TECNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN I.

FACULTAD CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS
LABORATORIO ASIGNATURA
DE BIOQUÍMICA. PLAN COMÚN
AGRONOMÍA E INGENIERÍA
FORESTAL
PRACTICO 5: TECNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN
I.-
INTRODUCCIÓN
La manipulación del ADN ha permitido, entre otras cosas, el desarrollo de la clonación de
secuencias de ADN para el estudio de mutaciones que estén involucradas en patologías ,
mapeo y secuenciación de genes con fines terapéuticos, desarrollo dela terapia genética,
análisis forenses y de paternidad. Las aplicaciones del ADN son múltiples, de manera que
las técnicas de laboratorio desarrolladas hasta la fecha para su estudio presentan una
infinidad de variantes. Entre estas tenemos:
A –1 ) Enzimas de restricción
Una enzima de restricción (o endonucleasas de Restricción) es una enzima que puede
reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y
cortar el ADN en ese punto en concreto llamado sitio o diana de restricción o en un sitio no
muy lejano a este, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y
12 pares de bases, con las que son reconocidos. La primera enzima de restricción la
descubrió en 1970 Hamilton Smith, en la Universidad de John Hopkins. La enzima fue
extraída de la bacteria Haemophilus influenzae y tiene la propiedad de romper el ADN del
fago lambda y de E. coli, pero no su propio ADN. Se le denominó Hind II. En las décadas
siguientes se ha descrito una gran variedad de enzimas de restricción con diversas
secuencias de corte para el ADN. El mecanismo de corte de DNA se realiza a través del
rompimiento de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, dando lugar a dos extremos de
DNA, que pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados
Ver figuras 1, 2 y 3
. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo ya que
los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que puedan haber en la cercanía
Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.
Restricción de SmaI dejando extremos romos.
Figura 1 Tipos de cortes cohesivos y romos
Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas
ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse
independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo
de vectores están los Plásmidos moléculas circulares de ADN halladas en las bacterias ,
entre estos vectores tenemos el plasmido pBR322.
Figura 2
Figura 3
A – 2) Plasmido pBR 322
Uno de los plásmidos usados como vector de clonación y mejor estudiado y más a
menudo utilizado para "propósitos generales" es el pBR322. Estos vectores de clonación,
en general, se denominan con la letra minúscula p (de plásmido) y alguna abreviatura que
puede ser descriptiva o, en el caso del pBR322, anecdótica. La BR son las iniciales de los
investigadores que crearon el plásmido (F. Bolivar y R. Rodríguez) y el 322 es una
designación numérica que tiene relevancia para estos investigadores. El plásmido pBR322
contiene 4361 pb. Contiene dos genes de resistencia a antibióticos: uno confiere resistencia
a ampicilina (Ampr) y el otro a tetraciclina (Tetr). Este plásmido contiene un único sitio de
corte Bam HI, Hind III y Sal I dentro del gen Tetr; un único sitio de corte Pst I en el gen
Ampr; y un único sitio de corte EcoRI que no está dentro de ningún DNA codificante.
También tiene un origen de replicación que funciona sólo en Escherichia coli. Este
plásmido se mantiene con un alto número de copias en Escherichia coli y no puede ser
transferido a otra bacteria.
Figura 4 Mapa del plasmido pBR322
B) La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en
inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1986
por Kary Mullis cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de
ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese
fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su
utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta
probabilidad virus o bacterias causante de una enfermedad, identificar personas (cadáveres)
o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la
amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el
consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Esta técnica se
fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN,
para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras
de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que
vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.. Puesto que las temperaturas
del ciclo (95 ºC en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata
desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas
de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de
los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus
(polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus
termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq)
con otras con corrección de errores (Pfu, Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado
termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Los tubos usados para PCR tienen
una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se
alcance rápidamente el equilibrio térmico. Por lo general, la PCR es una técnica común y
normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una
gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la
secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de
trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y
tests de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Para realizar la técnica se necesitan:
•
Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.
