PLATELIA® TOXO IgM TMB 96 PRUEBAS 72751 KIT PARA LA DETECCIÓN CUALITATIVA DE LAS IgM ANTI-TOXOPLASMA GONDII EN EL SUERO O PLASMA HÚMANO POR LA TÉCNICA INMUNOENZIMÁTICA IVD Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad se hallan bajo un sistema de garantía de calidad desde la recepción de las materias primas hasta la comercialización de los productos finales. Cada lote de producto final se somete a un control de calidad y sólo se comercializa si está en conformidad con los criterios de aceptación. El fabricante conserva la documentación referente a la producción y al control de cada lote. ÍNDICE 1- OBJETIVO DE LA VALORACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43 2- INTERES CLINICO 3- PRINCIPIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44 4- COMPOSICION DEL KIT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 5- PRECAUCIONES, HIGIENE Y SEGURIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46 6- MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO . . . . . . . . . . . . . .48 7- RECONSTITUCION DE LOS REACTIVOS, VALIDEZ Y CONSERVACIÓN . .48 8- MUESTRAS 9- PROCEDIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 10- ADAPTACIONES A LOS SISTEMAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52 11- CÁLCULOS E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . .53 12- ESPECIFICACIONES Y LIMITES DE LA PRUEBA . . . . . . . . . . . . . . . . . .55 13- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 42 1- OBJETIVO DE LA VALORACIÓN PLATELIA® TOXO IgM TMB es un kit de diagnóstico in-vitro que permite la detección cualitativa de las IgM séricas dirigidas contra Toxoplasma gondii (T. gondii). 2- INTERÉS CLÍNICO T. gondii es un protozoario capaz de infectar a numerosas especies de mamíferos y pájaros. Estas infecciones, habituales en el hombre y en los animales, se desarrollan generalmente de forma inapreciable desde el punto de vista clínico. La prevalencia de esta infección en la población, detectada por la presencia de anticuerpos específicos en el suero, varía en función de la región y de la edad. En caso de una primoinfección de la madre durante el embarazo, esta infección puede provocar graves secuelas en el feto (en especial, una alteración de las funciones cerebrales) e incluso un aborto. La inmunidad antigua de la madre, demostrada mediante la presencia de anticuerpos IgG al inicio del embarazo, protege al feto de la infección por este parásito. La segunda población sensible a esta infección está representada por los pacientes inmunodeprimidos, como los enfermos afectados de SIDA. Estas infecciones se deben, casi exclusivamente, a una infección a partir de un foco parasitario (quiste) quiescente del paciente, cuya existencia es previa a la infección por el virus HIV. El diagnóstico de la infección toxoplásmica se confirma con la demostración de la presencia del parásito, pero su búsqueda mediante el examen directo es difícil, por no decir aleatorio. La serología representa la base del diagnóstico y del seguimiento de la toxoplasmosis. La presencia de anticuerpos específicos permite confirmar una contaminación por T. gondii; el estudio combinado de los anticuerpos pertenecientes a diferentes isotipos permite, generalmente, fechar la infección y orientar la terapéutica en caso de infección reciente, o establecer medidas profilácticas adecuadas al riesgo de aparición de una toxoplasmosis: medidas higiénico-dietéticas en mujeres embarazadas que no presenten anticuerpos, quimiofilaxia en los sujetos inmunodeprimidos seropositivos para T. gondii. 43 3- PRINCIPIO El principio de esta prueba es una valoración inmunoenzimática en doble “sandwich” con captura de los anticuerpos IgM séricos en la fase sólida (microplaca recubierta de anticuerpo anti-cadena µ humana).El anticuerpo monoclonal anti-T. gondii marcado con peroxidasa utilizado en esta prueba es específico de una importante proteína de la superficie de los taquizoítos. Esta proteína, de PM 30.000, es uno de los blancos favoritos de la respuesta inmunitaria humoral. 1ª etapa Los sueros control negativo, valor umbral, control positivo y muestras a ensayar se diluyen a 1/101 y se dispensan en los pocillos de la microplaca. Durante esta incubación, 1 hora a 37°C, las IgM presentes en la muestra son captadas por la fase sólida. Las IgG y las otras proteínas del suero se eliminan con los lavados que se realizan al final de la incubación. 