k OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS 19 k 2 200 696 kNúmero de solicitud: 200201437 kInt. Cl. : C12N 15/11 11 Número de publicación: 21 7 51 ESPAÑA C12N 15/40 A01H 5/00 k 12 SOLICITUD DE PATENTE k 71 Solicitante/s: Consejo Superior de k 72 Inventor/es: Franco Redrejo, Maribel; 22 Fecha de presentación: 21.06.2002 A1 k Investigaciones Cientı́ficas c/ Serrano, 117 28006 Madrid, ES 43 Fecha de publicación de la solicitud: 01.03.2004 k 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: 01.03.2004 k Aguilar Aguilar, Juan Manuel; Fernández Marco, Cristina; Dı́az Pendón, Juan; Rodrı́guez Cerezo, Emilio y Aranda Regules, Miguel Angel 74 Agente: No consta k k 54 Tı́tulo: Método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas ES 2 200 696 A1 k (CYSDV) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a CYSDV obtenidas mediante dicho método. 57 Resumen: Método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a CYSDV obtenidas mediante dicho método. Se describe una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV), y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i). Dicha construcción puede utilizarse para generar resistencia frente a CYSDV en plantas susceptibles a la infección por dicho virus. Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid ES 2 200 696 A1 DESCRIPCION 5 Método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a CYSDV obtenidas mediante dicho método. Campo de la invención 10 La presente invención se refiere a un método para generar resistencia frente al Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV) en plantas susceptibles a la infección por CYSDV. La invención también se refiere a las construcciones genéticas derivadas del genoma del virus usadas en dicho método y a las plantas obtenidas mediante dicho método. Antecedentes de la invención 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Las enfermedades de los amarilleos de las cucurbitáceas causadas por closterovirus transmitidos por mosca blanca tienen una gran importancia económica en diversas áreas del mundo. En las epidemias inicialmente descritas se observó que el agente inductor de estas enfermedades era el Virus del pseudoamarilleo de la remolacha (Beet pseudo yellows virus; BPYV), un closterovirus transmitido en la naturaleza por la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum (Duffus, 1965; Coffin y Couts, 1995). Sin embargo, en las epidemias que están ocurriendo más recientemente se está observando que los amarilleos están inducidos por el Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV), un closterovirus que se transmite en la naturaleza por la mosca blanca Bemisia tabaci (Célix y col., 1996). De hecho, se ha propuesto que CYSDV haya reemplazado a BPYV como consecuencia del desplazamiento de T. vaporariorum por B. tabaci que parece haber tenido lugar en, al menos, algunas áreas geográficas (Wisler y col., 1998; Berdiales y col., 1999). En la actualidad, CYSDV ha sido detectado y causa problemas graves en cultivos de cucurbitáceas de los Emiratos Arabes, España, Portugal, Marruecos, Lı́bano y Norte América (Célix y col., 1996; Wisler y col., 1998; Abou-Jawdah y col., 2000; Desbiez y col., 2000; Kao y col., 2000; Louro y col., 2000). En España, los sı́ntomas de amarilleos causados por CYSDV se observan con frecuencia en el 100 % de las plantas de los invernaderos afectados, resultando en pérdidas económicas muy graves debido a las importantes reducciones ocasionadas en los rendimientos de las cosechas. CYSDV es un miembro del género Crinivirus (Familia Closteroviridae; Martelli y col., 2000) que, como otros miembros de este género, invade el tejido floemático de las plantas infectadas y parece permanecer restringido a éste. Su gama de huéspedes está limitada a especies de la familia de las cucurbitáceas (Célix y col., 1996). Sus partı́culas tienen forma de varilla flexuosa y una longitud de 750 a 800 nm (Liu y col., 2000). El genoma de CYSDV es de RNA monocatenario de sentido mensajero y bipartito, esto es, está formado por dos moléculas de RNA que se han denominado RNA1 y RNA2 (Célix y col., 1996), y por el momento ha sido sólo parcialmente secuenciado. Las secuencias de nucleótidos de genes de CYSDV publicadas hasta ahora corresponden al RNA2 del genoma viral (Célix y col., 1996; Livieratos y col., 1999; Livieratos y Coutts, 2002). La diversidad genética de aislados de CYSDV provenientes