Cinética y Control de Sistemas Multienzimáticos

Cinética y Control de
Sistemas Multienzimáticos
Luis Acerenza
Laboratorio de Biología de Sistemas
Facultad de Ciencias
Universidad de la República
Montevideo, Uruguay
aceren@fcien.edu.uy
Cinética de las enzimas aisladas
Descripción cinética tradicional
• Leyes de velocidad ........ (v)
Modelo de Michaelis-Menten irreversible
Reacción:
Mecanismo:
Ley de velocidad:
S
E

→ P
S+E←
→ C 
→ P + E
v = Vmax
S
KM + S
Caso I: v = velocidad inicial, S = Stotal (in vitro)
Caso II: v = velocidad instantánea, S = Slibre (in situ)
Modelo de Hill irreversible
Reacción:
Ley de velocidad:
S
E

→
P
v = Vmax
Sn
n
n
K 0.5 + S
Relevante como ecuación empírica de ajuste de datos
sobre cinéticas cooperativos
Modelo de Michaelis-Menten reversible
Reacción:
Mecanismo:
Ley de velocidad:
S
E
←→
P
S+E←
→ C ←
→ P + E
v=
(VS
K S ) (S − P K eq )
1 + S KS + P KP
Modelo mínimo para describir cinéticas in situ
(v = velocidad instantánea, S = Slibre , P=Plibre)
Cinética de sistemas bienzimáticos
Sistema bienzimático
X
E1
→ S
Sustrato
Producto
• Parámetros (p): X, S, E1.
• Variable: v1.
X
E2
→
Y
S
Sustrato
Producto
• Parámetros (p): S, Y, E2.
• Variable: v2.
E1
→ S
E2
→ Y
• Parámetros (p): X, Y, E1, E2.
• Variables: S, J.
Cursos temporales (análisis numérico)
v1 =
(VS1
K S 1 ) (X − S K eq1 )
1 + X K S 1 + S K P1
v2 =
Software: COPASI
(VS 2
K S 2 ) (S − Y K eq 2 )
1 + S K S 2 + Y K P2
Cursos temporales (análisis simbólico)
v1 = v1 ( X , S , E1 )
v1 =
(VS1
K S1 ) (X − S K eq1 )
1 + X K S 1 + S K P1
v 2 = v 2 (S ,Y , E 2 )
v2 =
(VS 2
K S 2 ) (S − Y K eq 2 )
1 + S K S 2 + Y K P2
v1 = (VS 1 K S 1 ) (X − S K eq1 )
v2 = (VS 2 K S 2 ) (S − Y K eq 2 )
v1 = V1 (X − S K eq1 )
v 2 = V2 (S − Y K eq 2 )
Ecuación diferencial
dS
= v1 ( X , S , E1 ) − v 2 (S ,Y , E 2 )
dt
v1 = V1 (X − S K eq1 )
v 2 = V2 (S − Y K eq 2 )
dS
= −α S + β
dt
V1
+ V2
α=
K eq1
V2 Y
β = V1 X +
K eq 2
Estado Estacionario
dS
=0
dt
⇒
β
S ee =
α
Curso temporal
S (t ) = (S 0 − S ee ) e −α t + S ee
S (0 ) = S 0
Flujos
J 1 (t ) = V1 (X − S (t ) K eq1 )
J ee1 = V1 (X − S ee K eq1 )
J ee1 = J ee 2 ≡ J ee
J 2 (t ) = V2 (S (t ) − Y K eq 2 )
J ee 2 = V2 (S ee − Y K eq 2 )
J ee
X − Y K e1 K e 2
=
1
1
+
V1 V2 K e1
Ejemplo numérico
Valores de los parámetros:
V1 = 1, V2 = 1
α = 4/3
X = 3, Y = 1
β=4
⇒
Ke1 = 3, Ke2 = 1
See = 3
S0 = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6
Jee = 2
S vs. t
6
5
4
S 3
2
1
0
1
2
3
tiempo
X
E1
→
S
E2
→
Y
J1 vs. t
6
5
4
3
J1
2
1
0
-1
1
2
3
tiempo
X
E1
→ S
E2
→ Y
J2 vs. t
5
4
3
J2
2
1
0
-1
1
2
3
tiempo
X
E1
→ S
E2
→ Y
Control del flujo: Jee vs. Ei (análisis numérico)
v1 =
(VS1
K S1 ) (X − S K eq1 )
1 + X K S 1 + S K P1
v2 =
(VS 2
Software: COPASI
K S 2 ) (S − Y K eq 2 )
1 + S K S 2 + Y K P2
Control del flujo: Jee vs. Ei (análisis simbólico)
J ee
X − Y K eq1 K eq 2
=
1
1
+
V1 V2 K eq1
k cat1
V1 =
E1
K S1
k cat 2
V2 =
E2
KS2
Control por concentración de enzimas:
(I) V1 >> V2 Keq1
(II) V1 << V2 Keq1
(III) V1
≈VK
2
eq1
⇒
∝ E2
⇒ Jee ∝ E1
⇒
Jee
y Jee es independiente de E1
y Jee es independiente de E2
E1 y E2 afectan a Jee (menos que
¿Cuál es la enzima limitante?
∝)
Enzima limitante
Enzima que, al cambiar su concentración,
produce un cambio proporcional en el flujo
Análisis del Control Metabólico
Descripción cinética alternativa
• Coeficientes de elasticidad ..... (ε)
Coeficientes de elasticidad
ε
ε
v
V max
v
S
S ∂v
=
v ∂S
V max ∂ v
=
v ∂ V max
ε
ε
v
P
P ∂v
=
v ∂P
ET ∂ v
=
v ∂E T
v
ET
Cinéticas normales:
ε Sv ≥ 0
ε Pv ≤ 0
ε Av ≥ 0
ε Iv ≤ 0
ε Ev = 1
T
Coeficientes de elasticidad
(sensibilidad de las velocidades aisladas)
ε Sv = lim
δ S →0
 δv 
 
