Mecanismos Moleculares de la Adaptación Biológica

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Mecanismos Moleculares de la Adaptación
Biológica
Coordinador: José Eduardo González-Pastor
Miembros de la línea de investigación: Ángeles Aguilera, Ricardo Amils Pibernat , Yolanda Blanco López,
Cristina Cid, Patricia Cruz Gil, Laura García Descalzo, Eva García López, Miriam García, Manuel José
Gómez Rodríguez, Carolina González de Figueras, José Eduardo González Pastor, Elena González Toril,
María Lamprecht Grandío, Francisco J. López de Saro, Salvador Mirete Castañeda, Mercedes Moreno
Paz, Veronica Morgante, Victor Parro, Marina Postigo Cacho, Patxi San Martin Uriz, Olga Zafra Amorós Resumen: Todos los organismos están compuestos de macromoléculas similares (ácidos nucleicos, proteínas,
polisacáridos…), sin embargo la evolución ha permitido a los microorganismos sobrevivir en un amplio rango de
condiciones físico-químicas. ¿Cuáles son las propiedades que capacitan a un microorganismo para sortear
condiciones extremas que resultan letales para otros? ¿Qué mecanismos moleculares y qué estrategias metabólicas
adoptan los microorganismos para sobrevivir y desarrollarse bajo determinados parámetros fisicoquímicos
extremos? Comprender la persistencia y versatilidad de la vida en la Tierra y dilucidar los sistemas moleculares
que los microorganismos utilizan para vivir en tales condiciones extremas, proporcionará la base para la
formulación de hipótesis y la elaboración de predicciones sobre la vida en otros planetas. Asimismo, el
conocimiento de los mecanismos moleculares y las estrategias de adaptación nos permitirá identificar señales
específicas e inequívocas de la presencia de vida.
Mecanismos moleculares de adaptación a ambientes
extremos
restante es de origen bacteriano.
Por su interés básico y aplicado, estamos interesados en
identificar nuevos mecanismos moleculares implicados
en la adaptación de los microorganismos a condiciones
extremas, concretamente a metales tóxicos, pH ácido y
temperaturas extremas. Para ello se emplean técnicas
independientes de cultivo, como la metagenómica
funcional y la metaproteómica, que permiten el acceso
a la información genética de todos los microorganismos
del ambiente, incluida la de aquellos que no se pueden
cultivar en el laboratorio. Concretamente se han
estudiado mecanismos de resistencia de los
microorganismos a hipersalinidad, arsénico y pH ácido
en muestras del Río Tinto, a bajas temperaturas en
muestras del Ártico de y de la Antártida
Resistencia a arsénico. Se ha finalizado el estudio de las
bibliotecas metagenómicas de microorganismos
planctónicos del nacimiento del Río Tinto para la
búsqueda de nuevos genes de resistencia a arsénico.
Para ello, se ha probado si algunas de las proteínas que
se describieron en la memoria anterior, y que confieren
resistencia a arsénico, están también implicadas en
resistencia a otros tipos de estrés, concretamente
choque térmico, pH ácido y radiación UV. Se
estudiaron los clones que expresan la proteína
homóloga a la chaperona ClpB y las implicadas en
maduración de tRNAs, y se observó que las que
expresan ClpB presentan resistencia adicional a alta
temperatura y radiación, y las que expresan proteínas
de maduración de tRNAs son resistentes a uno o dos
tipos de estrés (temperatura y pH ácido, o radiación
UV).
Resistencia a condiciones hipersalinas. Se aisló DNA
procedente de muestras ambientales de las salinas de
Es Trenc (Mallorca) (colaboración con el Dr. Ramón
Rosselló-Móra –IMEDEA- y Josefa Antón Botella –
Universidad de Alicante-) un ambiente hipersalino
apropiado para aislar genes de resistencia a la sal. Se
construyeron tres bibliotecas metagenómicas utilizando
la cepa de Escherichia coli DH10B como huésped, que
contienen 7x105 clones recombinantes. Para facilitar la
detección de genes resistentes a sal, se transformó esta
biblioteca en una cepa mutante de E. coli MKH13, que
no sobrevive en concentraciones elevadas de sal. En un
escrutinio inicial se aislaron cuatro clones resistentes.
Los análisis de secuencia preliminares indican que tres
de estos clones son similares a Arqueas mientas que el
Resistencia a pH ácido. Se ha finalizado y publicado el
estudio de la búsqueda de nuevos genes implicados en
resistencia a pH ácido en los microorganismos de
rizosfera y fase planctónica del Río Tinto (Guazzaroni
et al., 2012). Se estudió la resistencia del clon que
expresa una posible chaperona a otros tipos de estrés,
como a metales y metaloides tóxicos presentes en el río,
elevada temperatura y radiación UV. Se observó que
esta chaperona es bastante específica de estrés por pH
ácido, aunque también confería resistencia a radiación
UV.
