Descargar pdf - Biología Molecular y Bioquímica
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Desafí Desafíos para la expresió expresión de genes introducidos 1. Importancia del promotor y elementos enhancers 2. Hay dos factores principales que determina si los genes se expresan en el momento y cantidad adecuadas a) Un gen debe ser introducido en todas las cé células y ser estabble para la transferencia a su descendencia: descendencia: i. El promotor debe ser reconocido y bien regulado o siempre activo. activo. Un promotor fuerte que se usa de manera rutinario es el promotor del virus del mosaico de la colifor (CaMV 35S) y el promotor de la Rubisco, Rubisco, regulada por luz Biotecnologí Biotecnología de Plantas ii. Se debe suministrar terminación y señal de poliadenilación iii. Se pueden necesitar secuencias que dirija la proteína a un orgánulo determinado b) Uso de codones: i. Los genes necesitan especificar aminoácidos que coincida con los tRNA y grupos de aminoácidos de la planta ii. Los genes se pueden modificar para que contenga los codones adecuados (ingeniería de codones) Dinero que mueve la Ingeniería Genética • Inversión global estimada alrededor de 20.000 millones de euros • 2/3 consiste en inversión privada • Un estudio industrial estimó el mercado potencial para productos biotecnológicos en 278.000 millones de euros en 2005 Hindmarsh et al. 1998 DESARROLLO DE TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE • Aislar genes • Manipular el diseño • Integrar el DNA recombinante en las células de la planta • regenerar un planta completa PARA LA MEJORA POR INGENIERÍA GENÉTICA SE NECESITA..... 1. Conocer los procesos que controlan la característica a mejorar 2. Identificar especies o variedades que contienen los genes de interés (cualquier especie) 3. Aislar el gen 4. Organizar el gen para que se exprese en el lugar y modo adecuado 5. Que la proteína (si la hay) sea funcional 6. Transformar plantas y seleccionar transformantes que expresen la proteína a niveles suficientes 7. Rezar...... 1 DESARROLLO DE TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE Expresar un gen.. PROMOTOR • CONFERIR CARACTERÍSTICAS PRECISA GEN DESEADAS DE MANERA • CRUZAR BARRERAS DE ESPECIES • CREAR NUEVAS COMBINACIONES DNA • INTRODUCIR SÓLO EL GEN DE INTERÉS TRANSFORMAR PLANTAS Promotores Promotores: Promotores: regulació regulación •Promotores fuertes GEN PROMOTOR RNA polimerasa PROMOTOR GEN •Promotores dé débiles transcripción GEN GEN •Promotores especí específicos de tejidos GEN DesarrollosBiotecnológicos Términos importantes GMOs - Organismos Geneticamente modificados • GMO - Un organismo que expresa caracteres que resultan de la introducción de DNA extraño • Mejora Gen beneficioso añadido de misma especie Gen añadido por cruces dentro de especies Source: USDA • Transformación Gene beneficioso de otra especie Gen añadido por ingeniería genetica • También llamado organismo transgénico Source: USDA 2 Cruce interespecífico Aclaremos conceptos Wheat Rye • Mejora clásica ≠ Biotecnología Mejora sólo intercambia genes dentro de especies Sólo en especies afines PERO no es lo mismo que biotecnología X • Biotecnología añade características que no son disponibles en estas especies Soja no tiene un gen que degrada Roundup El gen viene de Bacteria Biotecnología Vegetal •Tradicional Mejora clásica Triticale Nueva especie, pero NO un producto biotecnológico Los resultados de mejora clásica son buenos per muy lentos… Recombinante Técnicas de DNA corn cob teosinte http://www.insp.mx/xcongreso/ponencias/5 Tomate silvestre (Lycopersicon pimpinellifolium ) D= 1 cm John Doebley photo híbridos (heterosis) www.quirkyworks.com/design/ Samples/plant-breeding.jpg 3 Mutagénesis: Nuevo caracter sin un nuevo Gen El mercado de cosechas biotecnológica está dominado por cinco Países