 v  ≈ pequeño cambio relativo en v
 δ S  pequeño cambio relativo en S


 S 
Modelo de Michaelis-Menten irreversible
KM
ε =
KM + S
v
S
v
P
ε =0
∈
(0,1)
Modelo de Michaelis-Menten reversible
S KS
1
ε =
−
1 − P S K eq 1 + S K S + P K P
v
S
v
P
ε =
v
S
− P S K eq
1 − P S K eq
v
P
ε +ε =
P KP
−
1+ S KS + P KP
1
1+ S KS + P KP
∈
∈
(0,+∞ )
∈
(− ∞ ,0)
(0,1)
Recordar
X
Sistema bienzimático (v)
E1
→ S
Sustrato
Producto
• Parámetros (p): X, S, E1.
• Variable: v1.
X
E2
→
Y
S
Sustrato
Producto
• Parámetros (p): S, Y, E2.
• Variable: v2.
E1
→ S
E2
→ Y
• Parámetros (p): X, Y, E1, E2.
• Variables: S, J.
Sistema bienzimático (εε)
X
E1
→ S
Sustrato
Producto
v1 = v1 ( X , S , E1 )
E2
→ Y
S
Sustrato
Producto
v 2 = v 2 (S ,Y , E 2 )
(v1 ∝ E1 )
ε Ev = 1
(v2 ∝ E 2 )
ε Ev = 0 (v1 independiente E 2 )
ε Ev = 0 (v2
independiente E1 )
ε Sv < 0
ε Sv > 0
ε Ev = 1
1
1
2
2
1
2
1
2
1
2
X
E1
→ S
S ee = S ee ( X ,Y , E1 , E 2 )
E2
→ Y
J ee = J ee ( X ,Y , E1 , E 2 )
Coeficientes de Control
(sensibilidad de las variables del sistema)
Y=JoS
E = [enzima]
 δY 


