Primera parte: Observación de mutaciones alares en

Primera parte:
Observación de mutaciones alares en
Drosophila melanogaster
Departamento de Genética y Microbiología
Departamento de Genética i Microbiología
helena.montanuy@uab.cat
Alba.Garcia.Rodriguez@uab.cat
Curso 2015-2016
Curso
2014-2015
Universitat
Autònoma
de Barcelona,
Universitat
Autònoma
de Barcelona,
Cerdanyola del Vallès
Cerdanyola del Vallès
OBJETIVOS
Introducción al ensayo de mutación y recombinación somática SMART para la
evaluación de posibles efectos genotóxicos de agentes químicos o físicos.
Observación de fenotipos en alas de D. melanogaster debido a distintos eventos
mutacionales.
Estudiar la importancia de efectos biológicos que pueden inducir la expresión
de alelos mutantes.
INTRODUCCIÓN
Para esta práctica hay tres conceptos básicos a tener en cuenta: Genotoxicidad,
daño en el DNA y mutación.
Genotoxicidad; Capacidad de un agente físico o químico para
DNA.
dañar el
Daño en el DNA; Lesiones en la molécula de DNA como roturas o
modificaciones químicas. Ejemplos:
- Roturas de cadena simple o de doble cadena.
- Modificaciones químicas en las bases nitrogenadas por mecanismos como
oxidación, alquilación, etc.
Existen muchos agentes genotóxicos, unos más potentes que otros, por ejemplo, la
luz ultravioleta puede causar hasta 1x10⁵ lesiones por día (Hoeijmakers, 2009).
También, se ha estimado que el humo del cigarrillo causa 1000 lesiones en el DNA
por célula (Phillips et al., 1988)
Figura 1. Colección de tipos de daño del DNA (Modificado de Lord y Ashworth, 2012)
Mutación:
Cambio en la secuencia del DNA.
Ejemplo 1:
La secuencia de DNA en una célula es: … ATGCCTGAA...
Sin embargo, después de la división celular las células hijas presentan una
modificación en dicha secuencia:
… ATGGCTGAA...
Ha ocurrido un cambio en la cuarta posición de la secuencia; donde había
citocina (C), ahora hay guanina (G).
Ejemplo 2:
… ATGCCTGAATGCTGCGGAA (secuencia original)
… ATGGCTGCGGAA (secuencia en la descendencia, que ha perdido
bases, indicadas con negrita en la secuencia original)
7
El daño en el DNA no se considera una mutación, sin embargo, se debe tener
en cuenta que el daño en el DNA incrementa la probabilidad de aparición de una
mutación.
Ensayo de mutación y recombinación somática
(SMART)
Los ensayos de mutación y recombinación somáticas en D. Melanogaster son ensayos in
vivo que permiten la detección rápida y barata de agentes genotóxicos. Se basan en la
detección y cuantificación de eventos mutacionales y recombinacionales en células
somáticas de un organismo eucariota.
Se han descrito dos sistemas de ensayo diferentes, uno que emplea marcadores de las
alas (Graf et al.,1984) y el otro que emplea marcadores que afectan a la pigmentación de
los ojos (Vogel y Zijlstra, 1987).
Estas pruebas se basan en la pérdida de heterocigosidad de los genes normales en las
células de los discos imaginales de las larvas, lo que causa la formación de clones o
sectores de células mutantes, expresándose fenotípicamente en clones mutantes en las
alas o en los ojos de las moscas adultas.
Así, el ensayo SMART permite determinar, de manera rápida, el potencial de un agente
químico o físico para inducir la pérdida de la heterocigosidad (LOH, del inglés Loss of
Heterozygosity).
La pérdida de heterocigosidad (LOH) es un mecanismo genético por el cual una
célula somática heterocigota pasa a un estado homocigoto o hemicigoto debido a
la pérdida del otro alelo en el cromosoma homólogo
(Happle, 1999). De esta
manera, puede llevar a la expresión de alelos recesivos (Figura 2).