Mutagénesis cambian la secuencia de un gen Nuevas, características interesantes se pueden obtener 6% 4 mha 63% 43 mha Tratemiento de Mutagénesis Gen Normal susceptible ATTCGA 21% 14 mha 3% 3 mha 3% 3 mha Gen resistente mutante ATTGGA Estos países suponen el 98% del mercado 15 % de incremento en cultivo biotec en 2003 a 2003 Productos de Biotecnología bacteriano y animal Source: Chr. Hansen Biotecnología chymosin enzyma usado en productos lácteos gen de levaduras obtenidos de bacterias GE reemplaza el enzima del hígado bST (aomatotropina bovina) Source: Rent Mother Nature incrementa la producción de la leche gen de la vaca protein harvested from GE bacteria replaces cow protein originally harvested from pituitary glands of slaughtered cows growing season data . http://www.isaaa.org/Press_release/Briefs30-2003/press/b30_english.htm Cultivo de tejidos de plantas y aplicaciones Cultivo de tejido de plantas Se define como el cultivo de partes de plantas en condiciones esté esté riles tales como órganos, rganos, embriones, embriones, semillas, semillas, y cé lulas en medio lí líquido o solidificado Cé lulas diferenciadas se pueden cultivar in vitro para generar plantas enteras, enteras, con el uso de una pequeñ pequeña cantidad de material Tejido meristemá meristemático (cé lulas en crecimiento) crecimiento) se usa para crecer plantas con flores, y es libre de virus, aspecto importante en la propagació propagación de plantas Los pasos bá básicos de cultivo de plantas son: a) Remover una pieza de tejido de una planta, denominado un explanto. explanto. b) Coloca un explanto en un medio nutritivo para forzar a las cé células del explando convertirse en indiferenciadas y formas un callo: callo: Desdiferenciació Desdiferenciación. c) El tejido que forma el callo se transfiere a otro medio nutritivo que permite si diferenciació diferenciación en un tejido: tejido: Rediferenciació Rediferenciación. d) La planta se transfiere a sustrato. sustrato. La capacidad de una cé célula vegetal a producir una planta completa se llama Totipotencia. Totipotencia. 4 Hay 6 tipos de cultivo in vitro que pueden crear una planta completa: completa: a) Cutivo de callo – cultivo de un tejido desdiferenciado de un explanto que se desdiferencia b) Cultivo celular – cultivo de cé células o agregado de cé células (pequeñ pequeño grupo de cé células) lulas) en cultivo lí líquido c) Cultivo de protoplasto – cultivo de cé células vegetales que tienen sus paredes celulares quitadas d) Cultivo de embriones – cultivo de embriones aislados e) Cultivo de semillas – cultivo de semillas para generar plantas completas f) Cultivo de órganos – Cultivo de órganos de plantas aislados como anteras, anteras, raí raíces, ces, tallos, tallos, yemas etc. B. Micropropragació Micropropragación 1. Plantas de interé interés se clonan a travé travé s de un proceso de cultivo in vitro denominado “propagació propagació n clonal in vitro” vitro” o micropropagació micropropagación 2. Forma parte de una industria muy importante puesto que tiene el potencial de crear muchas más plantas a partir de un material inicial (por ejemplo olivos) olivos) Hay 4 etapas en la micropropagació micropropagación: Etapa 1 – Iniciació Iniciación de un explanto esté estéril, ril, esterilizació esterilización de la superficie del tejido para prevenir contaminació contaminación, y tranferencia de explantos a un medio nutritivo. nutritivo. Etapa 2 – Iniciació Iniciación del tallo, tallo, que es la multiplicació multiplicación del tejido del tallo a partir de explantos en un segundo tipo de medio nutritivo. nutritivo. Etapa 3 – Iniciació Iniciación de raí raíz, que es la multiplicació multiplicación de un tejido de raí raíz de explantos en medio nutritivo. nutritivo. Etapa 4 – Transferencia de las plantas a un medio esté estéril u otro sustrato bajo condiciones controlas para crecer plantas completas. completas. 