muy
pocos para la determinación en hojas plenamente desarrolladas, las cuales están altamente pigmentadas y contienen muchos compuestos que copurifican con las hormonas. Se proponen dos métodos para la medida simulánea
de ácido abscísico (ABA) y ácido indolacético (AIA) por un lado, y de zeatina con ribósido de zeatina (Z+ZR)
por otro, en hojas plenamente desarrolladas de Gerbera jamesonii cv Bolus. Estos métodos incluyeron una etapa
inicial de extracción líquido-líquido, una etapa de extracción en fase sólida, una etapa de purificación por HPLC
y una cuantificación por ELISA. Este esquema es parecido a otros propuestos para la medida de hormonas vegetales en hojas plenamente desarrolladas utilizando cromatografía de gases con detector selectivo de masas
(GC-MS). Los resultados mostraron que no hay diferencias significativas en las concentraciones de ABA y de
AIA según la edad de las hojas. En cambio, para Z+ZR se encontraron diferencias entre las hojas jóvenes (7 días
de edad) y las adultas (21 días), pero no entre las adultas y las viejas (60 días).
PALABRAS CLAVE:
ABA
IAA
Z+ZR
Hojas
HPLC
ELISA
INTRODUCCIÓN
El ácido abscísico (ABA), el ácido indolacético (AIA) y las citoquininas (CQ) participan
en los mecanismos de regulación del estado fisiológico de la planta. Así, además de otras fun* Autor para correspondencia
Recibido: 17-4-00
Aceptado para su publicación: 9-4-01
Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. Vol. 16 (3), 2001
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C. OLIVELLA et al.
ciones, el ABA estimula el cierre de los estomas, mientras que el AIA y CQ ejercen la acción
contraria. Por otra parte, las CQ estimulan la multiplicación celular y el AIA favorece el crecimiento celular. Determinar sus niveles foliares es fundamental para poder establecer la respuesta de la planta frente a los estreses abióticos (Mansfield y Mc Ainsh, 1995).
Los procedimientos para la determinación de ácido abscísico (ABA), ácido indolacético (AIA), zeatina (Z) y ribósido de zeatina (ZR) en hojas desarrolladas requieren la utilización de diversas etapas de purificación con sistemas muy sensibles de detección, debido
a la alta pigmentación de las hojas y a que los niveles foliares de hormonas son muy bajos, respecto de los de otros compuestos que copurifican con ellas (Horgan, 1995; Okuda,
2000). Los sistemas de purificación son muy diversos: HPLC, extracción en fase sólida
(SFE), extracción líquido-líquido, y se usan de forma única o combinada. En cuanto a los
sistemas de detección, la variabilidad no es menor: HPLC con detección por ultravioleta o
por fluorescencia, cromatografia gas-líquido (GLC) con varios detectores (de ionización a
la llama, FID, de espectrometría de masas o MS, de captura de electrones o ECD, etc.),
métodos inmunoenzimáticos (radioinmunoensayo, RIA, en soporte sólido, ELISA, etc.)
(Hedden, 1993; Horgan, 1995).
Muchos de los procedimientos analíticos se han establecido para yemas, frutos, callos, meristemos, etc. (Nan et al., 1999; Kotov y Kotova, 2000), etc., y muy pocos lo han
sido para hojas totalmente desarrolladas (Li et al., 1992; Okuda, 2000).
Los métodos inmunoenzimáticos están siendo ampliamente utilizados en la determinación de las hormonas vegetales, debido a su bajo costo y a su sencillez. Aunque se pueden utilizar directamente sobre el extracto vegetal, la mayoría de los autores recomiendan
la inclusión de una o varias etapas previas de purificación del mismo, de manera similar a
como se hace en la determinación por GLC-MS (Horgan, 1995; Sztein et al., 1999).
El objetivo de este trabajo fue el establecimiento de dos procedimientos de purificación y determinación de hormonas mediante ELISA, uno para ABA y AIA simultáneamente, y otro para Z y ZR (Z+ZR) conjuntamente, en hojas de diferente estado de desarrollo en plantas de Gerbera jamesonii.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material vegetal
Seis plantas de 8 meses de edad y de porte similar de Gerbera jamesonii cv Bolus en
producción bajo invernadero fueron seleccionadas al azar. Las plantas se regaron diariamente con una solución nutritiva de composición N:P2O5:K2O (1:0,6:2). Hojas de diferente edad, jóvenes (de siete días de edad), adultas (de 21 días) y maduras (de 60 días), fueron muestreadas al azar en tres momentos diferentes, a 1, 4, y 9 días a partir de la fecha de
inicio del experimento.