•
Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a
una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta
nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa
permitiendo iniciar la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
•
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como
cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. Actúan como
cofactores de la polimerasa.
•
Iones monovalentes, como el potasio.
•
Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la
ADN polimerasa.
•
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima
alrededor de 70ºC (la más común es la Taq polimerasa).
•
ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
•
Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una
de las etapas que conforman un ciclo.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de
temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos de temperaturas. La
PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos
a menudo están precedidos por un choque térmico a alta temperatura (> 90°C), y seguido
por otro final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las
temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de
parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de
iones divalentes y dNTPs en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores.
Los pasos de una PCR son:
•
Inicialización Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 9496ºC (ó 98ºC si se está usando una polimerasa termoestable extrema) sólo es
necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
•
Desnaturalización En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos
hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes
modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. La
temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo,
de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma..
•
Alineamiento/Unión del cebador A continuación se producirá la hibridación del
cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN
molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65ºC durante 20-40
segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de
hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman
cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La
polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar
ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser
amplificada.
•
Extensión/Elongación de la cadena Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN
molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como
soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una
nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP's
complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con
el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende).
La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la
Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad está en 75-80°C (comúnmente
72°C). El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de
la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla básica: en
su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.
•
Elongación Final Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74°C
durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier
ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
•
Conservación Este paso se lleva a cabo a 4-15°C durante un tiempo indefinido para
conservar la reacción a corto plazo.
Figura 5 Fases de una PCR
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas
de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga,
esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño:
típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en
acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a
marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamaño/s de los productos de la PCR
vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene
fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos
de PCR.
Tipos de PCR
1.
PCR anidada Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una
amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con
cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de
PCR es muy específica.
2. PCR in situ PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. La PCR
in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde
los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es
realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ
se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante
hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden
detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance
en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de
menor representación.
3.
PCR multiplex PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma
reacción. Emplea dos o más pares de primers en único tubo con el fin de amplificar
simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única
reacción todos pares de primers de los sistemas que queremos amplificar
simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades
suficientes. sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola
reacción, menor cantidad de templado para el análisis, menor cantidad de reactivos,
rápida construcción de base de datos.
4.
RT-PCR Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una transcriptasa inversa,
como Tth, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc
(ADN complementario).
5.
PCR tiempo real Reacción de PCR cuya principal característica es que permite
cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original.
Electroforesis
Se emplea para el análisis y purificación de fragmentos del ADN. Generalmente, se usan
dos tipos: de agarosa y acrilamida. La agarosa se emplea para separar fragmentos de ADN
con tamaños de 100 pares de bases hasta 20 kilobases. Los geles de acrilamida se usan en el
rango de >200 pares de bases. Si se necesita estudiar ADN de 1 000-2 000 kilobases, se
desarrolló la técnica conocida como electroforesis de campo pulsado. Un gel hecho de
agarosa está compuesto de polímeros. El grado de concentración de la agarosa en el gel se
seleccionará dependiendo del tamaño del fragmento de ADN por estudiar. El ADN al tener
carga negativa si se coloca bajo un flujo eléctrico, migrará hacia el polo positivo, donde la
rapidez de este movimiento dependerá del tamaño de la molécula de ADN. Los geles sirven
como soporte para que el ADN migre hacia el polo positivo y ayudan a separar las
moléculas del ADN con base en su tamaño. Las bandas del ADN o fragmentos de un
determinado tamaño pueden observarse en estos geles al intercalar moléculas de bromuro
de etidio. El bromuro de etidio se une al ADN y emite una coloración naranja cuando se
coloca en un transiluminador con luz ultravioleta ver figura 6.
Figura 6 Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
II.-
OBJETIVOS.
Objetivo General.
•
Identificar mediante electroforesis en geles de agarosa fragmentos amplificados por
PCR de tejido vegetales y obtenidos de la digestión enzimática del plásmido
pBr322.
Objetivos específicos.
•
Amplificar mediante PCR de genes vegetales.