5 Nutrientes como vitaminas vitaminas,, sacarosa, sacarosa , y hormonas vegetales pueden controlar el cultivo del tejido tejido.. Por ejemplo alterando las cantidades de las hormonas auxinas y citoquinicas induce multiples tallos para formar un cultivo. cultivo . Embriones somá som áticos ( embriog embriogé énesis somá som á tica tica)) a) Produce estructura embrion-like embrion -like llamados embrioides de tejidos de plantas.. plantas b) Hormonas como auxinas afecta el desarrollo normal y forma embrioides de tejidos “ normales normales””. c) Los callos tambié tambi én se pueden usar, usar , cambiando las hormonas para inducir la formaci formació ó n de embriones, embriones , y cada embrioide puede formar una nueva planta. d) Tambi Tambié én se pueden producir en cultivo llííquido, quido , usando ccé élulas individuales o tejido de plantas: plantas : i. Las paredes celulares se degradan con enzimas para formar protoplastos.. protoplastos ii. Se regenera la pared celular celular,, comienza la divisió división celular, celular , y se forma agragaciones celulares. celulares . iii. Las agragaciones celulares se cultivan en un medio só s ólido para formar tallos y ra raííces. ces. e) Este es el m mé étodo preferido para producci producció óna gran escala, escala , usando bioreactores para producir millones de embrioides. embrioides . f) Embrioides tambié tambi én se pueden empaquetar como semillas artificiales, artificiales , que se encapsulan para la distribuci distribució ón y se protegen con un complejo de agar y otros geles geles.. Productos quí químicos de plantas a) Metabolitos primarios y secundarios son útiles para las plantas para funcionar como protecció protección de mamí mamíferos, feros, insectos, insectos, y pató patógenos. genos. Muchos de estos compuestos son usados en medicina y alimentació ó n . alimentaci b) Más del 25% de los productos farmacé farmacéuticos en Europa vienen de plantas y el 75% de la població población mundial dependen de medicina obtenida de hierbas c) En muchos casos el desarrollo de una droga comienza con la identificació identificación de una hierba medicinal ampliamente usada normalmente por indí indígenas. genas. Es compuesto quí químico (principio activo) activo) es aislado, aislado, sintetizado quí químicamente y testado en ensayos clí clínicos. nicos. 6 Cultivo celular: celular : i. Produce compuestos quí qu ímicos sin la necesidad de usar plantas tropicales y subtropicales para crecer plantas completas,, que pueden dañ completas da ñar el medio ambiente ii. Puede producir mayoras cantidades de metabolitos que plantas completas en condiciones controladas como un bioreactor iii. Shikonina Shikonina,, un producto quí qu í mico que se usa en muchas cremas,, cosmé cremas cosm étidos y tintes se ha producido en grandes bioreactores que producen entre 1.5 y 4.0 gramos de shikonina por litro de cultivo iv. Muchos procesos de producci producció ón requieren mucho tiempo (hasta 10 a añ ños) os) y costa mucho desarrollar desarrollar,, por lo tanto las ventas deben amortizar los costes v. Los genes se pueden introducir en plantas de manera que permita a las ccé élulas de plantas producir metabolitos qye no producen normalmente vi. Puede ser perjudicial para pa paííses en desarrollo desarrollo,, que se basa en la extracció extracci ó n de metabolitos de plantas en lugar que producirlos Variació Variación somaclonal a) La variabilidad gené genética producida por cultivo de tejidos. tejidos. Esta variabilidad puede ser explotada para mejora caracterí características de cosechas y plantas ornamentales, ornamentales, tales como maí maíz , trigo, trigo, cebada, cebada, y patata b) Caracteres tales como tolerancia a sal y metales pesados, pesados, resistencia a insectos, insectos, y