Determinaciones hormonales
Inmediatamente después del muestreo, las hojas fueron sumergidas en nitrógeno líquido, liofilizadas y conservadas a –80° hasta su procesamiento. El ABA, AIA y Z+ZR
fueron determinados mediante los procedimientos siguientes:
HORMONAS VEGETALES EN HOJAS DE GERBERA
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Hormonas ácidas
Para la extración del ABA y del AIA, 0,2 g de hojas liofilizadas fueron sumergidas en
10 ml de una solución extractante (Vine et al., 1987) compuesta por acetona: ácido acético (CH3COOH) 0,2 M 70:30 (v/v), 100 mgml–1 de BHT (2,6 di-t-butil 4-metilfenol) y 20
mgml–1 de ascorbato de sodio durante 16 horas a 4 ° C a oscuras agitación continua
(Fig. 1).
0,2 g Peso Seco
10 ml Solución Extractante
Centrifugación y Filtración
Evaporación Acetona
Solución acuosa pH 8,5
Extracción Pigmentos con
Acetato Etilo
Solución acuosa pH 2,5
Carga Minicolumna C18
Elución con éter dietílico
Evaporación éter
Metilación con Diazometano
Redisolución en 100 µl MeOH:H2O
Inyección 50 µl HPLC
Recolección fracciones ABAMe, AIAMe
ELISA
Fig. 1.–Diagrama de flujo del procedimiento de purificación para la determinación ELISA de
ABA y AIA en hojas desarrolladas de plantas de Gerbera jamesonii cv Bolus
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El extracto se centrifugó a 3.000 g durante 6 + 10 min y se filtró con papel Whatman
no.41. El residuo se recuperó con 2,5 ml de la solución extractante y centrifugado otra vez
a la misma velocidad durante 5 min. El extracto se filtró y se recogió la fase líquida. Se
evaporó la acetona con corriente de N2 a 35 ° C. Se ajustó el pH de la fase acuosa a 8,5
con una solución de NaHCO3 semisaturada y se procedió a la extracción de los pigmentos
con 3 ´ 5 ml de acetato de etilo. La fase orgánica fue descartada y el pH de la solución se
ajustó a 2,5 con H2SO4 1N.
La solución se introdujo en una minicolumna con 100 mg de relleno de C18 (Bond
Elutä Analytichem), previamente acondicionada con 3 ml de metanol (MeOH) y 3 ml
HCl 1N. El ABA y el AIA fueron eluidos con 2 ´ 3 ml de éter etílico recogidos sobre
agua. La fase etérea fue extraída y seguidamente evaporada con corriente de N2 a 35 ° C.
El residuo sólido se recuperó con 0,1 ml de MeOH y las hormonas se metilaron con 0,6
ml de diazometano preparado en nuestro laboratorio. Los derivados metilados (ABAMe y
AIAMe) fueron llevados a sequedad con corriente de N2 a 35 ° C.
El ABAMe y el AIAMe fueron recuperados con 0,2 ml de una solución de MeOH:
CH3COOH 0,2 M pH 3 50:50 (v:v). Se tomaron 70 m l, y después de pasarlos a través
de un filtro de nailon de 0,2 µm de tamaño de poro, se inyectaron en un equipo Shimadzu de HPLC equipado con un detector de fotodiodos (Maldiney et al., 1986). La
columna utilizada fue Tracerä 15 cm de longitud y 0,4 cm de diámetro y una fase estacionaria de octadecilsilil (ODS-2), de 3 µm de tamaño de partícula. La elución de las
hormonas se realizó de acuerdo con el siguiente procedimiento: caudal 0,4 mlmin–1,
condiciones iniciales: 50 % Me OH en CH3COOH 0,2M durante 5 min, a continuación un gradiente lineal hasta el 100 % de MeOH en 13 min. Esta concentración de
MeOH se mantuvo durante 2 min para permitir la limpieza de impurezas de la columna y del equipo, y seguidamente la concentración del eluente se situó en 2 min al 50 %
en MeOH. Después de un período de 5 min el equipo se encontró estabilizado y listo
para comenzar la purificación de otra muestra. El tiempo de elución de las fracciones
se estableció con una solución patrón de 5 m g. ml–1 de AIAMe y de ABAMe. En estas
condiciones se obtuvo una recuperación del 29,2 ± 5,1 para n = 4, que está de acuerdo
con las recuperaciones que se han obtenido en otros trabajos, para un peso de muestra
seca inferior a los 0,2 g (Neill y Horgan, 1985). Las correspondientes fracciones hormonales del extracto vegetal se recogieron y se llevaron a sequedad con corriente de
N2 a 55 ° C.
