Monte 27-03

VECTORES Y CLONADO
Martín Monte, viernes 27 de Marzo, 2009
Caracterización y estudio de la función de un gen
(Tb podría ser un fragmento de DNA genómico para el estudio de splicing o del promotor de un gen)
1- Obtención del gen de interés
mRNA
RT
1ra cadena
2da cadena
cDNA
Vector
PCR
Screening
Búsqueda
Library
Obtención de
la secuencia
Caracterización y estudio de la función de un gen
Secuenciación
Análisis de la secuencia:
Identificación del
fragmento secuenciado
enfrentándolo a bases de
datos de DNA
Caracterización y estudio de la función de un gen
Análisis de la secuencia:
Caracterización del
fragmento de DNA
STOP
ATG
5’UTR
ORF
3’UTR
cDNA
Caracterización y estudio de la función de un gen
Origen library
Origen PCR
Utilidad limitada (sonda, transc-traducc in vitro)
Generalmente los cDNAs no se expresan cuando
están clonados en vectores de libraries
Se puede replicar en bacterias
Utilidad muy limitada (sonda)
No se expresan
Se debe amplificar y secuenciar cada vez
que se necesite más material
No se puede replicar en bacterias
Para continuar con el estudio del fragmento de DNA
es necesario clonarlo en un vector adecuado
Vectores
• PLASMIDOS: construcciones de DNA derivados de plásmidos naturales. Límite clonado 0.110 Kb
• BACTERIOFAGOS: Derivados del genoma de virus que infectan bacterias (fago l ) 8-25 Kb.
Pueden ser empacados en fagos nuevamente.
• COSMIDOS: Plásmido que contiene secuencias cos del fago l y pueden ser empacados en
fagos 35-50 Kb
• BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) Derivados plásmido F de E. coli, 75-300 Kb
• PAC s es como un BAC, pero deriva del plásmido-P1 . Lim. Clonado 100 Kb
• YACs (Yeast artificial Chromosome): cromosoma de levaduras artificial, pretende imitar a un
cromosoma, contiene Centrómero y Telómeros . Lim Clonado:100-1000 Kb
plásmido
BAC
Fago l
YAC
Vectores
Clonado en un vector adecuado al estudio que se pretende realizar:
• Sistema: bacterias, levaduras, plantas, células de mamífero
• Objetivo:
•
Clonado de fragmentos de DNA para hacer una library
•
Expresión de cDNA completo, fragmentos, necesidad de fusiones
•
Análisis de la actividad de un promotor
•
Expresión de la proteína para ver su función
•
Expresión de la proteína para producirla y purificarla
Vectores
Son largos fragmentos de DNA construidos a partir de plásmidos,
o bacteriófagos naturales con la capacidad de replicación
autónoma y que permiten el clonado de fragmentos de DNA
Características:
•
Poseen secuencias que permiten su propagación autónoma (ORI)
•
Poseen una región para insertar el DNA a clonar (Multiple Cloning Site-MCSo polylinker) con sitios únicos para varias enzimas de restricción.
•
Marcadores de selección: permiten seleccionar exclusivamente las células
que contiene el vector.
PLASMIDOS:
Molécula circular de DNA doble cadena extracromosomal que replica en
forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb)
FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS
• Resistencia a antibióticos
• Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas)
• Producción de toxinas (ej E.coli, enterotoxinas)
• Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)
• Inducción de tumores (plantas)
• Sistemas de Restricción-modificación
• Producción de antibióticos (ej Streptomyces)
• Resistencia a metales pesados
R6
pSC101
Stanley Cohen
Tn3
Tetr
Ampr
Ori
pMB9
Mary Betlach
ColE1
Construido por Ray Rodriguez and Herbert Boyer
PLASMIDOS:
Sitio para clonado
Gen de resistencia
Origen de replicación
PLASMIDOS: marcadores de selección
Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :
• Marcadores de resistencia a antibióticos
Ej: Ampicilina , Kanamicina, Tetraciclina , Zeocina, Neomicina, Puromicina
• Marcadores de auxotrofía (permiten síntesis de un componente esencial para el
crecimiento celular)
Ej: aminoácidos
PLASMIDOS: marcadores de selección
Ampicilina: agente beta-lactámico que interfiere con la síntesis de pared bacteriana
Resistencia: Ampr (gen bla), codifica para una enzima con actividad b-lactamasa
Tetraciclina: Actúan inhibiendo la síntesis proteica al unirse a la subunidad 30 S del
ribosoma bacteriano e impide la unión del tRNA a este y el transporte de aminoácidos
hasta la subunidad 50 S
Resistencia: Tetr (gen tet) codifica para una proteína que se une a membrana bacteriana y
impide transporte del antibiotico
Kanamicina: Es un aminoglucósido que se une a ribosomas 30S , produce misreading del
mRNA y codones stop.