de diversas áreas del mundo ha sido analizada para dos regiones genómicas del RNA2, el gen homólogo de la proteı́na 70 de respuesta a choque térmico (heat shock 70 homologue protein; HSP70h) y el gen de la proteı́na de la cápsida del virus (capsid protein; CP). Los resultados de estos análisis sugieren que la diversidad de CYSDV es inusualmente baja entre las especies de la familia Closteroviridae, aunque aun ası́ es posible diferenciar dos grupos genéticos, las llamadas subpoblaciones oriental y occidental (Rubio y col., 1999; Rubio y col., 2001). Teniendo en cuenta la importancia económica de la enfermedad causada por CYSDV, es imprescindible el diseño de estrategias eficientes para el control de la enfermedad inducida por este virus. El control de CYSDV se basa actualmente en el control de su vector B. tabaci y en el uso de estrategias sanitarias preventivas, aunque estos métodos están teniendo unos resultados muy limitados. Indudablemente, la mejor opción para el control de CYSDV serı́a el uso de cultivares portadores de resistencia genética al virus. Sin embargo, por el momento sólo se ha descrito una posible fuente de resistencia natural a CYSDV (López-Sesé y Gómez-Guillamón, 2000) y ésta es en melón. Serı́a muy deseable contar con otras fuentes de resistencia, y no sólo en melón, sino también en otras cucurbitáceas de importancia económica y que estén afectadas por CYSDV. Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un método para generar resistencia genética frente a CYSDV en plantas susceptibles a este virus. Dada la existencia de un número muy limitado de posibles donadores de resistencia natural a CYSDV (López-Sesé y Gómez-Guillamón, 2000) es conveniente plantear la generación de resistencia al virus mediante la transformación de plantas con genes foráneos (transgenes) capaces de conferir este carácter. 2 ES 2 200 696 A1 Existen numerosos Ejemplos de resistencias a virus conseguidas mediante la introducción de transgenes en el genoma de especies de plantas previamente susceptibles (revisado en Wilson, 1993; Beachy, 1997). 5 10 15 20 Los diversos métodos utilizados para obtener resistencias en plantas a través de la introducción de transgenes están basados en el uso de genes originales de plantas (ej. Whitham y col., 1996), en el uso de genes o secuencias derivados del patógeno viral (resistencia “derivada del patógeno” [Wilson, 1993]) ó en el uso de genes de otros orı́genes (ej. Dickman y col., 2001). Algunos ejemplos de secuencias ó genes de virus de RNA que han sido utilizados con éxito para generar resistencia derivada del patógeno en plantas (revisado en Beachy, 1997) incluyen: 1) genes de proteı́nas de cápsidas, 2) genes de polimerasas de RNA dependientes de RNA, 3) genes de proteı́nas del movimiento y 4) genes de nucleoproteı́nas de tospovirus. En un número elevado de estos casos se ha observado que el fenotipo de resistencia al virus está asociado con el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) del transgén (Beachy, 1997) de tal manera que el PTGS parece tener como diana no sólo al transgén sino también a los genes homólogos de un posible virus invasor (English y col., 1996; Marathe y col., 2000). Por otra parte, se ha demostrado recientemente que la transformación de plantas con construcciones genéticas portadoras de secuencias de nucleótidos con una repetición invertida capaces de dar lugar a RNAs bicatenarios (dsRNAs) está asociada con el PTGS de genes con secuencias homólogas a esos dsRNAs (Waterhouse y col., 1998). Los genes silenciados mediante la transformación de plantas con repeticiones invertidas pueden ser del genoma de un posible virus invasor y, por tanto, el fenotipo esperable con respecto a la infección viral en las plantas transgénicas es de resistencia al virus (Waterhouse y col., 1998). Compendio de la invención 25 30 35 El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para generar resistencia genética frente a CYSDV en plantas previamente susceptibles al virus mediante la transformación de las plantas con transgenes portadores de una secuencia con una repetición invertida derivada del genoma viral. En un aspecto, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 de CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i). En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha construcción de ácido nucleico. En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transformada con dicha construcción de ácido nucleico o con dicho vector. 