mejora de la calidad de semilla se puede generar por un proceso de selecció selección c) La variabilidad gené genética se produce por cambios en el número cromosó cromosómico debido a reorganizaciones cromosó cromosómicas, micas, amplificació amplificación gé génica, nica, y la activació activación de transposones. transposones. Como resultado, resultado, planta hijas difieren de parentales. parentales. El manteniemiento de caracteres deseables es esencial Otros usos del cultivo de tejido 1. Fusion de protoplastos a) Protoplastos se generan por digestió digestió n de la pared celular b) Dos protoplastos de dos especies no relacionadas se fusionan por productos quí químicos o electroporació electroporación c) El material gené genético se mezcla junto, junto, y las células hí híbridas se criban buscando caracteres de interé interés Colecciones de Germoplasma a) El material gené genético de una planta, que puede contener caracterí características importantes e incrementar el valor de una planta, como resultado de mayor tolerancia a sequí sequía y plagas b) Germoplasma antiguo se usa para introducir nuevos caracteres tales como resistencia a enfermedades en plantas actuales c) El germoplasma va desapareciendo debido a la perdida de cultivo tradicional, tradicional, eliminació eliminaciónd de viejos cultivos, cultivos, y el uso de plantas modernas en lugar de plantas antiguas d) Banco de genes 7 Introducir genes en plantas 1) Infectar células de plntas con plásmidos como vectores que llevan el gen de interés 2) Disparar balas microscópicas que contienen en su superficie el gen directamente a la célula Ingenierí Ingeniería gené genética de plantas Transformació Transformació n de plantas y Agrobacterium tumefaciens. tumefaciens. 1. Una bacterí bactería comú común de suelo que causa tumor en agalla 2. La bacteria entra por lugares donde la planta ha sido dañ dañada 3. La bacteria tiene un plá plásmido llamado “plasmido Ti” Ti” que contiene genes llamados “genes vir (virulencia) virulencia)” que codifica una proteí í na que transfiere una regió ó prote regi n del plá plá smido llamado “T-DNA” T-DNA” a cé células donde se pa producido el dañ daño 4. Una vez que las cé cé lulas vegetales son infectadas, infectadas, las hormonas vegetales estumula el crecimiento de las cé cé lulas tumorales 5. El T-DNA ha sido construido de manera que tiene los genes vir eliminados, eliminados, de manera que el DNA extrañ extraño puede ser insertado en genoma de plantas, plantas, transformando la misma 6. Un mé método de transformació transformación general: a) Cé lulas de un disco de hoja, hoja, plá plántulas, ntulas, o yemas, yemas, y protoplastos reciben el DNA y las cé células crecen b) Se usa un medio de selecció selección de aquellas cé células con el nuevo caracter c) Las cé células transformadas se cultivan en un medio sólido para formar un callo d) Las hormonas son modificadas para promover la formació formació n de tallos y raí raí ces e) Se examinan las plantas modificadas para determinar si se expresa el gen introducido Agrobacterium El ingeniero de la naturaleza: Agrobacterium tumefaciens ･ Bacteria patogena de plantas ･ Causa enfermedad crown gall ･ Plasmido Ti en cepas patogenas ･ T-DNA transferido a celulas de la T-DNA planta Plasmido Ti 8 Ingenería genética de plantas con Agrobacterium tumefaciens • A. tumefaciens: usado rutinariamente. • Contiene T-DNA (plásmido bacteriano) • Los genes se integran en el DNA bacteriano cuando se transfiere el TDNA El tumor de A.tumefaciens puede ser grandecito… Inducción del tumor por A. tumefaciens Biología de A. tumefaciens Bién conocido que produce el tumor de agalla A.tumefaciens es una bacteria que vive en el suelo (en la rizosfera) donde usa nutrientes que provienen de las raíces Infecta a través de heridas son atraídas