•
Cortar mediante Enzimas de Restricción el plásmido pBr 322
•
Identificar y caracterizar los fragmentos y marcadores genéticos obtenidos.
III
PARTE EXPERIMENTAL.
1.-
Reactivos y Muestras.
2.-
•
Agarosa grado Biología Molecular.
•
Buffer TBE 1X y 0.5 X.
•
H2O destilada estéril.
•
DNA obtenido en paso práctico N°4.
•
Plasmido pBr322
•
Enzima EcoR1
•
Buffer 10X
•
MgCl2 (25 mM)
•
Taq Polimerasa
•
dNTPs 10 mM
•
Materiales.
Tubos Eppendorf 1.5 y 0.6 ml.
•
Microcentrifugas
•
Balanzas analíticas.
•
Termociclador.
•
Cámara de electroforesis.
•
Fuentes de poder.
•
Matraz enlermeyer 100 ml
•
Probeta 100 ml
3.-
PROCEDIMIENTO
3.1-
Protocolo de amplificación por PCR.
El profesor preparó dos tubos con los siguientes volúmenes
Tubo Control
Tubo 1 DNA
µL
µL
Buffer 10X
5
5
MgCl (50 mM)
2
2
dNTPs (10 mM)
1
1
Primer F 10 mM
2
2
Primer R 10 mM
2
2
Reactivos
Taq 1U/Ul
1
1
Agua destilada
32
32
Volumen Final
50
50
0
5
DNA Vegetal
Llevó al termociclador y aplicó el siguiente programa:
Proceso
Iniciación
Desnaturación
Alineamiento
Elongación
Ciclos
Elongación Final
Conservación
Temperatura y tiempo
94°C 5 min
94°C 1 min
62°C 1 min
72°C 1 min
35
72°C por 5 min
4°C por 10 min
NOTA: Por motivos de tiempo solamente se entregaran las muestras amplificadas del
PCR, pues el protocolo dura mas de 3 horas, por lo cual el profesor lo realizará.
3.2 Corte con Enzimas de Restricción del plasmido pBR322
El profesor preparo dos tubos con los siguientes volúmenes
Reactivo
Buffer 10 X
Enzimas
Restricción.
Agua Destilada
Plamido pBR322
Tubo
control
1μL
1 μL
Tubo 1
7 μL
0 μL
7 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1. Incubar 30 min a 37°C
3.3-
Resolución de los fragmentos del plásmido mediante electroforesis.
1. Tome con guantes el molde de metacrilato y sellelo con cinta adhesiva en los
extremos según la figura 7
2. Pese 0,60 gramos de agarosa y disuélvalos en 60 ml de tampón TBE (1X) para
preparar un gel al 1,0 % p/v.
3.
Caliente en el mechero la solución de agarosa cuidando que no ebulle hasta que
quede la solución completamente transparente, use guantes de seguridad
4. Agregue la solución al molde y ponga la peineta sin tocar el fondo según figura 7
5.
Una vez polimerizado el gel proceda a depositarlo en la cámara de electroforesis
,cúbralo con la solución tampón de corrida (TBE 0,5X) y saque la peineta.
6. Utilice como indicador de peso molecular Ladder 1Kb. Deposite 2 µL en el primer
carril.
7. Cargue 5 μL del DNA amplificado por PCR y deposite más 4 µL de buffer de
corrida en un tubo Eppendorf.
8. Repita lo mismo con el control negativo de la digestión y con el DNA digerido de la
digestión enzimática.
9.
Deposite el contenido de cada DNA con su colorante en pocillos independientes en
el gel.
10. Posteriormente proceda a la electroforesis, que se efectuará a 100 volts, hasta que el
frente de migración se resuelva en el 50% de la longitud del gel.
11. Revele el gel en una solución de BROMURO DE
ETIDIO al 0,4%v/v por 10
minutos
12. Los resultados obtenidos, según el caso, serán reproducidos en fotografías Polaroid,
para su posterior análisis.
Figura 7 Elaboración de un gel de electroforesis
Bibliografia
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3.
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