40 En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transgénica que comprende, integrada en su genoma, dicha construcción de ácido nucleico. Las plantas transgénicas que comprenden, al menos, una de dichas células transgénicas también constituyen un aspecto de la presente invención. 45 En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta transformada con dicha construcción de ácido nucleico o con dicho vector. En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta que es un clon o un descendiente de dicha planta transgénica o transformada. 50 En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta hı́brida con resistencia mejorada frente a CYSDV, preparada por cruce de dicha planta transgénica, o transformada, o de un clon o descendiente de las mismas, con una segunda planta susceptible a la infección por CYSDV. 55 60 En otro aspecto, la invención se relaciona con un propágulo, tal como una semilla, de cualquiera de dichas plantas transgénicas, transformadas o hı́bridas. En otro aspecto, la invención se relaciona con una semilla de una planta que comprende dicha segunda secuencia de nucleótidos que comprende (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 de CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i). 3 ES 2 200 696 A1 En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas susceptibles a la infección por CYSDV, que comprende transformar una célula vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con dicha construcción de ácido nucleico y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada. 5 En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicha construcción de ácido nucleico en la producción de una planta transgénica con resistencia mejorada a la infección por CYSDV. Breve descripción de las figuras 10 La Figura 1 muestra la secuencia completa del RNA1 de CYSDV. La secuencia de nucleótidos aparece numerada. Bajo la secuencia de nucleótidos aparece su traducción probable a aminoácidos. El marco de lectura que probablemente se traduce aparece indicado a la izquierda de cada lı́nea de la secuencia de aminoácidos. 15 20 25 La Figura 2 es un diagrama que representa la posible organización génica del RNA1 de CYSDV. Los rectángulos abiertos representan ORFs. En el ORF 1a, el área señalada por un rombo negro tiene homologı́a de secuencia con dominios metil transferasa (Rozanov y col., 1992) y el área señalada por una estrella negra con dominios helicasa (Gorbalenya y Koonin, 1993). En el ORF 1b, el área señalada por un cuadrado negro tiene homologı́a de secuencia con dominios polimerasa de RNA (Koonin y Dolja, 1993). Los segmentos negros horizontales corresponden a los clones de cDNA utilizados en la secuenciación completa del RNA1 Los segmentos sombreados horizontales representan clones de cDNA inicialmente obtenidos y utilizados para diseñar oligonucleótidos para preparar los clones antes mencionados. Las flechas indican los oligonucleótidos utilizados en la sı́ntesis de la primera cadena de cDNAs y/o en su amplificación por PCR. La Figura 3 muestra el alineamiento de las secuencias de nucleótidos de CYSDV y de LIYV correspondientes a las regiones 5’-UTR (A) y 3’-UTR (B) de sus RNAs 1. Sobre fondo negro aparecen los nucleótidos idénticos entre ambas secuencias. 30 35 La Figura 4 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de CYSDV y de LIYV correspondientes a los dominios metiltransferasa (A; Rozanov y col., 1992), helicasa (B; Gorbalenya y Koonin, 1993) y RNA polimerasa (C; Koonin y Dolja, 1993) posiblemente codificados por sus RNAs 1. Sobre fondo negro aparecen los aminoácidos idénticos entre ambas secuencias. Sobre fondo gris, los aminoácidos similares. La Figura 5 muestra el alineamiento de secuencias de CYSDV y de BYV en la región del RNA1 en la que un cambio (+1) de la fase de lectura puede dar lugar a la expresión de la proteı́na 1b. 40 45 50 55 60 La Figura 6 muestra la organización del módulo de resistencia y selección que porta la construcción genética introducida en las plantas transgénicas. El esquema corresponde a la región comprendida entre los bordes derecho (RB) e izquierdo (LB) del plásmido Ti de Agrobacterium. Aparecen indicados desde RB a LB: el promotor 35S del Virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el transgén viral formado por la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.116 