FECUNDACIÓN Una vez liberados los ovocitos y los espermatozoides están destinados a morir en minutos o en horas a no ser que ellos se encuentren y se fusionen dando comienzo al proceso de fecundación. Mediante la fecundación el ovocito y el espermatozoide son salvados: el ovocito es activado para comenzar su programa de desarrollo y los núcleos haploides de los dos gametos se fusionan para formar el núcleo diploide de un nuevo organismo. La fertilización fue originalmente estudiada en invertebrados marinos tales como erizo de mar y estrella de mar la cual ocurre en el agua de mar luego de liberado un alto número de ovocitos y espermatozoides. La fecundación externa es más fácil de estudiar que la fecundación interna que ocurre en el tracto femenino de las hembras luego de la cópula, como por ejemplo, en los mamíferos. Sin embargo, a finales de 1950 se logró fecundar de ovocitos de mamífero in vitro abriendo el camino al estudio de los eventos celulares y moleculares que ocurren en el inicio del desarrollo de este grupo. En esta sección nos centraremos en la fertilización en mamíferos. Consideraremos primero la maduración del espermatozoide que ocurre en el tracto femenino. Luego analizaremos el primer contacto del espermatozoide con el ovocito (zona pelúcida) lo cual desencadena la reacción acrosómica, necesaria para que el espermatozoide atraviese la zona y se fusione con el ovocito. Luego estudiaremos la fusión de las membranas plasmáticas del ovocito y del espermatozoide. Después discutiremos cómo la fusión del espermatozoide activa el ovocito y cómo ocurre la fusión de los núcleos de los dos gametos para originar el cigoto y así completar la fertilización. El espermatozoide eyaculado es capacitado en el tracto reproductor femenino De los 300.000.000 millones de espermatozoides eyaculados durante el coito solamente 200 alcanzan el lugar de la fertilización en el oviducto. Una vez que un espermatozoide 1 alcanza el huevo debe migrar a través de la capa de células foliculares que rodea al ovocito y luego unirse la zona pelúcida y atravesarla. Finalmente el debe unirse a la membrana plasmática del ovocito y fusionarse con ella. Para ser competentes en estas funciones normalmente los espermatozoides eyaculados de los mamíferos tienen que ser modificados a su paso por el tracto genital femenino, en un proceso llamado capacitación. En humanos esta lleva de 5 a 6 hrs. y termina cuando los gametos masculinos entran en el oviducto. El espermatozoide sufre cambios bioquímicos y funcionales, incluyendo cambios en las glicoproteínas, en los lípidos, en los canales iónicos de la membrana plasmática y en su potencial de reposo, el cual cambia a valores más negativos quedando la membrana hiperpolarizada. La capacitación también está asociada con un aumento en el pH intracelular, fosforilación de las tirosinas de varias proteínas y el desenmascarado de varios receptores de membrana que necesita el espermatozoide para unirse a la zona pelúcida. La capacitación altera dos aspectos cruciales del comportamiento de los espermatozoides: aumenta sustancialmente la movilidad del flagelo y lo habilita para la reacción acrosómica. La capacitación puede ocurrir in vitro en un medio adecuado y es un paso fundamental para fertilización in vitro. Hay tres componentes críticos que deben estar presentes en el medio, albúmina, Ca2+ y HCO3−, ya que están en altas concentraciones en el tracto reproductor femenino. La albúmina participa en la extracción del colesterol de la membrana plasmática del espermatozoide, aumentando así la capacidad de esta de unirse a la membrana de la vesícula acrosómica durante la reacción acrosómica. Los iones Ca2+ y HCO3− entran en el citoplasma del espermatozoide y activan la enzima adenilato ciclasa que produce AMPc, el cual propicia la mayoría de los cambios que ocurren en la capacitación. 2 El espermatozoide capacitado se une a la zona pelúcida y se desencadena la reacción acrosómica Durante la ovulación los ovocitos de mamífero son liberados de los ovarios en la cavidad peritoneal cerca de la entrada del oviducto, y rápidamente son barridos hacia el. Ellos están cubiertos por una capa células (corona radiada) que están embebidas en una matriz extracelular rica en ácido hialurónico. Dichas células participan en el ingreso del ovocito en el oviducto y secretan una señal química que atrae el espermatozoide, dicha señal aun no está identificada. Una vez que el espermatozoide llega al óvulo, éste debe atravesar la corona radiada y lo hace con la enzima hialuronidasa, que porta en su membrana plasmática. Luego se unirá a la zona pelúcida (figura 