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Resistencia a bajas temperaturas. Se ha ampliado el
estudio de proteínas responsables de la adaptación de
los microorganismos psicrófilos al frío. Además de la
previamente identificada Heat shock protein 90
(Hsp90/HtpG), se ha estudiado el papel de otras HSPs
en la adaptación. Entre las más importantes se han
identificado DnaK, DnaJ, GroEL y GroES. Además, se
ha encontrado que otras proteínas involucradas en la
adaptación al frío de los microorganismos psicrófilos
son: proteínas relacionadas con la replicación y
traducción (elongation factor Tu, elongation factor Ts,
ribosomal proteins, etc.) y proteínas que se han
relacionado con el estrés oxidativo (SOD, Thiol specific
antioxidant, etc.).
Estudio de los mecanismos de regulación genética de
resistencia a la toxicidad y detoxificación de metales pesados
en algas del Río Tinto. Se han secuenciado mediante
Illumina bibliotecas transcriptómicas de cultivos de
Chlamydomonas y Dunaliella acidophilas aisladas de Río
Tinto en presencia de LD50 de Cu y Cd
respectivamente. Se identificó una fitoquelatina
sobreexpresada en los cultivos que crecieron en
presencia del metal y que no había sido previamente
identificada en estos géneros y que filogenéticamente
parece tener un origen bacteriano. Por otra parte, se ha
secuenciado una biblioteca metatranscriptómicas de
biofilms ambientales de Euglena mutabilis de Río Tinto
para poder identificar los principales genes implicados
en mecanismos de resistencia a metales pesados y como
afectan las condiciones ambientales extremas del río a
la actividad fotosintética de dichos
organismos.
Metabolismos microbianos que operan
en un permafrost reciente en la Isla
Decepción (Antártida)
En este estudio se analizó la
composición
de
la
comunidad
microbiana
y
los
metabolismos
operantes en la superficie y en el
permafrost de la Isla Decepción
(Antártida) mediante el análisis de
muestras naturales con un biosensor en
formato microarrays de anticuerpos. Las
muestras (hasta una profundidad de 4,2
m) se analizaron con LDChip300 (Chip
detector de Vida), un inmunosensor que
contiene más de 300 anticuerpos frente a
antígenos bacterianos y archaeas. Los
immunogramas mostraron reacciones
antígeno-anticuerpo positivos en todas
las muestras superficiales (líquenes,
piroclastos) y la capa superior del
permafrost. Los resultados indicaron la
presencia de exopolisacáridos, bacterias
que pertenecen a la alfa-, delta-y
Gammaproteobacteria,
Bacteroidetes,
Figura 1. Fotografía del sitio de perforación en Isla Decepción y detalle del
Actinobacterias
Gram-positivas
y
suelo (arriba). Muestra de testigo de permafrost con cristales grandes de agua
obtenido de 60-80 cm de profundidad (abajo izquierda) y un grupo de Firmicutes, así como especies de
más
probablemente
procariotas formado por bacterias (naranja) y archaeas (verde) del mismo archaeas,
Methanobacterium spp. Las reacciones
testigo detectadas por FISH.
positivas con anticuerpos revelaron la
presencia de proteínas y péptidos de la
Resistencia a bajas temperaturas, radiación y salinidad en fijación de nitrógeno (NifHD, GlnB, HSCA),
microorganismos de la rizosfera de plantas antárticas metanogénicas (McrB), de la homeostasis del hierro y
(Colobanthus quitensis y Deschampsia antartica). Se ha recuperación de hierro (ferritina y proteínas DPS), así
comenzado a identificar la diversidad microbiana de como los transportadores ABC, lo que indicaba que
estas comunidades en distintos compartimentos de estos procesos operaban en el momento del muestreo.
estas plantas, mediante estrategias de secuenciación Estos resultados fueron validados con otras técnicas de
masiva (pirosecuenciación) y se han construido dos ecología molecular, como microarrays de DNA,
bibliotecas metagenómicas con el DNA extraído. Se he secuenciación del gen rRNA 16S bacteriano, recuento
empezado a buscar genes que confieren resistencia a de viables aerobios y microscopía. Los resultados de
Ecología Molecular mostraron un patrón diferenciado a
salinidad y frío.