a 6.827 de la secuencia del RNA1 de CYSDV (numeración como en la Figura 1) y una repetición invertida de dicha secuencia (nts complementarios a 6.827 a 6.116 del RNA1 de CYSDV; numeración como Fig. 1), el terminador poly(A) de CaMV, el promotor del gen nopalin-sintetasa (NOS), el gen de la neomicin-fosfotransferasa II y el terminador poly(A) del gen NOS. La Figura 7 es un esquema representativo del proceso seguido y de las construcciones intermedias usadas para la preparación de la construcción genética utilizada en esta invención para transformar plantas. En esta figura (A) es: Clonación en pGEM-T Easy del fragmento de 862pb amplificado por PCR con los oligonucleótidos MA160-MA161. (B) es: Clonación en pGEM-T Easy del fragmento de 712pb amplificado por PCR con los oligonucleótidos MA160-MA174. (C) es: Digestión con SmaI. (D): Digestión con EcoRI y purificación del fragmento de 730pb, seguido de tratamiento con Klenow. (E): Ligación. (F): Digestión con EcoRI y purificación del fragmento de 1.6Kb, seguido de clonación en el sito EcoRI de pExSem-2. (G): Digestión con HindIII y purificación del fragmento de 2.1 Kb seguido de clonación en el sitio HindIIII de svs297. Descripción detallada de la invención 1) Secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV 4 ES 2 200 696 A1 5 10 15 20 25 30 35 40 Como paso previo a la preparación de las construcciones genéticas proporcionadas por esta invención para transformar plantas con secuencias de genes virales, se procedió a secuenciar completamente el RNA1 del genoma de CYSDV. La secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV se obtuvo tal como se describe en el Ejemplo 1. El RNA1 de CYSDV tiene 9.123 nucleótidos (nt) (SEQ. ID. N◦ : 1) (Figura 1). Una búsqueda en las bases de datos (programa BLASTN; GCG Software Package, Madison, WI, USA) ha puesto de manifiesto que la máxima homologı́a de secuencia la tiene con el Virus del amarilleo infeccioso de la lechuga (LIYV), que es el miembro tipo del género Crinivirus, Familia Closteroviridae (Martelli y col., 2000). Un análisis de la capacidad codificadora de este RNA (programa FRAMES; GCG Software Package, Madison, WI, USA) ha revelado que posiblemente contenga 5 marcos abiertos de lectura (ORFs) flanqueados por dos secuencias no codificantes (UTRs) (Figura 2). La UTR situada en el extremo 5’ del RNA1 consiste en 94 nt hasta el codón de iniciación del ORF 1a. La UTR situada en el extremo 3’ del RNA1 consiste en 221 nt desde el codón de terminación del ORF 4 hasta el último nt del RNA1. Ambas UTRs tienen una similitud significativa con las correspondientes regiones del RNA1 de LIYV (Figura 3). El primer codón AUG de iniciación de traducción se encuentra en la posición 95 aguas abajo del extremo 5’. Los dos primeros ORFs están organizados de forma similar a como lo están en LIYV (Klaasen y col., 1995). El primer ORF (ORF la) comprende los nucleótidos 95 a 6.028 y se puede traducir en una proteı́na de 1.976 aminoácidos con un peso molecular calculado de 227 kDa. En esta proteı́na se pueden identificar dos motivos conservados en proteı́nas asociadas con la replicación de virus. Entre los aminoácidos 514 y 871 existe un motivo metiltransferasa (MET; Rozanov y col., 1992); además, esta secuencia tiene una similitud elevada con el dominio homólogo en LIYV (42,6 % de aminoácidos idénticos en un alineamiento de 357 residuos; Figura 4A). En la región carboxi-terminal (aminoácidos 1678 a 1941) existe un dominio helicasa (HEL; Gorbalenya y Kooning, 1993); el dominio homólogo en LIYV tiene una elevada similitud con esta región (42,02 % de aminoácidos idénticos en un alineamiento de 264 residuos; Figura 4B). La región de la proteı́na codificada por el ORF la que se encuentra entre los motivos MET y HEL no muestra similitud significativa con ninguna proteı́na cuya secuencia esté disponible en las bases de datos. El producto codificado por el ORF 1b contiene los motivos conservados tı́picos de RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRp; Koonin y Dolja, 1993) y está estrechamente relacionado con la supuesta RdRp de LIYV (55,9 % de aminoácidos idénticos en un alineamiento de 474 residuos; Figura 4C). El ORF 1b se encuentra en un marco de lectura distinto del ORF 1a, concretamente desplazado un nucleótido aguas abajo (+1). Se ha propuesto para el Virus del amarilleo de la remolacha (BYV), miembro tipo del género