2ª etapa Una mezcla de antígeno toxoplásmico (Ag T. gondii) y de anticuerpo monoclonal anti-T. gondii marcado con peroxidasa (ACM-POD) se deposita en todos los pocillos de la microplaca. Durante esta segunda incubación, 1 hora a 37°C, si la muestra ensayada contiene IgM anti-T. gondii, estas IgM captadas por la fase sólida fijan el complejo (Ag T. gondii-ACM-POD). El Ag T. gondii y el ACM-POD no fijados o en exceso se eliminan con los lavados que se realizan al final de la incubación. 3ª etapa La presencia del complejo inmune (fase sólida anti IgM, IgM anti-T. gondii, Ag T.gondii, ACM-POD), se revela con la adición, en cada pocillo, de una solución de revelado enzimático. 4ª etapa Tras media hora de incubación a temperatura ambiente (18-30°C), la reacción enzimática se detiene con la adición de ácido sulfúrico 1N. La densidad óptica obtenida a 450/620 nm es proporcional a la cantidad de IgM anti-T. gondii. La lectura de los resultados en densidad óptica respecto a un valor umbral permite confirmar o rechazar la presencia de anticuerpos de clase IgM anti-T. gondii. 44 4- COMPOSICIÓN DEL KIT Todos los reactivos están destinados para uso exclusivo de diagnóstico in vitro. Etiquetado R1 Microplate NATURALEZA DE LOS REACTIVOS Microplaca : 12 tiras de 8 pocillos divisibles sensibilizados con los anticuerpos anti-cadena µ humana. Presentación 1 placa R2 Concentrated Solución de lavado concentrada (10x) : Tampón TRIS Washing NaCl pH 7,4, 1% Tween® 20. Concentrado 10 veces. Solution Conservante : 0,01% Thimerosal. 1 frasco 100 ml R3 Negative Control Control no reactivo : Tampón TRIS-NaCl (pH 8 ± 0,2), glicerol, albúmina bovina, E 102 y E 122. Conservante : < 0,5% Proclin®. 1 frasco 1ml R4a Cut-off Control Control Valor Umbral : Suero humano débilmente IgM reactivo frente a los Ag de T. gondii y negativo en Ag HBs y en anticuerpos anti-HIV1, anti-HIV2 y anti-HCV. Conservante: < 0,01% Timerosal 1 frasco 1 ml R4b Positive Control Control positivo : Tampón TRIS-NaCl (pH 8 ± 0,2), suero humano IgM reactivo frente a los Ag de T. gondii y negativo en antígeno HBs y en anticuerpos anti-HIV1, anti-HIV2 y anti-HCV, albúmina bovina, glicerol, E 102 y E 122 Conservante: < 0,01% Timerosal y < 0,5% Proclin® 1 frasco 1 ml R6a Antigen Antígeno T. gondii : Antígeno T. gondii en forma liofilizada. 2 frascos qs. 7 ml R6b Conjugate (50x) Conjugado : Anticuerpo monoclonal de origen múrido anti- T. gondii (P30) marcado con peroxidasa; se presenta en forma líquida concentrada 50 veces. 1 flacon 0,4 ml R7 Diluent Diluyente para muestras y conjugado, listo para usar : TRIS-NaCl (pH 7,7 ± 0,15), albúmina bovina, 0,1% de Tween® 20 y rojo fenol. Conservante: < 0,01 % Timerosal 2 frascos 80 ml R8 TMB Substrate Buffer Tampón sustrato : Solución de ácido cítrico y de acetato de sodio pH 4,0 que contiene 0,015% de H2O2 y 4% de DMSO. 1 frasco 60 ml R9 Chromogen: Cromógeno : TMB Solution Solución que contiene tetrametil benzidina (TMB) R10 Stopping Solution Solución de parada : Solución de ácido sulfúrico 1N Hojas adhesiva 1 frasco 5 ml 1 frasco 28 ml 4 45 5- PRECAUCIONES, HIGIENE Y SEGURIDAD 46 Precauciones La calidad de los resultados depende del respecto de las buenas prácticas de laboratorio siguientes: • No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad. • No mezclar en uno mismo ensayo reactivos que procedan de kits con números de lote diferentes. NOTA : se pueden utilizar otros lotes de solución de lavado (R2, identificada 10 x en azul sobre la etiqueta), de tampón sustrato (R8, identificado TMB buf. en azul), de cromógeno (R9, identificado TMB sol. en verde) y de solución de parada (R10, identificada 1N en rojo), diferentes a los suministrados en el kit siempre y cuando se utilice un mismo y único lote durante todo el ensayo. Estos reactivos también pueden utilizarse con otros productos de nuestro laboratorio; contacte con nuestros servicios técnicos para una información más detallada. • Antes de la utilización, esperar 30 minutos para que los reactivos se estabilicen a temperatura ambiente. • Reconstituir cuidadosamente los reactivos evitando toda contaminación. • No realizar la prueba en presencia de reactivos que produzcan vapores (ácidos, alcalinos, aldehídos) o polvos que puedan alterar la actividad enzimática del conjugado. • Utilizar preferentemente material de uso único. En su defecto, utilizar una cristalería perfectamente lavada y enjuagada con agua destilada. • No dejar secar la microplaca entre el final del lavado y la distribución de los reactivos. • La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o iones metálicos. Por tanto, ningún elemento metálico debe entrar en contacto con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o el sustrato. • La solución de revelado (tampón sustrato + cromógeno) debe ser incolora. La aparición de una coloración azul en los minutos siguientes a la reconstitución indica que el reactivo es inutilizable y se debe sustituir. Para esta preparación, utilizar preferentemente recipientes y material de distribución de plástico de uso único o una cristalería previamente lavada con ácido clorhídrico 1N y perfectamente enjuagada con agua destilada y secada. Conservar esta preparación protegida de la luz. • Utilizar una punta de pipeta desechable para cada suero. • El lavado de los pocillos es una etapa esencial de la manipulación: respetar el número de ciclos de lavado prescrito y comprobar que todos los pocillos están completamente llenos, y después completamente vacíos. Un mal lavado puede producir resultados incorrectos. • No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la solución de revelado. • Comprobar la exactitud de las pipetas, así como el correcto funcionamiento de los aparatos utilizados. • No modificar el procedimiento. Recomendaciones de higiene y seguridad Todos los reactivos están destinados para uso exclusivo de diagnóstico in vitro. • Utilizar guantes de un solo uso durante la manipulación de los reactivos. • No pipetear con la boca. • El material de origen humano utilizado en la preparación de los reactivos ha sido probado y encontrado no reactivo en antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (Ag HBs), en anticuerpos dirigidos contra el virus de la hepatitis C (anti-HCV) y en anticuerpos dirigidos contra el virus de inmunodeficiencia humana (anti-HIV1 y anti-HIV2). Ningún método puede garantizar de forma absoluta la ausencia de agentes infecciosos. Por tanto, los reactivos de origen humano, al igual que las muestras de los pacientes, deben ser considerados y manipulados como productos potencialmente infecciosos y respetando las precauciones de uso. • Considerar el material directamente en contacto con las muestras, los reactivos de origen humano y las soluciones de lavado, como productos contaminados. • Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan. • Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido, neutralizar previamente las superficies manchadas con bicarbonato de sosa, y después limpiar con lejía y secar con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá ser desechado en un contenedor especial para residuos contaminados. • Eliminar las muestras y los reactivos de origen humano, así como el material y los productos contaminados después de su descontaminación : - ya sea sumergiéndolos en lejía con una concentración final del 5% de hipoclorito de sodio durante 30 minutos, - o bien por calentamiento en autoclave a 121°C durante 2 horas como mínimo. El autoclave a 121°C durante 1 hora como mínimo es el mejor método para inactivar los virus VIH y el virus de la hepatitis B. 47 ATENCIÓN: NO INTRODUCIR EN EL AUTOCLAVE SOLUCIONES QUE CONTENGAN HIPOCLORITO DE SODIO. • ATENCIÓN : ciertos reactivos contienen * ProclinTM 300 < 0,5% : PRODUCTO IRRITANTE R43: Posibilidad de sensibilizaciÛn en contacto con la piel. S28-37 : En caso de contacto con la piel, l·vese inmediata y Xi-irritante abundantemente con agua y jabón. Sense guantes adecuados. • La manipulación y la eliminación de los productos químicos deben efectuarse según las buenas prácticas de laboratorio. • Evitar todo contacto del tampón sustrato, del cromógeno o de la solución de parada con la piel y las mucosas (riesgo de toxicidad, irritación y quemaduras). La ficha de datos de seguridad está disponible bajo petición. 6- MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO • • • • • • • • • • • Agitador tipo vortex. Aparato de lectura* para microplacas (equipado con filtros 490/620nm). Baño maría o incubador seco* con termostato a 37°C ± 1°C. Contenedor para residuos contaminados. Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio. Agua destilada. Probetas graduadas de 25, 50, 100 y 1.000 ml. Guantes de un solo uso. Gafas de protección. Papel absorbente. Pipetas, multipipetas, automáticas o semiautomáticas, regulables o fijas, para distribuir de 10 a 1000 µL y 1, 2 y 10 ml. • Sistema de lavado automático*, semiautomático* o manual para microplacas. • Tubos de un solo uso. (*) Consúltenos para una información detallada sobre los aparatos validados por nuestros servicios técnicos. 7- RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS, VALIDEZ Y CONSERVACIÓN Conservar el kit a +2-8°C. Antes de abrirlo, cada elemento del kit conservado a +2-8°C puede utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada en la caja. 48 Nota : antes de utilizar, dejar que los reactivos se estabilicen a temperatura ambiente (+18-30°C). 1) Reactivos listos para usar • Reactivo 1 (R1) : microplaca Cada soporte marco que contiene 12 tiras de 8 pocillos divisibles está acondicionado en una bolsa ZIP. Abrir la bolsa con unas tijeras o un escalpelo de 0,5 a 1 cm por encima del ZIP. Sacar el marco y volver a introducir inmediatamente en la bolsa las tiras no utilizadas. Cerrar la bolsa cuidadosamente y volver a guardarla a +2-8°C. Las tiras así conservadas son estables durante 1 mes. • Reactivo 3 (R3), reactivo 4a (R4a), reactivo 4b (R4b), reactivo 10 (R10) : Estos reactivos conservados a +2-8°C son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta (incluso una vez abiertos). 2) Reactivos para reconstituir • Reactivo 2 (R2): Solución de lavado concentrada 10 veces Diluir 10 veces la solución en agua destilada (100 ml de R2 en 900 ml agua destilada) para obtener la solución de lavado lista para usar. Preparar unos 350 ml para una placa de 12 tiras con lavado manual. Tras la dilución, la solución de lavado se conserva 2 semanas a +2-8°C. La solución de lavado concentrada puede conservarse a +2-25°C. • Reactivo 6a (R6a): Antígeno T. gondii El antígeno en forma liofilizada se debe rehidratar antes de usar con 7 ml de solución de dilución (R7). Una vez diluida, la solución antigénica (R6a diluida) debe ser totalmente límpida (6 tiras por frasco). ATENCIÓN : : La aparición de una turbidez importante indica que el reactivo es inutilizable y se debe sustituir. El antígeno T. gondii R6a diluido debe utilizarse en los 30 minutos siguientes a su reconstitución. Si sólo se utiliza una parte de la microplaca, la solución de Ag T. gondii R6a diluida debe almacenarse inmediatamente a - 20°C en alícuotas de 1,1 ml por tira (el antígeno sólo puede descongelarse una vez). De esta forma, el antígeno puede conservarse 3 meses a - 20°C. • Reactivo 6b (R6b): Conjugado concentrado El anticuerpo monoclonal se presenta en forma líquida, concentrado 50 veces. Para una microplaca, diluir extemporáneamente 0,3 ml del conjugado (R6b) en 15 ml de solución de dilución (R7). Homogeneizar bien. El conjugado 49 (R6b) diluido debe utilizarse en los 30 minutos siguientes a su reconstitución (dividir los volúmenes por 10 para una tira). • Solución de trabajo del conjugado: reactivo 6a diluido (R6a) + reactivo 6b diluido (R6b) Para una microplaca entera, añadir extemporáneamente 12 ml de conjugado diluido (R6b diluido) y 12 ml de antígeno T. gondii tras la reconstitución (R6a diluido) (los 2 frascos). Dividir los volúmenes por 12 para una tira. La solución de trabajo del conjugado debe utilizarse en las 4 horas siguientes a su reconstitución. • Solución de revelado enzimático: reactivo 8 (R8) + reactivo 9 (R9) Diluir 11 veces la solución de cromógeno (R9) en el tampón sustrato (R8) (ej: 1 ml de reactivo R9 + 10 ml de reactivo R8). Tras la dilución, los reactivos son estables 6 horas si se conservan en oscuridad a temperatura ambiente (+18-30°C). 