lo largo de la profundidad de la perforación, siendo la
capa activa superior la más diversa, con Acidobacteria,
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Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes y los
fotótrofos Cianobacteria y Chloroflexi como grupos
dominantes. Actinobacteria y Firmicutes eran
dominantes en las profundidades de 0,5 a 2 m, y
Betaproteobacteria de 3 a 4,2 m. El análisis geoquímico
reveló la presencia de ácidos orgánicos de bajo peso
molecular (acetato, formiato) que podría ser utilizado
por los microorganismos como fuentes de energía para
la reducción del sulfato, nitrato y de metales en
condiciones anaeróbicas. Mediante técnicas de tinción
fluorescente se detectaron consorcios microbianos
(Figura 1) de bacterias y archaeas, lo que indica la
existencia relaciones sintróficas que contribuyen a una
mejor adaptación al medio.
del todo el biofilm y que suele subir 0.5 puntos con
respecto al pH del agua que circunda el tapete. La
producción de oxígeno se concentra en los primeros
milímetros, disminuyendo drásticamente con la
profundidad. Asimismo se han realizado estudios
voltamétricos que nos han permitido analizar la
distribución de los diferentes metales pesados en el
interior de los biofilms. De esta manera podemos
conocer in situ el nivel de stress al que son sometidas
los diferentes organismos y que puede variar con
respecto a las condiciones ambientales de agua que les
rodea. Se ha observado que la concentración de metales
pesados parece aumentar con la profundidad del tapete
microbiano.
Estudio in silico sobre el sistema de transporte de
electrones en las bacterias oxidadoras de hierro de
género Leptospirillum
Caracterización de la actividad fotosintética y
productividad primaria de las principales especies
fototróficas y de los biofilms del Río Tinto
Las bacterias acidófilas chemolithoautotróficas, que
pertenecen al género Leptospirillum, sólo pueden
crecer con Fe (II) como donador de electrones y el
oxígeno como aceptor. Los miembros de este género
juegan un papel importante en la biolixiviación de
minerales de sulfuro. En colaboración con la Dra.
Gloria Levicán (Universidad de Santiago de Chile), se
utilizaron secuencias de los genomas casi completos de
Leptospirillum ferrooxidans (grupo I, secuenciada en el
CAB), Leptospirillum rubarum, Leptospirillum '5-manera
CG '(grupo II) y Leptospirillum ferrodiazotrophum (grupo
III) para identificar los citocromos que probablemente
están implicados en la cadena de transferencia de
electrones. Los resultados muestran la presencia de
genes que codifican una serie de citocromos tipo c (1820 genes fueron identificados en cada especie), así
como citocromos bd y cbb3 oxidasas. Los genes que
codifican cbb3 oxidasa se agrupan, con genes predichos
involucrados en maduración de proteínas cbb3. La
duplicación de los genes que codifican los cbb3 (genes
ccoNO) se detectó en los cuatro genomas.
Curiosamente,
estos
microorganismos
también
contienen genes que codifican potencialmente
complejos bc1 y similares a b6f organizados en dos
potenciales operones. Hasta la fecha, el género
Leptospirillum incluye los únicos organismos
reportados que tienen genes que codifican para dos
complejos bc diferentes. Este estudio proporciona una
visión detallada de los componentes de las cadenas de
transferencia de electrones de Leptospirillum spp.,
revelando su conservación entre los grupos de
leptospirilla, lo que sugiere que puede haber una sola
vía común para el transporte de electrones entre Fe (II)
y el oxígeno (Levicán et al., 2012).
No existe ningún estudio de este tipo en ambientes
extremos, y se han obtenido los primeros resultados en
diferentes biofilms aislados de Río Tinto, que indican
una gran adaptación por parte de estas especies a
condiciones de sombra y poca luz, lo cual podría tener
mucha relación con el intenso color rojo del agua en la
que habitan estos organismos lo que modifica en gran
medida la calidad de luz fotosintética que reciben.
Todas las especies analizadas presentan fenómenos de
fotoinhibición, lo cual difiere en gran medida de otras
especies fotosintéticas, las cuales se relacionan más
frecuentemente con procesos de fotosaturación. Este
tipo de estudios será de especial importancia en los
lagos ácidos, donde estos organismos fotosintéticos
pueden jugar un papel destacado en procesos de
biorremediación. Por otra parte, se ha empezado a
trabajar con los efectos que la radiación UV tiene en
este tipo de organismos y el posible papel fotoprotector
que el hierro u otros metales podrían tener sobre la
misma. Se ha medido la actividad fotosintética a lo
largo de ciclos diarios en diversos tapetes fotosintéticos
del río. Mediante el uso de diferentes filtros UVA UVB
y PAR, se observó que los organismos muestras una
gran fotoinhibición durante la mayor parte del día que
es completamente revertida cuando se elimina la
radiación UV. Se están estudiando tres bibliotecas
metatanscriptómicas a lo largo de un ciclo diario para
ver como afecta la radiación a este tipo de organismos.