1). La zona pelúcida (cubierta vitelina) actúa como barrera para la fecundación cruzada entre especies, por ejemplo un espermatozoide humano sólo puede fecundar un ovocito de hámster si a éste se le ha quitado la zona pelúcida, sin embargo en esos embriones híbridos el desarrollo no es viable. Algunas veces se utilizan los ovocitos de hámster despojados de la zona pelúcida en estudios clínicos de esterilidad para valorar la capacidad fecundante de los espermatozoides humanos in vitro (figura 2). Figura 1 La zona pelúcida. A) Micrografía electrónica de barrido de un oocito de hámster, mostrando la zona pelúcida. B) La zona (a la que están adheridos muchos espermatozoides) se ha separado para poner de manifiesto la membrana plasmática subyacente que presentan numerosos microvilli. La zona pelúcida ha sido sintetizada exclusivamente por el oocito (De D. M. Phillips, J. Ultrastruc. Res. 72:1-12, 1980) 3 Figura 2 Micrografía electrónica de barrido de un espermatozoide humano en contacto con un oocito de hámster. Se ha eliminado la ZP del oocito, quedando al descubierto la membrana plasmática que presenta numerosos microvilli. La capacidad de un espermatozoide para penetrar en un oocito de hámster se utiliza como prueba de fertilidad; una penetración del 10 al 25 % de los oocitos se considera un valor normal. (Por cortesía de David M. Phillips) 4 La zona pelúcida de los mamíferos está integrada por tres glicoproteínas todas ellas producidas exclusivamente por el ovocito. Dos de ellas ZP2 y ZP3 se ensamblan formando largos filamentos mientra que la ZP1 entrecruza los filamentos, constituyendo así una red tridimensional. La proteína ZP3 es crucial: las hembras de ratón con un gen ZP3 alterado producen ovocitos sin zona pelúcida y son estériles. ZP3 es responsable, al menos en el ratón, de la unión específica de especie del espermatozoide a la cubierta, Diversas proteínas de la superficie del espermatozoide que se unen a un oligosacárido de la ZP3 se consideran receptores para esta glicoproteína, aunque su función se está por determinar. La unión del espermatozoide a la zona es compleja e involucra mecanismos dependientes e independientes de ZP3 y una gran variedad de proteínas de la superficie del espermatozoide. La zona pelúcida induce la reacción acrosómica en al cual el contenido de la vesícula acrosómica es liberado por exocitosis (figura 3). La reacción acrosómica es indispensable para la normal fecundación. Dicha reacción expone varias enzimas hidrolíticas requeridas para la formación del túnel en la zona pelúcida por donde pasará el espermatozoide para alcanzar la superficie del ovocito y luego fusionarse con ella. In vitro la reacción acrosómica es desencadena por la ZP3, posiblemente activando los receptores tipo lectina en la superficie del espermatozoide, se supone que tales receptores sean la forma transmembrana de la enzima galactosil-transferasa. La activación del receptor provoca un aumento del Ca2+ intracelular lo cual desencadena la exocitosis de la vesícula acrosómica. 5 Figura 3 La reacción acrosómica que se produce en los mamíferos cuando un espermatozoide fecunda un oocito. En el ratón parece que una sola glucoproteína de la cubierta vitelina, la ZP3, es la responsable tanto de la unión del espermatozoide como de inducir la reacción acrosómica. Obsérvese como un espermatozoide de mamífero interacciona tangencialmente con la membrana plasmática del oocito; de modo que la fusión se produce, más que en el extremo, en la región ecuatorial de la cabeza de la célula. En el ratón la zona pelúcida tiene alrededor de 6 μm de grosor y el espermatozoide la atraviesa a una velocidad de 1μm/m aproximadamente. 6 El mecanismo de fusión del ovocito y el espermatozoide sigue aun sin estar claro Una vez que el espermatozoide penetra la zona pelúcida se encuentra con la membrana del ovocito, uniéndose a ella por el extremo de una de las microvellosidades que se encuentran en la superficie del gameto femenino (figura 2). El espermatozoide primero se une por su extremo y luego por un lado (figura 3). Las microvellosidades vecinas rápidamente se elongan y rodean al espermatozoide, quedando éste afirmado para proceder a la unión de las membranas. Después de la fusión, todo el contenido del espermatozoide ingresa en el ovocito y las microvellosidades se reabsorben. El mecanismo de fusión de las membranas del espermatozoide y el ovocito aun se desconoce, sin embargo hay varias proteínas de membrana descriptas que son necesarias para que ocurra la fusión. Una es la proteína Izumo perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Esta aparece