Los residuos sólidos fueron resuspendidos en 0,5 ml de tampón fosfato (PBS) y 0,1
ml fueron utilizados para la determinación por ELISA de ABAMe y de AIAMe con un kit
de EPHYSCIENCE™ de la casa Mayoly-Spindler.
Citoquininas
Las citoquininas se extrajeron con una solución extractante de composición MeOH:
CH3COOH 0,2 M pH = 3 80:20 (v:v) con 100 mgml–1 BHT (2,6-di-t-butil 4 metil-fenol).
La extracción se realizó a 4 ° C a oscuras durante 16 horas (Smalley et al., 1991) (Fig. 2).
Después de una etapa de centrifugación y filtración, tal y como se ha descrito anteriormente, se evaporó el MeOH con corriente de N2 a 55 ° C. El pH de la solución acuosa
se ajustó a 3 con H2SO4 1N. A continuación se procedió a la extracción de los pigmentos
HORMONAS VEGETALES EN HOJAS DE GERBERA
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0,2 g PS
10 ml Solución Extractante
Centrifugación y Filtración
Evaporación MeOH
Solución acuosa pH 3,0
Extracción Pigmentos con
Acetato Etilo
Evaporación fase orgánica
Redisolución en 200 µl MeOH:H2O
Inyección 50 µl HPLC
Recolección fracción Z + ZR
ELISA
Fig. 2.–Diagrama de flujo del procedimiento de purificación para la determinación ELISA de
Z + ZR en hojas desarrolladas de plantas de Gerbera jamesonii cv Bolus
con 3 ´ 5 ml de acetato de etilo. Se descartó la fase orgánica y se evaporó la fase acuosa a
sequedad con corriente de N2 a 55 ° C.
El residuo sólido fue resuspendido con 0,2 ml de una solución de MeOH: CH3COOH
pH 3 30:70 (v:v). Se tomaron 70 m l, y después de filtrarla con un filtro de nailon similar al
utilizado para la purificación del ABA y del AIA, se inyectaron en el mismo equipo de
HPLC. La elución de la Z y el ZR se realizó utilizando el procedimiento de Stevens and
Berry (1988): caudal 0,4 ml min–1, condiciones iniciales: 30 % MeOH: CH3COOH 0,2 M
pH 3 durante 15 min. A continuación se estableció un gradiente hasta el 100 % de MeOH,
y se mantuvo esta composición del eluente durante 5 min, para permitir la limpieza de impurezas de la columna y del equipo. La composición del eluente fue llevada de nuevo a la
inicial en 2 min, y después de un período de estabilización de 5 min, el equipo estuvo listo
para la purificación de una nueva muestra. El tiempo de elución de las fracciones de Z y
ZR fue establecido con una solución patrón de 5 m g ml–1 de de las dos sustancias. Se obtuvo un rendimiento del 50,7 ± 8,8 %, que está de acuerdo con el obtenido por otros autores
(Sotta et al., 1987). En estas condiciones ambas eluyeron muy próximas, y se recogieron
conjuntamente. La fracción de Z + ZR fue evaporada a sequedad con corriente de N2 a
55 ° C.
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C. OLIVELLA et al.
Utilizando soluciones hormonales patrón intercaladas en series de muestras, se comprobó que los tiempos de elución se mantenían bastante regulares durante la etapa de purificación por HPLC.
Los residuos sólidos fueron resuspendidos en 0,5 ml de PBS y se utilizaron 0,1 ml
para la determinación de citoquininas mediante ELISA utilizando un kit EPHYSCIENCEä
de la casa Mayoly Spindler.