Una célula puede sufrir la pérdida de heterocigosidad debido a una mutación génica, reordenamiento cromosómico, rotura cromosómica o pérdida cromosómica. (Rodrigues de
Andrade et al., 2004)
Figura 2. La pérdida del alelo silvestre (A, en nuestro ejemplo) de una célula heterocigota permite
que la expresión del alelo recesivo (a) sea evidente en el fenotipo.
SMART en alas (wing spot test)
Este ensayo fue desarrollado por Graf et al, (1984) y constituye el único ensayo descrito
que utiliza marcadores de alas para el estudio de mutación y recombinación somática.
Este ensayo se lleva a cabo sometiendo a larvas de Drosophila melanogaster a una
exposición con el agente a evaluar (por ejemplo, diferentes concentraciones de un
compuesto químico).
En el interior de la larva existen poblaciones celulares llamadas discos imaginales
que durante la metamorfosis darán lugar a las diferentes estructuras de la mosca
adulta, como ojos, antenas, patas, etc. (Figura 3).
Figura 3. Los discos imaginales se encuentran dispuestos en el interior de la larva. Se indican
las
estructuras que darán lugar en el individuo adulto (Morgan, D. (2007). The Cell cycle: principles of control)
Si durante los ciclos de división mitóticos el agente a evaluar es capaz de dañar el
DNA de las células que forman los discos imaginales se generaran m utaciones en
los alelos silvestres, de modo que se puede esperar la expresión de los alelos
recesivos de los genes marcadores.
La(s) células(s) que sufran la pérdida de heterocigosidad darán origen a un clon
celular de tipo mwh o flr3 siendo visibles en la superficie del ala de un individuo adulto
en forma de sectores o spots (Figura 4).
La mutación mwh se ubica en el cromosoma 3, es recesiva, su origen es espontáneo y
resulta viable en homocigosis. Su manifestación fenotípica se caracteriza por la aparición
de tres o más tricomas en cada célula alar en lugar de uno por célula, que es el fenotipo
normal.
La mutación flr3 está situada también en el cromosoma 3, es recesiva y originalmente se
obtuvo por tratamientos con metanosulfonato de etilo; produce letalidad en homocigosis en
la línea germinal, pero no en las células somáticas. El fenotipo es bastante variable ya que
se pueden observar desde pelos cortos, gruesos y deformes, hasta pelos amorfos con
aspecto globular.
Figura 4. Dentro de las circunferencias se muestran los sectores o clones mutantes en la superficie del
ala. Note el la diferencia con los pelos normales alrededor del clon. (Rodrigues de Andrade et al, 2004)
La aparición de sectores simples (mwh o flr3) indican la ocurrencia de una mutación
puntual, una alteración cromosómica o recombinación mitótica. Los sectores
simples se dividen en sectores pequeños (1 ó 2 células mutantes) y sectores
grandes (3 ó más células mutantes). Los sectores pequeños se producen durante
los últimos ciclos mitóticos en la pupa, mientras que los sectores grandes lo hacen
en la etapa larvaria (etapa de ingestión del alimento). Sin embargo, estas
diferencias no son completamente exactas debido a las variaciones en el tiempo
de desarrollo, a las diferentes propiedades farmacocinéticas de los agentes
(ingestión, transporte, bioactivación, tasa de excreción, etc.) o, incluso porque ciertos
clones pueden tender a permanecer pequeños (Graf et al,1984).
Los sectores dobles (clones mwh y flr3 adyacentes) aparecen únicamente
debido a recombinación mitótica, por lo que indican la acción recombinogénica de
un compuesto evaluado (agente químico o físico).
El número total de clones inducidos
en un grupo de individuos (larvas) permite
obtener datos cuantitativos en relación a la actividad genotóxica total del compuesto,
mientras que el tipo y tamaño de los clones pueden revelar los mecanismos
mutacionales involucrados en la producción del clon (Figura 5).