8- MUESTRAS 1. Las pruebas se efectúan sobre muestras de suero o de plasma (obtenidas con anticoagulantes como EDTA, heparina y citrato) 2. Respetar las siguientes pautas para la extracción, tratamiento y conservación de estas muestras: • Extraer una muestra de sangre según las prácticas habituales. • Para los sueros, dejar que el coágulo se forme completamente antes de centrifugar. • Conservar los tubos cerrados. • Tras la centrifugación, separar el suero o el plasma del coágulo o de los hematíes y conservarlo en tubo cerrado. • Las muestras podrán conservarse a +2-8°C cuando la prueba se realice en los 7 días siguientes. • Para una duración de almacenamiento superior o en el caso de envíos, las muestras se congelarán a -20°C (o a una temperatura menor). • No congelar / descongelar las muestras más de tres veces. • Antes de efectuar la prueba, homogeneizar (vortex) cuidadosamente las muestras tras su descongelación. 3. Los resultados no se ven afectados en las muestras que contienen hasta 90 g/l de albúmina o 100 mg/l de bilirrubina, así como en las muestras lipémicas que contienen el equivalente a 36 g/l de trioleína 50 (triglicérido) o en las muestras hemolizadas que contienen hasta 10 g/l de hemoglobina. 4. No calentar las muestras. 9- PROCEDIMIENTO Seguir estrictamente el protocolo propuesto. Utilizar los estándares en cada preparación de la prueba para validar la calidad de esta última. Aplicar las buenas prácticas de laboratorio. 1. Establecer cuidadosamente el plan de distribución e identificación de las muestras. 2. Preparar la solución de lavado diluida (R2) (ver apartado 7). 3. Sacar el marco soporte y las tiras (R1) del embalaje protector. 4. Lavar una vez todos los pocillos de la microplaca con la solución R2 diluida. Secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente. 5. Diluir las muestras a ensayar y los estándares a 1/101: 10 µl de suero + 1 ml de diluyente R7. Homogeneizar bien (vortex) 6. Para la realización manual de la prueba, distribuir los estándares y las muestras diluidas según el siguiente esquema: - Pocillo A1: 200 µl de control no reactivo (R3) - Pocillo B1: 200 µl de control Valor-Umbral (R4a) - Pocillo C1: 200 µl de control Valor-Umbral (R4a) - Pocillo D1: 200 µl de control positivo (R4b) - Pocillos E1, F1, G1, H1: 200 µl de muestras diluidas. 7. Cuando sea posible, cubrir la microplaca con una película autoadhesiva apretando bien toda la superficie para garantizar la estanqueidad. Incubar la microplaca en el baño maría con termostato o en un incubador seco de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37 ± 1°C. 8. Antes de que finalice la primera incubación, preparar las soluciones de antígeno T. gondii (R6a) diluida y de conjugado (R6b) diluida necesarias para la reacción, y a continuación la solución de trabajo del conjugado, reactivo 6a diluido (R6ad) + reactivo 6b diluido (R6bd); para una microplaca completa, 12 ml de conjugado diluido a 1/50 (R6b diluido y 12 ml de antígeno T. gondii (R6a) diluido (los 2 frascos). Dividir los valores entre 12 para una tira. Homogeneizar bien (ver apartado 7). 51 9. Al finalizar la primera incubación, retirar la película adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para residuos contaminados (que contenga hipoclorito de sodio) y realizar 3 lavados. Secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente. Si se utiliza un lavador automático, respetar el mismo ciclo operativo (ver apartado 10). 10.Distribuir 200 µl de la solución de trabajo de conjugado en todos los pocillos. Agitar esta solución antes de usar. 11.Cuando sea posible, cubrir con una película autoadhesiva nueva e incubar la microplaca en el baño maría con termostato o en un incubador seco de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37 ± 1°C. 12. Al finalizar la segunda incubación, retirar la película adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para residuos contaminados y realizar 4 lavados. Secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente. Si se utiliza un lavador automático, respetar el mismo ciclo operativo. 13.Distribuir rápidamente en todos los pocillos 200 µl de la solución de revelado enzimático (R8 + R9) previamente preparada. Dejar que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 30°C). Durante esta incubación, no utilizar película adhesiva. 14.Añadir 100 µl de solución de parada (R10) manteniendo la misma secuencia y el mismo ritmo de distribución que para la solución de revelado. 15.Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Leer la densidad óptica a 450/620 nm con un lector de placas en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. Las tiras siempre deben conservarse protegidas de la luz antes de la lectura. 