Resistencia: Kanr (gen kan) aminoglicosido fosfotransferasa modifica el antibiótico.
PLASMIDOS: Orígenes de replicación
• El origen de replicación del plásmido es la región encargada de su propagación
• Puede haber más de un origen de replicación con diferente función en un plásmido
Ejemplos:
ColE1 Ori: bacterias
f1 Ori: fago filamentoso
2uM Ori: levaduras
SV40 Ori: células
• El tipo de origen para bacterias (ECol1, pMB1, pSC101) está relacionado con
la cantidad de copias de plásmido que se generarán en la bacteria, y divide a los
plásmidos en alto (30-300) o bajo (1-30) número de copias.
• Existen muchos orígenes de replicación para bacterias, muchos de ellos modificados
en sus sistemas de control para lograr los de alto número de copias.
• Vectores que utilizan el mismo Ori no pueden replicarse en la misma bacteria debido
a que los reguladores que actúan en trans pueden regular ambos plásmidos. Esto se
denomina Grupo de Incompatibilidad .
Todos los plásmidos deben tener
un origen de replicación en bacterias
ya que su amplificación y purificación
en bacterias es un paso obligado para
su utilización
Origen ColE1 o pMB1
-555
-265
-20
ori
REPLICACION
Corte por RNAasa H
RNAII primer
ori
RNAII primer
Corte por RNAasa H
Rop
NO REPLICACION
RNA I
Origen de
Replicación
Grupo de
compatibilidad
Número de
copias
Otras
Características
pMB1
pBR 322 y sus
derivados (i.e,
pET vectors)
15-20
pMB1 son
similares a
ColE1
pMB1 mutado
Vectores pUC
500-700
mutación en el
gen rop
p15A
pSC101
ColE1
pACYC y sus
derivados
pSC101 y sus
derivados
ColE1
10-12
5 aprox
15-20
f1
Se sintetiza DNA
simple cadena
SV40
Para replicación
en eucariotas
superiores
Caracterización y estudio de la función de un gen
Origen library
Origen PCR
Utilidad limitada (sonda, transc-traducc in vitro)
Generalmente los cDNAs no se expresan cuando
están clonados en vectores de libraries
Se puede replicar en bacterias
Utilidad muy limitada (sonda)
No se expresan
Se debe amplificar y secuenciar cada vez
que se necesite más material
No se puede replicar en bacterias
Para continuar con el estudio del fragmento de DNA
es necesario clonarlo en un vector adecuado
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
Fragmento/inserto
Vector
MCS
Principales Protocolos:
1) Corte de V e F con ER y Ligado
2) Recombinación entre V e F
Fragmento clonado
en vector
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
Pasos básicos:
• Digestión por separado del vector y el fragmento con una o dos enzimas de
restricción compatibles mediante una reacción in vitro
• Reacción de ligación incubando el vector y el fragmento digeridos con una enzima con
actividad DNA ligasa.
• Transformación de bacterias competentes con el producto de la reacción de ligación
utilizando antibióticos para seleccionar las colonias que hayan incorporado el plásmido
• Screening de los plásmidos que hayan incorporado el inserto
• Secuenciación para chequear el DNA recombinante (Vector + inserto)
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
1) Elección del vector según el organismo y el propósito del clonado
2) Elección de la enzimas de restricción:
considerar:
1- que las enzimas estén en el polylinker y en la orientación correcta
2- que no haya sitios internos en el fragmento
3- si fuera una fusión con un tag o proteína, controlar el marco de lectura
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
Utilización de un programa que indique las enzimas que cortan nuestro fragmento y las que no
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
Utilización de un programa que indique las enzimas que cortan nuestro fragmento y las que no
BamHI
MCS
EcoRI
MCS
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
2) Elección de la enzimas de restricción:
• Si no hay posibilidad de clonar en forma direccionada (dos enzimas diferentes que
orientan el fragmento en una única dirección), también se puede recurrir :
- Clonar con una sola enzima de restricción y luego controlar en que orientación
entró el fragmento
200bp
HindIII EcoRI
HindIII
EcoRI
MCS
MCS
600bp
HindIII EcoRI
MCS
Clonado EcoRI
Screening HindIII
HindIII
EcoRI
MCS
vector
Ins 600bp
Ins 200bp
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