Figura 5. Mecanismos que explican la aparición de los diferentes sectores mutantes en el ala (Graf et al,
1984)
Observación microscópica
1. Anotar y numerar la disposición de las alas en la lámina portaobjetos.
2. Colocar la lámina con el extremo biselado hacia la derecha de la platina.
3. Buscar y centrar la primera ala del extremo superior izquierdo utilizando el
objetivo de 10 aumentos (10X)
4. Identificar los sectores en los que se divide el ala.
Figura 6. Ubicación aproximada de las alas en la lámina portaobjetos.
Figura 7. El ala se divide en 7 sectores.
Teniendo en cuenta la línea vertical en la figura, la parte del ala que se encuentra
a la izquierda, presenta pelos pequeños que no permiten observar la presencia
de los fenotipos flr o mwh.
5. Girar el revólver del microscopio hacia el de 40 aumentos (40X)
6. Obsérvese minuciosamente cada uno de los sectores del ala siguiendo el
orden establecido en el paso 7.
7. La observación microscópica para cada ala se realiza desde el sector A
hasta el E desplazándose como se indica a continuación:
Si se está evaluando la capacidad genotóxica de un agente, se realiza una
comparación entre los grupos de tratamiento (que fueron sometidos a diferentes
dosis del agente) con respecto a un grupo control (que no fue sometido al agente).
Bibliografía
Graf U., Wurgler F.E., Katz A.J., Frei H., Juon H., Hall C.B., Kale P.G. (1984)
Somatic mutation and recombination test in Drosophila melanogaster. Environ.
Mutagen., 6: 153-188.
Rodrigues de Andrade H.H., Reguly M.L., Lehmann M. (2004) Wing somatic
mutation
and
recombination test.
En: Drosophila Cytogenetics Protocols.
Henderson D.S. ed. Humana Press. 389-412.
Happle R. Loss of heterozygosity in human skin. J Am Acad Dermatol. 1999
Aug;41(2 Pt 1):143-64. Morgan, D. (2007) The Cell cycle : principles of control.
London. New Science Press.
Hoeijmakers JH. DNA damage, aging, and cancer.
8;361(15):1475-85.
N Engl J Med. 2009 Oct
Phillips DH, Hewer A, Martin CN, Garner RC, King MM. Correlation of DNA adduct
levels in human
lung with cigarette smoking. Nature.
1988 Dec 2229;336(6201):790-2.
Lord CJ, Ashworth A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 2012
Jan 18;481(7381):287-94.
Segunda parte.
Observación de cromosomas humanos
OBJETIVOS
Observar la morfología y número de los cromosomas humanos usando una
metodología de tinción convencional.
Conocer las ventajas y desventajas de las técnicas citogenéticas y su
aplicación en la clínica y en la investigación.
INTRODUCCIÓN
Los cromosomas (del griego, chroma, color y soma, cuerpo) son las estructuras en
que se organiza la cromatina nuclear y que tienen una expresión dinámica en
las distintas fases del ciclo celular.
En la mitosis estas estructuras comienzan un proceso de compactación que
alcanza su máximo nivel en la metafase. Los cromosomas se tiñen fácilmente
cuando están condensados y pueden ser individualizados con el microscopio
óptico.
Cada cromosoma contiene una molécula de ADN lineal asociado a distintas
proteínas y el contenido de genes es variable aunque está en relación con su
tamaño. Por eso, cualquier alteración en el número o la estructura de los
cromosomas puede ser causa de enfermedades. Para la detección de estas
alteraciones se desarrollaron numerosas técnicas y todas ellas requieren de un
observador entrenado que las interprete.
La citogenética es la rama de la biología que se encarga del estudio de la
estructura, organización
y función
de
los cromosomas, así como de sus
anomalías.
Los avances en las técnicas de biología molecular han permitido establecer el
desarrollo de la citogenética molecular, sin embargo la citogenética convencional
acompaña siempre de forma paralela los nuevos estudios.