16.Antes de transcribir los resultados, comprobar la concordancia entre la lectura y el plan de distribución y de identificación de las placas y de las muestras. 10- ADAPTACIONES A LOS SISTEMAS • Lavado : Siga estrictamente los procedimientos de lavado descritos para obtener el máximo rendimiento de la prueba. - Procedimiento de lavado con LP35 : Tras encender el LP35, validar la opción parámetro lavado. Elegir un número de ensayo entre 1 y 20, y validar. Elegir el procedimiento de 52 base 086 y, a continuación, el modo placa. Una vez efectuados los ajustes, el lavador vuelve al modo lavado. - Otros instrumentos de lavado : póngase en contacto con nuestra empresa para obtener información sobre las adaptaciones y los procedimientos especiales. • Lectura : el conjunto de cálculos, validación del ensayo e interpretación del resultado para cada muestra en función de la densidad óptica se realiza automáticamente con los espectrofotómetros lectores de microplacas equipados con filtros de 450 y 620 nm que comercializamos. • Otros instrumentos : Póngase en contacto con nuestra empresa para obtener información sobre las adaptaciones y los procedimientos especiales. 11- CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 1) Validación del ensayo Análisis de los resultados obtenidos con los controles en cada microplaca para cada ensayo. Para validar la manipulación, deben respetarse los siguientes criterios: • Valores de las densidades ópticas : - DO R3 ≤ 0,100 - DO R4b ≥ 1,000 • Relaciones : - DO R4a / DO R3 ≥ 3 - DO R4b / DO R4a ≥ 1,8 Si estas especificaciones no se cumplen, repetir la manipulación desde el principio. 2) Cálculos de la densidad óptica valor umbral, de la relación y del índice de fijación de la muestra • La densidad óptica valor-umbral DOMR4a corresponde a la media de las densidades ópticas del suero valor umbral R4a. • Le resultado también puede expresarse utilizando la siguiente relación: - Relación-Muestra = DO Muestra / DOMR4a • Si la densidad óptica de la muestra es superior a la densidad óptica valor umbral DOMR4a, el resultado también se puede expresar como índice de fijación: - Índice de fijación del suero = . (DO muestra - DOMR4a)/(DO R4b - DOMR4a)*10 53 3) Interpretación de los resultados Respecto a la densidad óptica Valor-Umbral En relación muestra D.O. muestra < DOMR4a x 0,80 Relac. muestra < 0,8 D.O. muestra ≥ DOMR4a x 0,80 D.O. muestra < DOMR4a Relac. Muestra ≥ 0,8 Relac. muestra < 1 D.O. muestra ≥ DOMR4a Relac. Muestra ≥ 1 Resultado Suero negativo Suero dudoso Suero positivo Interpretación / Recomendaciones No hay primoinfección por T. gondii probable Resultados a confirmar: - con un nuevo ensayo unos 10 – 20 días después del 1º control - con el estudio cuantitativo de las IgG Resultados a confirmar : - con un nuevo ensayo unos 10 – 20 días después del 1º control - con el estudio cuantitativo de las IgG El índice de fijación permite un enfoque semicuantitativo de los resultados procedentes de 2 sueros del mismo paciente. Un índice de fijación que se encuentre entre 0 y 1 corresponde a un suero positivo límite. • Límites del procedimiento : El diagnóstico de una infección reciente por el parásito se basa en un conjunto de datos clínicos y biológicos, por lo que el resultado de una única valoración no constituye una prueba suficiente para el diagnóstico de una infección reciente. Sólo el conjunto de datos clínicos y serológicos (aumento significativo del título de las IgG anti-T. gondii procedentes de 2 sueros del mismo paciente obtenidos con un intervalo mínimo de 3 semanas y ensayados durante una misma valoración (kit Platelia® Toxo IgG TMB) y presencia de IgM anti-T. gondii con un valor significativo) permite el diagnóstico de una infección reciente por el parásito. • La sola presencia de IgM anti-T.gondii no permite confirmar una infección reciente en evolución, puesto que estas IgM pueden persistir durante muchos meses, e incluso años, tras la infección. La presencia de IgM obliga, por una parte, a realizar el estudio cuantitativo de las IgG anti-T. gondii y, por otra, seguir la evolución de la respuesta de los anticuerpos anti-T. gondii de un paciente al menos con una segunda toma de muestra realizada 10 - 20 días después. • Si la obtención de la muestra se realiza demasiado pronto durante una primoinfección debutante, puede que no se encuentren anticuerpos IgM anti-T. gondii. En caso de duda, debe efectuarse una nueva toma 15 días más tarde y deberá repetirse la búsqueda de las IgM. 54 4) Causas de error El origen de las reacciones no validadas o no reproducibles, con frecuencia se encuentra relacionado con las siguientes causas: • Lavado insuficiente de las microplacas. • Contaminación de las muestras negativas con un suero o un plasma que contenga un título alto de anticuerpos. • Contaminación puntual de la solución de revelado por agentes químicos oxidantes (lejía, iones metálicos...) • Contaminación puntual de la solución de parada. 