Análisis de las condiciones microambientales en el
interior de biofilms fotosintéticos en condiciones
extremas de pH y métales pesados.
Se han empleado dos metodologías, microsonda de O2
disuelto, pH y potencial redox que nos permite
caracterizar microambientes al usar capilares de 10 µm
de diámetro. Estas microsondas, nos han permitido
comprobar que el pH permanece constante a lo largo
Plasticidad y evolución de genomas de extremófilos
Los elementos móviles del genoma y, en especial, las
secuencias de inserción, son claves en para
proporcionar dinamismo al genoma. La abundancia
relativa de secuencias de inserción en un genoma
refleja la historia reciente de un organismo y determina
su capacidad de adaptación a ambientes cambiantes. Se
han hecho estudios encaminados a determinar dos
aspectos de la biología de las secuencias de inserción en
gran
medida
desconocidos:
su
expresión
transcripcional y su capacidad de proliferación. Estos
estudios se han realizado en Acidiphilium sp., un
organismo acidófilo aislado del río Tinto y cuyo
genoma, secuenciado recientemente en el CAB,
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muestra una gran cantidad de elementos móviles. Para
estudiar los elementos móviles de manera global se
construyó un microarray de oligononuclótidos que
representaban todos los genes de transposasas
presentes en el genoma. Los resultados obtenidos
muestran que muchas transposasas se expresan de
manera constitutiva y endógena (independientemente
de los genes adyacentes), y que algunas secuencias de
inserción han proliferado (aumentado su número de
copias) durante el cultivo en el laboratorio de esta cepa
de Acidiphilium. Se ha observado que el aumento en
número de copias en algunas secuencias de inserción
correlaciona con la capacidad de estás de interaccionar
con la maquinaria de replicación de DNA del
hospedador.
Por otro lado se ha analizado la población de
elementos móviles presentes en comunidades
bacterianas acidófilas en el río Tinto. El DNA y el RNA
aislados se están estudiando mediante microarrays y
secuenciación masiva (metagenómica). RNA obtenido a
partir de muestras ambientales del río Tinto, se ha
analizado con un microarray de secuencias de inserción
de acidófilos, obteniéndose con éxito una visión global
del patrón de expresión de genes de transposasas. Se
detectó especialmente expresión de genes de
transposasas en Leptospirillum y Acidithiobacillus. Por
otro lado, mediante pirosecuenciación se han obtenido
secuencias que servirán como referencia de secuencia
obtenida por la técnica de Illumina, y que permitirá
obtener una visión global del comportamiento de los
elementos móviles en poblaciones naturales.
Mecanismos de transferencia génica horizontal en
poblaciones de Bacillus subtilis.
En un gran número de bacterias y arqueas se ha
descrito la capacidad de liberar al medio DNA (DNA
extracelular, DNAe), que además se ha detectado en
diversos ambientes naturales sin que se tenga claro su
función ecológica. Se ha concluido la caracterización de
la producción de DNAe mediante el estudio de la cepa
natural de B. subtilis 3610 (Zafra et al, 2012, María
Lamprecht, Tesis Doctoral 2012). La producción de
DNAe en B. subtilis está regulada por los mismos genes
que regulan la entrada en competencia, un estado
celular que permite la incorporación de DNA dentro de
la célula. La producción de DNAe podría ser otro tipo
de comportamiento, que permitiría compartir
información genética dentro de la población.
Desarrollo de sistemas de soporte de vida
Una forma posible de producir plantas con nuevas
capacidades tanto para sobrevivir en ambientes
extremos y/o contaminados así como para degradar o
acumular los compuestos contaminantes consiste en
modificarlas genéticamente. Durante este año se ha
continuado con la caracterización de las plantas de
Arabidopsis thaliana con genes de resistencia a pH ácido,
procedentes de metagenómica funcional (Guazzaroni et
al., 2012) (proteína DPS de unión a DNA, proteína de
unión a RNA, proteína con ACT la proteína HU,
semejante a histonas, y la chaperona ClpP. Se han
identificado líneas de estas plantas que presentan
mayor resistencia a pH ácido (Figura 2).
Figura 2. Crecimiento en medio líquido a pH 3.25 de plantas de Arabidopsis thaliana que portan genes de resistencia a
pH ácido obtenidos de microorganismos del Río Tinto y de plantas silvestres (wt). Se observa que las plantas
transgénicas pueden crecer normalmente a este pH ácido, en contraste con las plantas no transgénicas (wt) que
mueren.