Cariotipo
Los humanos tenemos un número total de 46 cromosomas y este número varía
según las especies. Los 46 cromosomas están constituidos por 23 pares de
homólogos y cada miembro del par proviene de un progenitor. El cariotipo es
el conjunto cromosómico de un individuo que se puede conocer por medio de la
fórmula cromosómica o de una imagen que muestra los cromosomas, conocida
como cariograma.
Los cariotipos se pueden informar presentando todos los pares cromosómicos
ordenados de acuerdo a su tamaño, que en un principio eran recortados de la
fotografía de una metafase, y ahora se pueden hacer con analizadores
automáticos. De los 23 pares, el par de cromosomas sexuales se señala por
separado para indicar el sexo del individuo. Para citar el cariotipo de un
individuo se indica primero el número total de cromosomas y seguidamente los
componentes del par sexual precedido de una coma. Así, el cariotipo normal de
un varón se escribe 46,XY y el de una mujer 46,XX. Las anomalías
cromosómicas son una causa más importante de abortos espontáneos, retardo
mental y malformaciones.
Ejemplos:
1. El cariotipo de un varón con un cromosoma 21 adicional se describe con la
siguiente fórmula: 47,XY,+21
(Trisomía 21)
2. Una célula que presenta 45 cromosomas, siendo un cromosoma 4 el que
ha perdido, se describe: 45,XY, -4
(Monosomía del cromosoma 4).
Las normas para la descripción del cariotipo se encuentran en el manual
ISCN (en la bibliografía se cita la versión 2009).
Cromosomas metafásicos
Durante la interfase del ciclo celular, los cromosomas se mantienen sin dividirse y
sin un grado de condensación elevado. Sin embargo, después de la fase S (síntesis
de DNA) y al iniciar la etapa de división celular, el grado de condensación es mayor. Al
alcanzar la etapa de metafase, los cromosomas se encuentran en su máximo
grado de organización y es en esta etapa donde pueden ser fácilmente visibles al
microscopio óptico bajo una tinción con un colorante básico.
Cada cromosoma metafásico está constituido por dos cromátides unidas por el
centrómero. Este centrómero o constricción primaria divide al cromosoma en dos
brazos que se designan p (pequeño) para el brazo corto y q para el brazo largo.
De esa manera, por ejemplo, 7p es el brazo corto del cromosoma 7; e Yq es el
brazo largo del cromosoma Y.
La posición del centrómero nos permite clasificar a los cromosomas en tres tipos
principales:
1. Metacéntricos: cuando el centrómero es más o menos central y los brazos
son de aproximadamente igual longitud.
2. Submetacéntricos: cuando el centrómero está alejado del centro y los
brazos son desiguales.
3. Acrocéntricos: cuando el centrómero está cerca de uno de los extremos y
uno de los brazos es muy corto.
Sobre alteraciones en los cromosomas
Existen cuadros clínicos asociados a un número diferente de 46 en la especie
humana, por ejemplo (probablemente los más conocidos):
47,XX,+21 o 47,XY,+21 está asociado al síndrome de Down.
45,X
Síndrome de Turner.
47, XXY
Síndrome de Klinefelter.
47,XX,+13
Síndrome de Edwards
47,XX,+18
Síndrome de Patau
Existen alteraciones en la morfología de los cromosomas que también están
asociadas a otros cuadros clínicos, por ejemplo, el Síndrome de Lejeune (cri du chat
/maullido de gato). Las personas con este síndrome presentan una deleción
(pérdida) de una parte del brazo p de uno de los cromosomas 5 (46,XX,5p- ó
46,XY,5p-).
Un
espectro
amplio
de
alteraciones
numéricas
y
estructurales
de
los
cromosomas son frecuentemente observadas en células cancerígenas.
En la especie humana, no todas las alteraciones en la morfología de los
cromosomas están, asociadas a un
cuadro clínico.
Por ejemplo, la región
pericéntromérica (alrededor del centrómero) de los cromosomas 1, 9 y 16, así como
el brazo q del cromosoma Y suelen tener diferencias de tamaño entre los individuos.