5) Ejemplos de resultados obtenidos con PLATELIA® TOXO IgM TMB Nota : : Los datos siguientes sólo se incluyen como ejemplo y no deben utilizarse en vez de los obtenidos por el usuario. • Tabla de resultados Sueros y controles R3 R4a R4a R4b Suero n° 1 Suero n° 2 Suero n° 3 DO medida a 450 nm - 620 nm 0,028 0,691 0,700 1,494 0,109 1,096 2,096 Relación Índice de fijación de la muestra de la muestra 0,15 1,57 3,01 5,0 17,5 Resultado Negativo Positivo Positivo • Validación del ensayo obtenido : - Valor de las densidades ópticas : . DO R3 ≤ 0,100 . DO R4b ≥ 1,000 - Relaciones : . DO R4a / DO R3 ≥ 3 . DO R4b / DO R4a ≥ 1,8 • Cálculo de la DO valor-umbral : . DOMR4a = 12- ESPECIFICACIONES Y LÍMITES DE LA PRUEBA Los estudios se han realizado con muestras obtenidas en tubos secos, tubos con suero separador (SST) o con activador de coagulación, o en plasmas obtenidos con anticoagulantes (EDTA, Heparina, Citrato). 55 1. Especificaciones Las especificaciones de Platelia® Toxo IgM TMB, resumidas a continuación, se han establecido en 2 centros diferentes utilizando las muestras de suero recién obtenido procedentes de mujeres embarazadas o de pacientes inmunodeprimidos, así como muestras de sueros congeladas negativas y positivas. • Estudios comparativos Los estudios se han realizado comparando Platelia® Toxo IgM TMB con otra prueba EIA comercializada. Se determinó la concordancia relativa, la especificidad relativa y la sensibilidad relativa en los sueros recién obtenidos, contabilizándose las muestras dudosas como positivas. Platelia® Toxo IgM TMB Resultado Negativo Dudoso Positivo Otra prueba EIA Negativo 556 1 8 Dudoso 2 1 5 Positivo 4 0 30 Total 562 2 43 Especificidad relativa Sensibilidad relativa Concordancia relativa Dudoso Total 565 8 34 607 Resultados del estudio prospectivo 557/562 99,1% (97,8 – 99,7) 41/45 91,1% (77,9 – 97,1) 587/607 96,7% (95,28 – 98,13) 2/607 0,33% • Estudios de especificidad La especificidad de la prueba Platelia® Toxo IgM TMB se evaluó en 2 centros independientes. La prueba Toxo IgM ELISA utilizada para la caracterización previa de las muestras está comercializada. Se utiliza una prueba de aglutinación como 3ª técnica para resolver los resultados discordantes, contabilizándose las muestras dudosas como positivas. Los resultados de especificidad son: - centro 1 : 100% (263/263) - centro 2 : 100% (557/557) Total : 100% (820/820) 56 • Estudios de sensibilidad : La sensibilidad de la prueba Platelia® Toxo IgM TMB se evaluó en 2 centros independientes. La prueba Toxo IgM ELISA utilizada para la caracterización previa de las muestras está comercializada. Se utiliza una prueba de aglutinación como 3ª técnica para resolver resultados discordantes. Las muestras dudosas se contabilizan como positivas. Los resultados de sensibilidad son: - centro 1 : 100 % (80/80) - centro 2 : 100% (100/100) Total : 100% (180/180) Los paneles de seroconversiones o de seguimiento de infección correspondientes a: • 97 muestras (centro 1) • 48 muestras de 14 pacientes (centro 2) se han ensayado con Platelia® Toxo IgM TMB. La sensibilidad es del 100% en esta población. • Prevalencia La prevalencia de respuesta positiva para los anticuerpos específicos de tipo IgM contra T. gondii (7,4%) se determinó en 607 sueros recién obtenidos procedentes de una población de mujeres embarazadas y de inmunodeprimidos. HISTOGRAMA DE REPARTICIÓN Estudio prospectivo con 607 sueros 600 487 Frecuencia 500 Platelia® Toxo IgM TMB Test EIA 363 400 300 171 200 100 48 0 [ ,1 [0 -0 ,1 [0 -0 [ ,2 ,2 [0 4 4 13 19 -0 [ ,3 ,3 [0 -0 [ ,4 ,4 [0 6 6 [ ,5 -0 ,5 [0 1 3 2 8 [ ,8 -0 ,8 [0 [ ,7 -0 ,7 [0 1 3 [ ,8 -0 2 7 05 [ [ ,9 ,8 [0 -0 ,9 [0 -1 43 