 Y  ≈ pequeño cambio relativo en Y
 δ E  pequeño cambio relativo en E


 E 
C EY = lim
δ E →0
E ∂S
C =
S ∂E
S
E
E ∂J
C =
J ∂E
J
E
Coeficientes de control
C
S
Ek
Ek ∂ S
=
S ∂E k
C
C
J
E1
=
=
ε
Ek ∂ J
=
J ∂E k
ε Ev = δ i k
i
Como:
S
E1
C
J
Ek
k
v2
S
1
− ε Sv1
ε Sv
−1
= v2
ε S − ε Sv1
C EJ2
− ε Sv1
= v2
ε S − ε Sv1
C
2
ε Sv − ε Sv
2
S
E2
1
Relaciones de sumación
• Sumación de concentración:
C ES1 + C ES2 = 0
• Sumación de flujo:
J
E1
C +C
J
E2
=1
Definición de etapa limitante de velocidad
(en el marco del ACM)
Ek es limitante
si su cambio produce
un cambio proporcional en el flujo
C
J
Ek
≡1
Enzima limitante en sistema bienzimático
ε
Cinéticas “normales”:
C ES1 > 0
C ES2 < 0
v1
S
< 0
0 < C EJ1 < 1
J
E1
J
E2
1.0
0.7
0.0
0. 3
0.5
0.0
0.5
1.0
C +C
ε
y
v2
S
>0
0 < C EJ2 < 1
=1
E1 es limitante
E2 es limitante
Control del flujo: MCA (análisis numérico)
v1 =
(VS1
K S1 ) (X − S K eq1 )
1 + X K S 1 + S K P1
v2 =
(VS 2
Software: COPASI
K S 2 ) (S − Y K eq 2 )
1 + S K S 2 + Y K P2
Efecto amortiguador del metabolismo
C EJ11 < ε Ev11 = 1

→ S i
C EJ22 < ε Ev22 = 1
Ei
→ S i +1

→
Al aumentar Ei :
1) aumenta inmediatemente Ji (t=0)
2) decrece paulatinamente Si lo que hace decrecer Ji
3) aumenta paulatinamente Si+1 lo que hace decrecer Ji
Conclusión: La mayor parte del aumento inicial, al
llegar al estado estacionario, es amortiguado
Teoremas de Sumación (N pasos)
• Sumación de concentración:
N
∑C
S
Ek
k =1
• Sumación de flujo:
N
∑C
k =1
J
Ek
=1
=0
Sumación de flujo (consequencia)
N
∑C
k =1
C
J
Ek
J
Ek
=1
⇒
C
J
Ek
1
=
N
es el valor promedio de los coeficientes
Representación modular de sistemas
enzimáticos estacionarios
E
S
P
C
S
P
E
Análisis Modular del Control
Metabólico para Grandes Cambios
MMCA
Proceso
de interés
vmódulo 1
s
vmódulo 2
Coefficients for large changes
Infinitesimal changes
var
= lim
C par
δ par →0
ε Sv = lim
δ S →0
 δ var 