Closterovirus, que el producto homólogo al codificado por el ORF 1b de CYSDV se exprese vı́a cambio de fase (+1) del ribosoma durante la traducción (Agranovsky y col., 1994). La comparación directa de las secuencias de nucleótidos en la zona de solape de los ORFs 1a y 1b de BYV y CYSDV muestra una similitud significativa entre éstas (Figura 5) y permite predecir que el posible cambio de fase pueda ocurrir en el residuo U-6.026 de la secuencia del RNA1 de CYSDV. Los ORFs 2 (nts 7.554-7.690), 3 (nts 7.704-8.342) y 4 (nts 8.389-9002) tienen capacidad para codificar proteı́nas de 48, 212 y 192 aminoácidos, respectivamente, con pesos moleculares calculados de 5, 25 y 22 kDa, respectivamente. Las proteı́nas potencialmente codificadas por los ORFs 2, 3 y 4 no muestran similitud significativa con ninguna proteı́na cuya secuencia esté disponible en las bases de datos, ni tampoco se ha encontrado ningún motivo conservado en sus correspondientes secuencias. 2) Construcción genética utilizada para la transformación de plantas 45 En un aspecto, la invención proporciona una construcción de ácido nucleico, en adelante construcción de la invención, que comprende: una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: 50 (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i). 55 60 En principio, dicha secuencia de nucleótidos (i) puede contener cualquier secuencia de nucleótidos del RNA1 del CYSDV. Asimismo, la longitud de dicha secuencia (i) puede variar dentro de un amplio intervalo, tı́picamente entre 25 y 4.000 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia de nucleótidos (i) comprende una secuencia de nucleótidos ORF 1b del RNA1 del CYSDV, tal como la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.116 y 6.827 de la secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV (SEQ. ID. N◦ : 2). La repetición invertida [secuencia (ii)] presente en la construcción de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i), en 5 ES 2 200 696 A1 5 10 15 20 25 30 dirección sentido o antisentido con respecto a dicha secuencia (i), de manera que pueda formar un dsRNA cuando la repetición se transcribe. La longitud de la repetición invertida puede variar dentro de un amplio intervalo, tı́picamente entre 25 y 4.000 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia de nucleótidos (ii) comprende la repetición invertida de la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.116 y 6.827 de la secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV. La construcción de la invención puede contener, opcionalmente, una secuencia espaciadora (iii) entre dichas secuencias (i) y (ii). La longitud de dicha secuencia espaciadora (iii) puede variar dentro de un amplio intervalo, tı́picamente entre 10 y 500 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia espaciadora (iii) comprende la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.828 y 6.974 de la secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV (SEQ. ID. N◦ : 3). La primera secuencia de nucleótidos de la construcción de la invención comprende un promotor funcional en plantas. Dicho promotor funcional en plantas puede ser un promotor constitutivo, inducible o especı́fico de tejido. En principio, cualquier promotor funcional en plantas puede ser utilizado en la preparación de la construcción de la invención, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor del gen nopalin sintetasa (pNOS), el promotor del gen polyubiquitinal (pub1), el promotor de Agrobacterium rhizogenes rolC (especı́fico de floema), o el promotor de Phaseolus vulgaris p12 (especı́fico de epidermis). En una realización particular, dicho promotor funcional en plantas es el promotor 35S del CaMV. La construcción de la invención puede contener, además, un terminador de la transcripción funcional en plantas. En general, cualquier terminador de la transcripción funcional en plantas puede ser utilizado en la preparación de la construcción de la invención, por ejemplo, el terminador poli(A) de CaMV, el terminador poli(A) del gen NOS, etc. En una realización particular, dicho terminador de la trancripción funcional en plantas es el terminador poli(A) de CaMV. En una realización particular, la construcción de la invención comprende un promotor funcional en plantas capaz de regular la transcripción en plantas de una segunda secuencia de nucleótidos, y un terminador de la transcripción funcional en