18 > 1 Relación Suero /Cut Off 57 2. Precisión • Repetibilidad intra-ensayo : Se ensayan 3 muestras positivas y 1 negativa 30 veces en la misma serie. Los coeficientes de variación obtenidos en los sueros positivos son inferiores a 2%. Muestra Media DS CV % Negativa 0,06 0,01 11,23 Positiva 1 1,17 0,02 1,51 Positiva 2 1,81 0,03 1,74 Positiva 3 2,92 0,03 1,15 • Reproducibilidad inter-ensayos : Se ensayan 3 muestras positivas y 1 negativa por triplicado, 5 días diferentes por 2 técnicos distintos. Los coeficientes de variación obtenidos en los sueros positivos son inferiores a 3%. Muestra Media DS CV % Negativa 0,06 0,01 10,92 Positiva 1 1,19 0,027 2,28 Positiva 2 1,83 0,05 2,98 Positiva 3 2,96 0,08 2,78 3. Reactividad cruzada 239 muestras positivas para marcadores susceptibles de provocar reacciones cruzadas : Muestra / Marcador HIV EBV IgM EBV IgG HSV IgM HSV IgG VZV IgG VZV IgM Sarampión IgM Sarampión IgG Paperas IgM Paperas IgG Rubéola IgM Rubéola IgG CMV IgM CMV IgG Factores reumatoides HAMA Auto-anticuerpos (ANA) Mieloma Total 58 Número 63 9 10 10 10 10 10 10 10 8 10 5 5 5 5 37 2 10 10 239 Muestras Reactivas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1- REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups. Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, 271-275 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L’AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L.SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.AIDS 1996; 10, 1521-1527 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906 10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. 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Distribuir los controles y las muestras diluidas a 1/101 en los pocillos de la siguiente forma: A B C D E F G H 1 2 R3 R4a R4a R4b E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 7. Incubar durante 1 hora a 37°C. 8. Preparar las soluciones de antígeno T. gondii diluida (R6a) y de conjugado diluido (R6b), y a continuación la solución de trabajo del conjugado, reactivo 6a diluido (R6ad) + reactivo 6b diluido (R6bd). 9. Aspirar y lavar 3 veces con la solución de lavado diluida (R2d). 10.Distribuir 200 µl de solución de conjugado (R6ad+R6bd) en todos los pocillos. 11.Incubar durante 1 hora a 37°C. 12.Aspirar y lavar 4 veces con la solución de lavado diluida (R2d). 13.Distribuir 200 µl de solución de revelado (R8+R9) en todos los pocillos. 14.Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (+18-30°C) protegido de la luz. 15.Distribuir 100 µl de solución de parada (R10) en todos los pocillos. 16.Leer las absorbancias en el espectrofotómetro a 450/620 nm. 60 - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Pour diagnostic in vitro - Para diagnóstico in vitro - In vitro-Diagnostikum - Per uso diagnostico in vitro - Para uso em diagnóstico in vitro - In vitro diagnostik - In vitro diagnose - Manufacturer - Fabricant - Fabricante - Hersteller - Produttore - Fabricante - Tillverkad av - Fremstillet af LOT EC REP - Batch code - Code du lot - Código de lote - Chargen-Bezeichnung - Codice del lotto - Código do lote - Batch nr. - Batchkoden - Storage temperature limitation - Limites de températures de stockage - Temperatura limite - Lagerungstemperatur - Limiti di temperatura di conservazione - Limites de temperatura de armazenamento - Temperaturbegränsning - Temperaturbegrænsning 162 REF - Catalogue number - Référence catalogue - Número de catálogo - Bestellnummer - Numero di catalogo - Número de catálogo - Katalognummer - Katalognummer - Authorised Representative - Représentant agréé - Representante autorizado - Bevollmächtigter - Distributore autorizzato - Representante Autorizado - Auktoriserad representant - Autoriseret repræsentant - Expiry date YYYY/MM/DD - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Estable hasta AAAA/MM/DD - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Data de expiração AAAA/MM/DD - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD i - Consult Instruction for use - Consulter le mode d'emploi - Consulte la instrucción para el uso - Siehe Gebrauchsanweisung - Consultare le istruzioni per uso - Consulte o folheto informativo - Se instruktionsanvisning vid användning - Se instruktion før brug The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. 163