expuesta en la superficie del acrosoma de ratón y de humano durante la reacción acrosómica. Los anticuerpos antiIzumo bloquean la fusión y los espermatozoides Izumo-deficientes fallan en la fusión con ovocitos normales, pero aun no se sabe como media Izumo la fusión de las membranas. La única proteína en la superficie del ovocito que está demostrado es necesaria para la fusión es la CD9, ésta es un miembro de la familia de las tetrasparinas, dado que tiene 4 segmentos transmembrana. Los espermatozoides normales fallan en unirse con ovocitos deficientes en CD9, lo cual demuestra la importancia de dicha proteína, pero no se sabe como media la fusión. CD9 no actúan sola, hay varias glicoporoteínas de membrana que intervienen. El espermatozoide tampoco se unirá a ovocitos que han sido tratados con enzimas para remover las proteínas de membrana unidas al glucosilfosfatidilinositol (GIP). Esto demuestra que dichas proteínas también son necesarias, pero aun se desconoce la o las que realmente median la fusión. 7 La fusión del espermatozoide activa el ovocito por un aumento en la concentración del Ca2+ en el citosol La fusión con el espermatozoide activa el ovocito causando que los gránulos corticales liberen su contenido por exocitosis, proceso denominada reacción cortical. La meiosis que estuvo detenida en la metafase II se reanuda, liberando el segundo cuerpo polar, pudiendo así el cigoto comenzar su desarrollo. Un aumento de Ca2+ en el citosol dispara todos estos eventos. Si la concentración de Ca2+ es elevada artificialmente (directamente por una microinyeccion de Ca2+ o indirectamente agregando al medio Ca2+ con un ionóforo), los ovocitos de todos los animales testeados incluyendo los humanos, son activados. También si se agrega un factor quelante como el EDTA, que secuestra el Ca2+, se impide la activación como respuesta a la fertilización. Cuando el espermatozoide se une al ovocito provoca un aumento local de la concentración de Ca2+ la cual se expande como una onda. La onda se propaga con feedback positivo, el aumento de Ca2+ citoplasmático promueve la apertura de más canales permitiendo que más Ca2+ entre en el citosol. En los ovocitos de algunos mamíferos, el incremento inicial de la concentración de Ca2+ va seguido de oscilaciones prolongadas de dicha concentración. La fusión del espermatozoide dispara la onda de Ca2+ y su oscilación por medio de un factor que introduce en el citosol del ovocito. Una inyección de un espermatozoide intacto, una cabeza de espermatozoide o un extracto de espermatozoide provoca el mismo efecto. Todos estos tratamientos provocan el aumento del inositol 1, 4, 5 trifosfato (IP3), el cual libera Ca2+ del retículo endoplásmico rugoso e inicia la onda de Ca2+ y las oscilaciones. Un fuerte candidato para el factor que introduce el espermatozoide es una forma esperma-específica de la fosfolipasa C (PLC), que directamente cliva el fofatidilinositol 4, 5 bifosfato (PI (4, 5) P2) para producir IP3 y diacilglicerol (figura 4). 8 Figura 4 ¿Cómo los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) aumentan el Ca2+ citosólico y activan la proteína quinasa C (PKC)? Los GPCRs estimulan la fosfolipasa PLCβ a través de una proteína G. Dependiendo de la isoforma de PLCβ ésta puede ser activada por la subunidad α de Gq como se muestra en la figura o por la subunidad βγ de otra proteína G o por ambas. Dos pequeñas moléculas mensajeras intracelulares se producen cuando PI(4,5)P2 se hidroliza por la activación de PLCβ. El inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) difunde a través del citosol y libera Ca2+ de la 2+ 2+ membrana del RE. El gran gradiente electroquímico de Ca a través de esas membranas causa que el Ca escape hacia el citosol cuando los canales se abren. El diacilglicerol permanece en la membrana plasmática y junto con la fosfatidilserina (no se muestra) y Ca2+ ayuda a activar la proteína quinasa C (PKC) la cual es reclutada del citosol a la superficie citosólica de la membrana plasmática. De las diez o más isoformas distintas de PKC humana, cuatro por lo menos son activadas por el diacilglicerol. 