El procedimento ha sido descrito anteriormente (Maldiney et al., 1986) y se realizó
separadamente para cada hormona con algunas pequeñas modificaciones. Se fundamenta
en la competición por la unión al anticuerpo monoclonal de ratón, entre la hormona libre
del extracto vegetal (ABAMe, AIAMe, Z y ZR), y la hormona ligada mediante un brazo
de albúmina a la pared de los pocillos de las placas de ELISA. Para la detección del anticuerpo unido a la hormona ligada se utilizaron anticuerpos de oveja anti-ratón, marcados
con peroxidasa. El revelado se produjo con 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina)-6- ácido
sulfónico (ABTS) y agua oxigenada como sustratos enzimáticos en un tampón de perborato de pH 4,6. La lectura de la absorbancia se hizo a 405 nm. La absorbancia máxima correspondió a los pocillos con blanco, mientras que la mínima era la de los pocillos saturados de solución hormonal. La determinación de la concentración se hizo sobre una recta
de calibrado establecida para cada placa, utilizando una regresión de orden 3 sobre el promedio de tres curvas patrón.
Análisis estadístico
La media y la desviación estándar de cada muestra se obtuvieron sobre 3 réplicas de
cada muestra. Cada réplica era la media de la lectura de la concentración hormonal en 4
pocillos. La relación entre la edad de la hoja y la concentración hormonal se estableció
con el programa estadístico Sigmaplotä v.2.01 de Jandel Scientific. Se utilizó una regresión de orden 1 porque una regresión de mayor orden no mejoraba el ajuste de la correlación.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los dos procedimientos descritos permitieron la determinación de hormonas en hojas
totalmente desarrolladas mediante un sistema ELISA. La etapa de extracción líquido-líquido permitió una primera purificación del extracto vegetal antes de la etapa de HPLC.
Ésta es una de las etapas más problemáticas, ya que el acetato de etilo es parcialmente
miscible en agua, y se produce una emulsión en la interfase que podría retener las hormonas. Es importante establecer un volumen adecuado de disolvente orgánico, para evitar tener pérdidas en esta etapa (Veselov et al., 1992).
Para aumentar el rendimiento, se intentó partir de un peso de muestra seca superior a
0,2 g. Ello nos obligó a incrementar tanto el volumen de los disolventes como el del material volumétrico. La sistemática del procedimiento se volvió más compleja, y se decidió
mantener el peso inicial de 0,2 g.
HORMONAS VEGETALES EN HOJAS DE GERBERA
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Algunos autores han sugerido realizar el secado de la minicolumna antes de la aplicación del disolvente para eluir las hormonas (Dunlap y Guinn 1989). Sin embargo, se consideró que es muy difícil asegurar que la minicolumna quede completamente seca, debido
al origen orgánico de la fase ligada. Así, cuando las hormonas fueran eluidas, el agua retenida en la minicolumna podría eluir con el éter dietílico, dificultando la evaporación a
sequedad del eluyente. Se prefirió eluir las hormonas con éter dietílico recogido sobre
agua, separar la fase orgánica y llevarla a sequedad.
A diferencia de otros autores, en el presente trabajo se decidió metilar el ABA y el
AIA, antes de iniciar la purificación por HPLC, con el objeto de aumentar su estabilidad
(Law y Davies, 1990). Algunas veces no se pudieron procesar de inmediato por HPLC,
y fue necesario conservar los extractos a –20 ° C en las condiciones más estables posibles.
Se intentó introducir una etapa adicional de extracción en fase sólida, después de la
de extracción líquido-líquido en el procedimiento para la purificación de citoquininas
(Kotov y Kotova 2000), pero la relativa miscibilidad del acetato de etilo en agua fue suficiente para impedir la unión de las citoquininas a la fase de C18.
Estos procedimientos han sido utilizados para la determinación de los niveles hormonales en hojas de plantas de gerbera en condiciones de sequía, de encharcamiento y de bajas temperaturas (Savé et al., 1995; Olivella et al., 1998; Olivella et al., 2000).