plantas, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: (i) la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2; (ii) la repetición invertida de dicha SEQ. ID. N◦ : 2; y 35 40 45 50 55 60 (iii) entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii), la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 3. La construcción de la invención puede contener, opcionalmente, una tercera secuencia de nucleótidos que permite seleccionar una planta transformada con dicha construcción, estando dicha tercera secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos y a un terminador de la transcripción funcional en plantas. Prácticamente cualquier secuencia de nucleótidos que permita seleccionar una planta transformada con la construcción de la invención puede ser utilizada, por ejemplo, el gen de la neomicinfosfotransferasa II (nptII), capaz de conferir resistencia a kanamicina, el gen de la higromicin-fosfotransferasa (hpt), capaz de conferir resistencia a higromicina, el gen de la fosfinotricin acetil transferasa (Barr/PAT), capaz de conferir resistencia a bialafos, o el gen csr1-1, capaz de conferir resistencia a sulfonil-urea. En una realización particular, dicha tercera secuencia de nucleótidos comprende el gen nptII capaz de conferir resistencia a kanamicina en una planta transformada con una construcción de la invención que contiene dicha secuencia. Asimismo, en principio, puede utilizarse cualquier promotor y terminador de la transcripción funcionales en plantas. No obstante, en una realización particular, dicho promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos es el promotor pNOS y dicho terminador de la transcripción funcional en plantas es el terminador poli(A) del gen NOS. En una realización concreta de esta invención, la construcción genética proporcionada por esta invención, usada para la transformación de plantas, incluye un módulo diseñado para generar resistencia a CYSDV y posibilitar la selección de plantas transformantes. Este módulo está inserto entre los bordes derecho (RB) e izquierdo (LB) del plásmido Ti(tumor-inducing) de Agrobacterium, y todo ello incluido en un vector binario seleccionable (SVS297-NOS) capaz de replicarse en Escherichia coli y Agrobacterium. La organización del módulo de resistencia/selección se esquematiza en la Figura 6. Este módulo contiene, desde el RB al LB, los siguientes elementos: i) el promotor 35S del CaMV, para conferir al transgén viral expresión fuerte y constitutiva; 6 ES 2 200 696 A1 5 10 ii) el transgén viral, formado por la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2 y su repetición invertida, existiendo entre ambas secuencias una secuencia espaciadora constituida por la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 3; las secuencias utilizadas para la construcción del transgén viral derivan de la secuencia correspondiente al ORF 1b del RNA1 de CYSDV, que es el ORF que contiene los motivos RdRp (Koonin y Dolja, 1993; Figura 2); el transgén viral está diseñado para que tras su transcripción en el núcleo celular se genere dsRNA de tipo “horquilla” (Waterhouse y col., 1998) con una región apareada de 711 nt y una región “bucle” (no apareada) de 147 nt; iii) el terminador poli(A) de CaMV; iv) el promotor del gen nopalin-sintetasa (NOS), para conferir al transgén de selección expresión fuerte y constitutiva; 15 v) el gen de la neomicin-fosfotransferasa II, para conferir resistencia a kanamicina a las plantas transformadas; y vi) el terminador poli(A) del gen NOS. 20 25 30 35 La construcción de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas convencionales conocidas por los técnicos en la materia. En el Ejemplo 2 se describe la Preparación de la construcción de la invención descrita previamente, utilizada para la transformación de plantas de melón y pepino, utilizando E. coli como huésped de los vectores plasmı́dicos. La construcción de la invención puede estar insertada en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende una construcción de la invención. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, dicho vector puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado o bien un vector viral. En una realización particular, dicho vector puede ser un vector de expresión provisto de una serie de elementos que permiten la transcripción de un ácido nucleico determinado en la célula hospedadora. Dicho vector de expresión puede ser un vector RNA o DNA. 3) Transformación y caracterización de las plantas transformantes La construcción de la invención ası́ como los vectores proporcionados por la misma pueden ser utilizados para transformar plantas. 