2) Elección de la enzimas de restricción:
Si no hay posibilidad de clonar con las enzimas presentes en el MCS -polylinker también se
puede recurrir a :
- Utilizar enzimas diferentes pero que dejen el mismo extremo cohesivo
XbaI
NheI
G
CGATC
XbaI
EcoRI
P
HindIII
inserto
EcoRI
NheI
CTAGA
T
GC T A G A
C G A T CT
P
Sitio híbrido NheI/XbaI
No lo digiere ninguna enzima
XbaI
MCS
HindIII
EcoRI
NheI/XbaI
inserto
MCS
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
2) Elección de la enzimas de restricción:
Si no hay posibilidad de clonar con las enzimas presentes en el MCS -polylinker también
se puede recurrir a :
- Formar extremos romos a partir de cohesivos
EcoRI
BamHI
MCS 1
EcoRI
P
HindIII
BamHI
inserto
EcoRV
EcoRI
DNA T4 Pol
P
P
XbaI
HindIII
BamHI
inserto
EcoRV
P
EcoRV
MCS 2
La digestión con EcoRV forma naturalmente extremos blunt
XbaI
MCS 2
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
Generación de extremos romos a partir de extremos cohesivos utilizando la T4DNA polimerasa
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
Reacción de Ligación:
El 5’-P es necesario para
la ligación
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SEGUIDA DE LIGACIÓN
Reacción de Ligación: para evitar que el vector se re-ligue cuando se corta con una sola
enzima de restricción hay que defosforilar los extremos 5’ libres
1) Digestión con una enzima
de restricción (EcoRI)
EcoRI
EcoRI
MCS
P
P
EcoRI
EcoRI
MCS
MCS
2) Tratamiento del vector con una
fosfatasa (fosfatasa alcalina)
P
inserto
EcoRI
MCS
MCS
P
EcoRI
inserto
MCS
Clonado de productos de PCR en vectores
Productos de PCR
Vectores
Amplificación con primers sin sitios ER
Taq
5’
3’ OH-A
T4 DNA Pol
Pfu
5’
3’ OH-
Clonado T
A-OH 3’
5’
T
T
Taq + dATP
-OH 3’
5’
PNK + dATP
5’ P
3’ OH-
-OH 3’
P 5’
Clonado blunt
Vector de-P
Amplificación con primers con sitios ER
5’
3’ OH-
-OH 3’
5’
Digestión con ERs
y clonado sticky
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
REACCIÓN BASADA EN EVENTOS DE RECOMBINACIÓN
Sequence and Ligase Independent Cloning
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
TRANSFORMACIÓN y SELECCIÓN DE BACTERIAS
TRANSFORMACIÓN (Bacterias competentes)
Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc
Eficiencia:107 UFC/ug DNA
Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos )
Ef: 108 UFC/ug DNA
SELECCIÓN
Crecimiento en presencia de antibiótico
Plato LB-Agar + Amp
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
BÚSQUEDA DE VECTORES CON INSERTO (RECOMBINANTES)
A
Mapeo de restricción utilizando una enzima que corte
una sola vez y permita ver la diferencia entre vector
vacío y vector con inserto
B
Vector + ins
Vector
Mapeo de restricción utilizando un doble corte que
permita ver la liberación del fragmento
vector
Ins 600bp
Algunos vectores poseen la secuencia del gen beta-gal
con el MCS en su interior. Si el inserto está presente,
beta-gal no se expresa y el test para actividad beta-gal
da negativo (blanco). Si el vector se religó beta-gal está
intacto y el test da positivo (colonias azules)
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
BÚSQUEDA DE VECTORES CON INSERTO (RECOMBINANTES)
C
Reacción PCR sobre el DNA de las colonias obtenidas en
el plato de selección utilizando primers específicos para
el inserto o primers que hibridicen sobre el MCS
PCR
D
Réplica del plato de selección sobre membrana de nylon
y búsqueda de las colonias con inserto utilizando una
sonda marcada específica. Se revela por autoradiografía
y se identifican las colonias positivas
Clonado de fragmentos de DNA en vectores
1. Elección y preparación de vector e inserto
2. Reacción de ligación o recombinación
3. Transformación de bacterias competentes en un medio que permita seleccionar las
colonias con vector (Antibióticos)
4. Screening: en la etapa de analizar el DNA es necesario hacer crecer algunas las colonias
por separado en medio líquido con antibiótico y purificar plásmido a partir de una
alícuota del cultivo. Analizar el DNA purificado (restricción, secuenciación, etc) y una vez
elegido el DNA correcto, hay que volver al cultivo original para hacer stock de bacterias y
amplificar el vector para su uso.