9 La reacción cortical asegura que sólo un espermatozoide fertilice el ovocito A pesar de que varios espermatozoides pueden llegar a las inmediaciones del ovocito, sólo uno puede fusionarse con él e inyectar en su citoplasma el núcleo y los demás organelos. Si más de un espermatozoide fusiona su membrana con el ovocito (polispermia) entonces se formará más de un huso mitótico, habiendo segregación desigual de cromosomas, se producirán células aneuploides y el desarrollo se detendrá. Dos mecanismos aseguran que sólo un espermatozoide fertilice el ovocito. Primero, en muchos casos (erizo de mar) una rápida despolarización de la membrana plasmática del ovocito, causada por la fusión del primer espermatozoide, impide que otros espermatozoides se fusionen, actuado así como un rápido bloqueo primario de la polispermia (en mamíferos aún no se conoce el mecanismo). Sin embargo, el potencial de membrana recupera rápidamente su valor normal poco después de la fecundación, de manera que es necesario un segundo mecanismo para asegurar a largo plazo el bloqueo secundario de la polispermia. Este segundo mecanismo de bloqueo de la polispermia es desencadenado por la reacción cortical del ovocito, mediante la cual se produce la exocitosis de los gránulos corticales debido al incremento del Ca+2 intracelular. El contenido de los gránulos corticales incluye varias enzimas que al ser liberadas alteran la estructura de la zona pelúcida. Esta cubierta alterada se ”endurece”, de manera que no se puede unir a ella ningún otro espermatozoide, constituyendo un bloqueo definitivo a la polispermia. Entre los cambios que se producen en la zona pelúcida están la degradación proteolítica de la ZP2 y la hidrólisis de los azúcares de ZP3 (figura 5). El espermatozoide provee de los centríolos y de su genoma en la formación del cigoto Una vez fertilizado el ovocito se llama cigoto. La fertilización no está completa hasta que los núcleos haploides (denominados pronúcleos), uno proveniente del ovocito y otro del espermatozoide, se fusionan y combinan sus cromosomas formando un sólo núcleo 10 diploide. Los pronúcleos de mamíferos no se fusionan directamente como ocurre en todas las especies. Ellos se aproximan pero permanecen independientes uno del otro hasta que la envoltura nuclear de cada pronúcleo se desensambla y se forma el primer huso mitótico del cigoto (figura 6). Figura 5 Esquema que representa de qué forma la reacción cortical puede impedir que entre más de un espermatozoide en un oocito de ratón. La liberación del contenido de los gránulos corticales elimina los carbohidratos de la ZP3 de manera que ya no pueden unirse a la membrana plasmática del espermatozoide y fracciona parcialmente la ZP2, endureciendo la cubierta. Estos dos cambios provocan un bloqueo de la polispermia. 11 Figura 6 Unión de los pronúcleos del espermatozoide y del oocito después de la fecundación en los mamíferos. Los pronúcleos migran hacia el centro del óvulo. Cuando se encuentran, las envolturas nucleares se interdigitan. Los centrosomas se replican, las envolturas nucleares se desensamblan y los cromosomas de ambos gametos se integran formando un huso mitótico común, que determina la primera división del cigoto. (Adaptado de dibujos y micrografías de Daniel Szöllösi) 12 Figura 7 Micrografía de inmunofluorescencia de la fusión de un espermatozoide humano y el pronúcleo de un óvulo en un proceso de fecundación in vitro. Los microtúbulos del huso se han teñido de color verde con anticuerpos antitubulina y el ADN está marcado con azul mediante un colorante específico. A) Huso meiótico en un oocito maduro no fecundado. B) Éste óvulo fecundado expulsa su segundo corpúsculo polar aproximadamente a las 5 hrs. de la fusión con el espermatozoide (izquierda) que ha nucleado un conjunto de microtúbulos. C) Los dos pronúcleos se encuentran. D) A las 16 hrs. de fusión, el centrosoma que ha entrado con el espermatozoide se ha duplicado y los centrosomas han organizado un huso mitótico bipolar. Los cromosomas de ambos pronúcleos se alinean en la placa metafísica del huso. Como indican las flechas C) y D), la cola del espermatozoide se asocia con uno de los centrosomas (De C. Simerly et al.Nat.Med. I:47-53, 1995 © Macmillan Magazines Ltd.) 13 En varios animales incluyendo los humanos, el espermatozoide contribuye con algo más que su genoma en el cigoto. Aporta los centríolos, estructuras que se pierden en el ovocito sin fertilizar. Los centríolos entran en el ovocito, junto con el pronúcleo masculino y toda la cola del espermatozoide, y el centrosoma se forma alrededor de ellos. En la especie humana, este centrosoma se duplica y organiza el primer huso mitótico del cigoto (figura 7). Esto explica porqué la polispermia causa la formación de varios husos mitóticos, cuando muchos espermatozoides transfieren sus centríolos al ovocito. La fecundación marca el comienzo de uno de los fenómenos más extraordinarios de toda la biología − el proceso de embriogénesis − durante el cual el cigoto se desarrolla formando un nuevo individuo. Tomado y modificado de Molecular Biology of the Cell 5/e (© Garland Science 2008) 14