quimiostáticamente a ellas Las bases de ingeniería genética mediada por Agrobacterium • T-DNA de A. tumefaciens se excinde e integra en el genoma de plantas como parte de una infección natura • Cualquier DNA insertado en el T-DNA será también integrado www-genvagar.slu.se/teknik/ djup/plasm.htm T-plasmido bacteriano produce receptores para actosiringona Daño en plantas produce acetosiringone Genes importantes condificados por el plásmido Ti Cytoquininas son hormonas vegetales derivadas de la purina adenina 1. Citoquininas (hormona vegetal esencial en división celular y crecimiento tumoral) 2. Enzimas para la síntesis de ácido indolacético (auxina) Hormona vegetal (induce elongación de tallo y hoja, induce partenocarpia y previene envejecimiento) 3. Enzimas implicadas en síntesis y liberación de metabolitos de plantas: las opinas (derivados de aminoácidos) las grocinopinas (derivados fosforilados de azúcares) Zeatina es una de de las citoquininas cuya síntesis puede ser codificada por el plásmido Ti Nopaline Opinas y agrocinopinas son NUTRIENTES de A.tumefacies. No puden ser usados por otras especies bacterianas Proporciona un nicho único para A .tumefaciens Aislada del maíz Expresión específica celular de citoquinica en célula infectada por A.tumefaciens 9 Opinas son nutrientes que se usan para detectarse entre bacterias Plásmido Ti Región T-DNA Las células de plantas comienzan a secretar Las opinas del T-DNA bacteriano transferido opina difunde en células de alrededor y sirve como moléculas señal para la conjugación de Agrobacterium DNA entre bordes L y R es Transferido a una planta como ssDNA Genes que producen tumor Catabolismo de Opinas (Quorum sensing) Region Vir (virulencia) Vectores basados en plásmidos Ti Sistemas binarios Vectores co-integrativos Vectores co-integrativos (plásmido ti híbridos) Ráramente usados Necesita 3 vectores Necesita 2 vectores: Plásmido Ti desarmado Con gen de interés (sin genes vir) Vector helper para infección (con genes vir) ORI Genes codificados por el T-DNA se pueden sustituir por otros genes Forma plásmido co-integrado después de recombinación homóloga sobre T-DNA Plámido con el Ti desarmado capáz de infectar Vector intermedio Con región T-DNA y el gen de interés (trasferido por conjugación) Vector helper Para trasferencia del plásmido intermedio al Agro 2) Transferencia ineficiente comparados con vectores binarios Promotores usados para la expresión en plantas transgénicas Vectores binarios Región T DNA eliminada Gen de interés DESVENTAJAS: 1) Se requiere mucha homología entre plásmido Ti y plásmido de E. coli (vectores intermedios basados en pBR322) lo que hace que sean dificil de construir y usar 35S, promotor del virus del mosaico de la coliflor CaMV Marcador de selección en planta Marcador de selección en bacteria Disarmed Ti plasmid ori para E.coli Región de Virulencia ori para A. tumefaciens Plásmido HELPER CaMV es un genoma circular de doble cadena dsDNA ori para Agro DESVENTAJA: Según la orientación, los plásmidos con dos orígenes de replicación pueden ser inestables en E. coli VENTAJA: Se usan vectores pequeños, lo que incrementa la eficiencia de transferencia de E. coli a Agrobacterium. CaMV 35S es un promotor muy fuerte (constitutivo o ectópico) que es activo en la mayoría de tejidos de dicotiledoneas No se requiere recombinación intermolecular 10 Callo Pasos en la creación de una planta transgénica 1. Los dos plásmidos se transfieren a Agrobacterium Tejidos especializados de plantas que se forman en una herida; se forma un cambiun para sellar la herida de manera progresiva 2. Un cultivo vegetal se infecta con el Agro 3. Productos de los genes Vir escinden el T-DNA y lo transfieren al cromosoma de la planta L-Border Polilinker Gen de resistencia a Kan R-Border Células del Callo Son las má fáciles de transformar (sus paredes son muy delgadas) Gen de interés 4. Selección de células transformadas en Kan Protoplastos (sin paredes celulares son más fáciles de transformar, pero es más deficil de obtener una planta completa 5. Confirmar la presencia del transgen por PCR 6. Una planta completa se puede crecer de células transformadas !!! Los callos se producen por manipulación de concentraciones externas de hormonas vegetales Hormonas vegetales fundamentales Producir callo transformar callo estimular tallo por adición de citoquinina + citoquinina Citoquininas Auxinas Auxina natural es el ácido indolacético (IAA) Meristemo apical es el sitio principal de síntesis de auxinas Relacionadas estructuralmente a la adenina Producida por tejidos de crecimiento activo, especialmente raíces, embriones y frutos auxina < CITOQUININA TALLOS AUXINA > citoquinina RAÍCES auxinA = citoquinina callo indiferenciado Monocots no son fáciles de manejar – callo es difícil de iniciar, callus A.tumefaciens no es una bacteria patogénica para monocots Procedimento fácil (según especie) para dicotiledóneas Biology of Plants, Raven et. al., Freeman Worth Publishing, 1999 DNA con el gen de interés y resistencia a antibiótico cubre partículas de oro 1. Se elimina el pericarpo y se obtienen embriones inmaduros (0.5 - 1.0 mm) 2. Los embriones inmaduros se colocan en un medio de inducción de callos La transfomación se realiza con una pistola de genes Medio muy osmótico prepara el callo para transformación Los callos se colocan en una cámara de vacío, la presión de Helio dispara el DNA hacia las células Los callos se dejan en medios con alto osmótico durante 20 horas después del disparo Arma de genes Partículas de oro recubiertas con el DNA Cámara de vacío plantsciences.montana.edu/ .../transform1.htm 11 Después del disparo los callos se sitúan en un medio de selección por varias semanas 3. Bombardeo de partículas usando una pistola de genes que usa Helio Gas de Helio Metodología Discos de ruptura Los callos se transfieren a medio para inducir la producción de tallos Despúes de inducir pequellos tallos se transfieren a a contenedores con medio que induce la foramación de raíces macroprojectiles Célula vegetal Partículas recubiertas con el DNA 1. Bombardeo de células con partículas de oro 2. Detectar actividad con proteínas marcadoras - No requiere cultivos celulares o pretratamiento de cultivos - Es la que se emplea normalmente para la transformación de monocots Las pequeñas plantas se transplanta a suelo y se aclimatan bajo condiciones de alta humedad 4. Electroporación metodología Optimizació Optimizaci ón de mutiples variables Desidad de protoplasto 2 x 10 6 mL -1 Con los procedimientos actuales solo entre un 10-20% de las plantas actuales son trangénicas,y por tanto se deben comprobar en la expresión del transgen Concentración plásmido 200µg/mL Tamaño plásmido 3-6 Kb Eliminaciónd de paredes celulares no siempre necesario 1.5 kV Concentración de iones KCl 125 mM Examinar células para la actividad de transgen (por ejemplo expresión GUS) Gen reportador – gen cuya expresión es fácil de observar. Usada para “reportar” la expresión del gen - regulación y localización http://home.ust.hk/~rocklab/dc3gus/ ABA-inducible expression • gen GUS (uidA) β-glucuronidasa X-Glc Precipitado azul Ácido 5-bromo-4-cloro-3-inolil -β-D-glucurónico Guard cells Roots •Proteína fluorescente verde (GFP) Proteína de la medusa Aequorea victoria. GFP se produce en muchos organismos heterólogos Muchas variantes disponibles comercialmente (proteína fluorescente roja) • Gen de la kuciferasa (luc) A. thaliana C24 wild type (left) 35S-mgfp4-ER transformed (right) Aequorea victoria La mosca de fuego de norte américa libera luz verde durante la oxidación del sustrato luciferina Cámaras CCD pueden detectar bioluminiscencia en tiempo real 12