 var 
 δ par 


 par 
 δv 
 
 v 
δS 


 S 
Large changes
var
C par
=
 δ var 


 var 
 δ par 


 par 
 δv 
 
v
ε Sv =  
δS 


 S 
System properties as a function of
module properties
vmodule 1
1
C = v2
ε S − r1 ε Sv1
S
v1
J
v1
C =
ε Sv 2
v2
S
ε − r1 ε
v1
S
1 ε Sv 2 (rS − 1) + 1
r1 = = v1
r2 ε S (rS − 1) + 1
vmodule 2
s
C
S
v2
− r1
= v2
ε S − r1 ε Sv1
C
J
v2
− r1 ε Sv1
= v2
ε S − r1 ε Sv1
rS = S x S o
o = reference state
x = final state
Summation and response relationships
S
v1
J
v1
C
J
v2
C +C =1
• Flux summation:
• Response:
S
v2
C + C = 1 − rS
• Concentration summation:
S
par
S
v
=C ε
v
par
C
J
par
J
v
=C ε
v
par
Experimental case
Control of glycolytic flux and biomass production
in Lactococcus lactis
vmodule 1
S o = 9.7
s
vmodule 2
S S o ∈ (0.49, 1)
[ ATP ]
S=
[ ADP]
v1 (S )
v2 (S )
ε Sv1
ε Sv 2
Infinitesimal Control Coefficients (at the reference state):
CvJ1 = 0.80
CvJ2 = 0.20
r ∈ (0.72, 1.38)
Koebmann et al. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68, 4274-4282
r
Estimation (I) of flux increase (constant control coefficients):
CvJ1 = 0.80 CvJ2 = 0.20
r ∈ (0.72, 1.38)
0.8 (1.38-1) x 100 = 30%
Estimation (II) of flux increase (non-saturable kinetics):
CvJ1 = 0.80 CvJ2 = 0.20
(1/(1-0.8 (1-1/1.38))-1) x 100 = 28%
r ∈ (0.72, 1.38)
Infinitesimal analysis predicts 28-30% increase in
flux by increasing the activity of module 1
Large changes flux control coefficients
Flux control drops when activity increases
Acerenza & Ortega (2007) FEBS J. 274, 188-201
Conclusions with MCA
for large changes
1) For each module, the control decreases rather abruptly
when increasing its own activity
2) Increasing the activity of module 1 (having the highest
control), we only obtain 4% increase in flux, while
estimations with infinitesimal analysis predict 28-30%
increase.
3) The flux can not be increased by a high factor
changing the activity of a single module.
Answer given by Modular MCA for
large responses
To obtain a large increase in flux it may
be necessary to change the activity of
more than one module
Difficulty:
What enzyme activities do we
have to change and by how much?
El Método Universal
Kacser H & Acerenza L (1993) A universal method for
achieving increases in metabolite production. Eur. J.
Biochem. 216, 361-367
Acerenza L (2000) On the universality of the universal
method in Technological and Medical Implications of
Metabolic Control Analysis (eds. A. Cornish-Bowden y M.
L. Cárdenas), pp. 33-37, Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht.
G
J2
J1
N
S
J3
∆J
∆ J3 = ∆ J
∆J2 = 0
r3 = E3y /E3x = 1+ ∆ J/J3x
∆ J1 = ∆ J
P
∆S = 0
& r1 = E1y /E1x = 1+ ∆ J/J1x
Extension: modular MCA for large
responses in branched systems
vmodule 1
s
vmodule 2
vmodule 3
Ortega & Acerenza (2011) FEBS J 278, 2565-2578
(
)
C vS1 = 1 + ε Sv1 (rS − 1) den
(
)
CvS2 = − α 1 + ε Sv2 (rS − 1) den
(
r1 =
)
C vS3 = − ( 1 − α ) 1 + ε Sv3 (rS − 1) den
(
) (1 + ε
− 1)) den
CvJ11 = α ε Sv2 + ( 1 − α ) ε Sv3
(
C vJ21 = − α ε Sv1 1 + ε Sv2 (rS
C
J1
v3
= − (1 − α ) ε
(1 + ε
v1
S
(
(rS
v1
S
v3
S
(rS
(
2
)
r2 =
1
1
3
3
1
(
α 1 + ε Sv (rS
2
2
1
2
1
r3
2
3
3
3
1
2
S
(1 − α ) + (ε Sv − α ε Sv ) (rS − 1)
=
(1 − α ) (1 + ε Sv (rS − 1))
2
3
) (r − 1)
− 1))
3
3
2
3
(
α + ε Sv − (1 − α ) ε Sv
den
3
3
− 1)
)
(rS − 1 ))
CvJ = − ( 1 − α ) ε Sv (1 + ε Sv (rS − 1 )) den
C vJ = ε Sv (1 + ε Sv (rS − 1 )) den
C vJ = − α ε Sv (1 + ε Sv (rS − 1)) den
C vJ = (− ε Sv + α ε Sv ) (1 + ε Sv (rS − 1)) den
den = − ε Sv + α ε Sv + (1 − α )ε Sv
v2
S
S
1 + ε Sv1 (rS − 1)
C vJ12 = ε Sv2 1 + ε Sv1 (rS − 1) den
CvJ22 = − ε Sv1 + ( 1 − α ) ε Sv3
) (r
− 1) den
− 1 ) den
)
) (1 + ε
(
1 + α ε Sv2 + ( 1 − α )ε Sv3
3
α = J 2o J 1o