Los resultados obtenidos mostraron una gran variabilidad en los valores de ABA y de
Z + ZR (Tabla 1). Ello puede ser atribuido parcialmente al procedimiento analítico y parcialmente a la variabilidad de las hojas. Ya hemos comentado cuáles son los factores que
pueden ser los causantes de la variabilidad analítica. Respecto a la variabilidad atribuible
a las propias hojas en plantas en producción, hay que tener en cuenta factores como la
tasa fotosintética (Guinn y Brummett, 1993), el estado hídrico, la disponibilidad de algunos elementos minerales, K, Ca, etc. (Mansfield y Mc Ainsh, 1995).
No obstante, no se encontraron cambios significativos en los niveles de ABA y de
AIA en hojas de diferente edad. Por otra parte, sí aparecieron diferencias significativas en los niveles de Z + ZR entre hojas jóvenes (7 días) por un lado, y hojas adultas
(20 días) y maduras (60 días) por el otro. Estos resultados son consistentes con los obtenidos por Singh et al. (1992) para hojas de tabaco jóvenes, presenescentes y senescentes. Estas variaciones pueden ser debidas a una alta absorción endogénica a través
del flujo xilemático, o a una mayor capacidad biosintética de las hojas jóvenes (Kotov
y Kotova, 2000). Las diferencias son mayores entre las hojas jóvenes y las adultas,
que entre las adultas y las maduras. Podemos concluir que en ciclos experimentales,
con una duración conocida de algunos días y muestreando hojas adultas, las variaciones de Z + ZR encontradas no pudieron ser atribuibles a diferencias en la edad de las
hojas.
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511 ± 120**
504 ± 7
39 ± 11
154 ± 42
9.º
248 ± 51
48 ± 2
152 ± 40
1.º
ns: diferencias no significativas
nd: no determinado
** diferencias significativas en los niveles hormonales (P < 0,05) entre grupos
x ± sd
395 ± 77
Z + ZR
pmols.g–1 P.S.
634 ± 92
47 ± 12 ns
x ± sd
49 ± 16
52 ± 4
AIAnmols.g–1P.S.
238 ± 59
4.º
320 ± 219 ns
568 ± n.d.
1.º
hojas jóvenes
x ± sd
ABA
pmols.g–1P.S.
Días
234 ± 51 ns
177 ± 5
41 ± 8 ns
39 ± 4
192 ± 67 ns
154 ± 38
4.º
hojas adultas
276 ± 4
36 ± 11
69 ± 67
9.º
112 ± 60
43 ± 16
127 ± 71
1.º
169 ± 52 ns
215 ± 43
4 ± 9 ns
48 ± 1
181 ± 63 ns
166 ± 64
4.º
hojas maduras
181 ± 3
43 ± 9
250 ± 35
9.º
Niveles de ABA, AIA y Z + ZR en diferentes grupos de hojas de plantas de Gerbera jamesonii cv Bolus: hojas
jóvenes (7 días), hojas adultas (20 días) y hojas maduras (60 días)
Tabla 1
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C. OLIVELLA et al.
HORMONAS VEGETALES EN HOJAS DE GERBERA
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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la colaboración en las determinaciones analíticas de la Sra. Anna Ma. Puerta, que
disfrutó de una beca de la CIRIT. Este trabajo fue financiado parcialmente por la CEE, dentro del proyecto
EC-DG VI PL-900165.
SUMMARY
Quantification of abscisic acid, indoleacetic acid, zeatin, and zeatin riboside in
developed leaves of different ages in Gerbera jamesonii cv. Bolus
Procedures to quantify plant hormones have been developed for a wide variety of tissues. However, few
methods for measurement in fully developed leaves, which contain pigments and compounds that co-purify with
hormones, have been established. Procedures for measuring abscisic (ABA) and indoleacetic acid (IAA) simultaneously, and zeatin plus zeatin riboside (Z+ZR) in fully developed leaves of Gerbera jamesonii cv. Bolus, are
presented. The methods include an initial liquid-liquid extraction step, a solid phase extraction, a HPLC purification, and a measurement using ELISA. This scheme is similar to others proposed for measurement of plant
hormones in fully developed leaves using gas chromatography/mass spectrometry. The results showed no significant changes in ABA and IAA concentrations with leaf age. In contrast, for Z+ZR concentrations there were
differences between young (7 days old) and adult leaves (21 days), but not between adult and old leaves (60
days).
KEY WORDS:
ABA
IAA
Z+ZR
Leaves
HPLC
ELISA
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