Espectroscopía de emisión molecular - Aplicaciones Relacion experimental entre la fluorescencia y la concentración φf = Q = fotones emitidos / fotones absorbidos = If / Iabs Iabs = Iinc· (1 - T) = Iinc·(1 - 10-A) = 1 - 10-εlc If = φf ·Iabs = φf ·(1 - 10-εlc) si εlc → 0 ; (1 - 10-εlc) → 2.303 εlc Y por lo tanto, If = 2.303 φf Iinc εlc la aproximacion se cumple al 5% si A < 0.05 1 Métodos de análisis Directos: para cuantificar un analito ya fluorescente Indirectos: a) por formacion de complejos fluorescentes entre el analito y una molecula auxiliar. b) por reaccion química que forma un compuesto fluorescente. c) por disminucion de la fluorescencia (quenching) debido a la presencia del analito. Metodos directos: Los iones de lantánidos y actinidos suelen mostrar fluorescencia. P.ej. Ce, Pr, Nd, U, etc. Ce (III) λex = 260nm, λem = 350 nm. U(VI) λex = 520nm, λem = 620 nm. Algunas moleculas de interes biomédico presentan fluorescencia. P. ej. Riboflavina (vitamina B12), NADH, FAD/FADH2, clorofila, aminoacidos aromáticos, porfina, etc 2 Metodos indirectos: a) iones inorgánicos por formacion de complejos fluorescentes Ca2+ dependent fluorescence emission spectra of fluo-3 Familia del Calcium Green EDTA 3 Determinación de calcio • Calceina (λex = 450 nm, λem = 520 nm). • fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Calcium Green-1. • -Ondas de concentración de Ca2+ en ovocitos, asociados con la meiosis. Function and characteristics of repetitive calcium waves associated with meiosis, Alex McDougall and Christian Sardet, Current Biology 1995, 5:318-328 Metodos indirectos: b) moléculas orgánicas por reacción química - aminas λex = 390 nm, λem = 475 nm - aminoácidos - proteínas λex = 340 nm, λem = 455 nm (Y en combinacion con HPLC) 4 Metodos indirectos: b2) actividad enzimática Metodos indirectos: c) por quenching de fluorescencia Complejo de Zr-alizarina excitation 470 nm (azul) emision 520 nm (verde) Sensibilidad al F- 0.001 ug/ml Interferentes: Be, CO, Cr, Cu, Fe, Ni, Th, etc. Cu2+ Fe3+ Ni2+ Pb2+ F- Bathocuporine Rhodamine B Na(PAN) Eosin Alizarina 6x10-3 ppm 2x10-3 ppm 6x10-5 ppm 1x10-1 ppm 1x10-3 ppm 5 Quenching estatico La emision decae con la concentración de quencher. Sistemas de medición sensores 6 7 Sanguchitos de cubreobjetos rellenos con una solución 10 mM de [Ru(bpy)3]Cl2, sumergido en agua dentro de una capsula de Petri. Las fotos se toman a traves de un filtro anaranjado que deja pasar solamente la fluorescencia, se divide pixel a pixel por la iluminacion de excitacion correspondiente a cada punto, se usa la curva de calibracion de Temperatura vs. fluorescencia y se muestran en falso color con ImageJ, despues de aplicar un filtro gaussian de 5 pixeles. (a) Durante el calentamiento se ve un gradiente de temperatura de 1 grado aprox. (b) Placa sin calentamiento, termalizada, se ven variaciones maximas de 0.18 ºC Video de un sanguchito de cubreobjeto de 22 x 18 mm durante el calentamiento 8 Optodos en el mar Negro 9 Ver el video de las variaciones en el tiempo en: http://www.mpi-bremen.de/Binaries/Binary14293/black_sea_fluctuations.gif Límites analíticos de la técnica Tiempos caracteristicos de emision: 10-9 - 10-8 s Repeticion posible de emision: 108 - 109 fot/s/molec Con instrumental adecuado se detecta una MOLECULA UNICA. 10 “Single molecule fluorescence” F1FO ATP Synthase: F1FO-ATPase: ATP ADP + Pi ATP ADP + Pi V H γ time Stepping rotation of F1-ATPase visualized through angle-resolved single-fluorophore imaging. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jun 20;97(13):7243-7 Adachi K, Yasuda R, Noji H, Itoh H, Harada Y, Yoshida M, Kinosita K Jr. 11 La emision del fluoroforo Cy3 pegado a la subunidad γ de la ATPasa cambia la polarizacion al rotar en pasos de 120 grados. Cada paso implica la hidrolisis de una molecula de ATP. Secuenciacion de DNA 12 Excitacion en 2 fotones Se precisa mucha potencia ... Absortividad en 2P es muy baja : 1-100 GM (10-50 cm4s-1fot-1) Asi que la densidad de luz debe ser enorme I ~ 1030 fot.cm-2s-1 Pinst ~ 100 GW/cm2 13 Corrimiento anti-stokes Excitacion 800 nm Emission 630nm 14 seccionamiento seccionamiento 15 Upconversion Upconversion core = NaYF4 - 2% Er3+ - 30% Yb3+ shell = NaYF4 16 Tinta de seguridad Fluorometro con fibra optica 17 Punta de la fibra Espectro de emision 18 Deteccion de DNA Espectroscopía de emisión molecular - Conclusiones - la espectroscopía de emisión presenta muy alta sensibilidad analítica. - es posible aumentar la selectividad de la técnica mediante métodos adecuados. - los equipos tradicionalmente fueron caros, pero su costo está bajando muy rapidamente. - es posible hacer medidas de buena calidad con instrumental de campo basado en equipos de uso masivo (cámaras, celulares, etc) - la microscopía de fluorescencia permite no sólo la detección sino la medición de parámetros químicos y físicos con alta sensibilidad y robustez. 19