Estas variantes se encuentran en un porcentaje mayor al 1% en la población por lo
que se definen como polimorfismos cromosómicos.
El bandeo cromosómico
Con la técnica convencional de tinción con Giemsa los cromosomas se tiñen
intensamente y de forma homogénea y se los puede contar y agrupar por su
aspecto general y eso era lo único que se podía hacer en los primeros cariotipos.
La identificación de cada cromosoma vino posteriormente con las técnicas de
bandeo. Estas técnicas que generan bandas transversales permiten definir a cada
cromosoma y estudiar su estructura. Cada cromosoma tiene del patrón de bandas
característico y existen varias técnicas de tinción con fines específicos (Tabla I).
El bandeo G es el más utilizado en citogenética clínica.
El bandeo G se logra con un tratamiento controlado con tripsina antes de la
coloración con Giemsa y produce bandas claras y oscuras en los cromosomas.
Las bandas oscuras contienen ADN rico en bases A-T que replica tardíamente y
son pobres en genes constitutivos y las bandas claras contienen ADN rico en G-C
que replica tempranamente y tienen muchos genes constitutivos. Cuando un
cromosoma está más elongado puede mostrar un mayor número de bandas y
esto se aprovecha para estudiarlo con mayores detalles. Esta metodología que
permite buscar alteraciones estructurales mínimas se conoce como bandeo de
alta resolución y se logra sincronizando el cultivo y con preparaciones hechas en
profase o prometafase, es decir, antes que los cromosomas alcancen su
compactación máxima.
Figura 1. Cromosomas humanos con tinción homogenea de Giemsa (a) y tinción por Bandas G (b).
Observación microscópica
Una vez colocada la lámina portaobjetos en la platina del microscopio, desplace la
misma de manera que el objetivo de 10X (16X en algunos microscopios) permita la
observación de la primera gota desde la izquierda de la lámina como se muestra
en la figura siguiente.
●
● = Lugar aproximado para iniciar la observación microscópica
Mueva el revólver del microscopio para el uso del objetivo de 40X. Observe a través
de los
oculares y desplace la platina cuidadosamente como se indica a
continuación con la finalidad de encontrar placas metafásicas.
Una vez encontrada una placa metafásica, desplace el revólver del microscopio de
tal manera que lo que desea observar en la lámina portaobjetos se encuentre
entre los objetivos de 40X y 100X. Coloque una gota mínima de aceite de inmersión
en la zona que se desee visualizar. Mueva el objetivo de 100X hacia la gota y
enfoque moviendo suavemente el tornillo micrométrico.
Cuente el número de c romosomas.
Identifique la morfología de los cromosomas observados al microscopio
usando como guía la descripción de la Figura 1 Morfología de los cromosomas
metafásicos.
p
s
c
q
Metacéntrico
Submetacéntrico
Acrocéntrico
Figura 2. Morfología de los cromosomas metafásicos
cro: c romátida. (Cada cromosoma metafásico presenta dos cromátidas hermanas)
p: brazo p
q: brazo q
c: centrómero (cada cromátida presenta una secuencia centromérica)
s: satélite. Los satélites corresponden a regiones involucradas en la organización
del nucleolo. Estas regiones se condensan tardíamente por lo que es posible
observar una fibra de cromatina en cromosomas metafásicos.
Bibliografía
Lewis (2003) Human
Genetic: Concepts and
Applications, 5th
Edition. The
McGraw−Hill.
Guerra, MS. Reviewing the chromosome nomenclature of Levan et al. Rev. Bras.
Genet. 1986, 9: 741-743.
ISCN
2009:
International
System
for
Human
Cytogenetic
Nomenclature:
Recommendations of the International Standing Committee on Human Cytogenetics
Nomenclature. Lisa G. Shaffer (Author, Editor), Marilyn L. Slovak (Editor), Lynda J.
Campbell (Editor)
Harper, Peter S. First years of human chromosomes: the beginnings of human
cytogenetics. Bloxham: Scion, 2006