40 45 50 55 60 Tal como se utiliza en esta descripción, el término “planta” incluye plantas completas; órganos y estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos); raı́ces; flores y órganos y estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, carpelos, anteras, óvulos, etc.), semillas (incluyendo embriones, endospermo y el recubrimiento de la semilla) y frutos; tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, etc.) y células vegetales, ası́ como a la progenie de una planta. La clase de plantas que puede ser utilizada para la puesta en práctica del método proporcionado por esta invención incluye a cualquier planta susceptible de ser infectada por el CYSDV, tal como una cucurbitácea, por ejemplo, melón, sandı́a, pepino, etc. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transformada con una construcción de la invención o con un vector proporcionado por esta invención. Las células hospedadoras que se pueden transformar con la construcción o el vector proporcionado por esta invención son, preferentemente, células vegetales. La transformación de las células vegetales puede realizarse por métodos convencionales. A modo ilustrativo, dicha construcción o vector puede ser introducido directamente en el DNA genómico de la célula vegetal mediante el empleo de técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células vegetales, o bien vectores de expresión proporcionados por esta invención pueden ser introducidos directamente en el tejido vegetal mediante el empleo de métodos balı́sticos, por ejemplo, por bombardeo de partı́culas. Una revisión de técnicas relacionadas con la transferencia genética a plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de DNA, etc., se recoge en, por ejemplo, el libro titulado “Ingenierı́a genética y transferencia génica”, de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), en particular, en el capı́tulo 9, titulado “Transferencia génica a plantas”, páginas 283-316. Las células vegetales transformadas que derivan de cualquiera de las técnicas de transformación mencionadas previamente pueden ser cultivadas para regenerar la planta completa que poseerá el genotipo 7 ES 2 200 696 A1 5 10 transformado y, por tanto, manifestará el fenotipo deseado, es decir, una resistencia mejorada frente a CYSDV. La regeneración de las plantas completas se realiza mediante el empleo de técnicas convencionales. A modo ilustrativo, las técnicas de regeneración dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, dependiendo, en general, de un marcador (biocida y/o herbicida) introducido junto con la construcción de la invención. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados ha sido descrita, por ejemplo, por Evans y col., (1983), y Binding (1985). La regeneración de las plantas también puede obtenerse a partir de callos de plantas, explantes, órganos y partes de una planta [Klee y col.,(1987)]. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una planta transformada con una construcción de la invención o con un vector proporcionado por esta invención. 15 La construcción de la invención puede ser integrada de forma estable en el genoma de la célula vegetal, generándose una célula transgénica que puede regenerar una planta transgénica la cual puede ser utilizada para generar plantas hı́bridas mediante cruce sexual con otras plantas transgénicas o no transgénicas. 20 Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transgénica que comprende, integrada en su genoma, una construcción de la invención. Una planta transgénica que comprende, al menos, una de dichas células transgénicas proporcionadas por esta invención constituye un aspecto adicional de esta invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta que es un clon o un descendiente de una planta transformada o transgénica proporcionada por esta invención. 25 En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta hı́brida con resistencia mejorada a la infección por CYSDV, preparada por cruce de una planta transgénica o de una planta transformada proporcionada por esta invención, o de un clon o descendiente de dichas plantas, con una segunda planta susceptible a la infección por CYSDV. 30 En otro aspecto, la invención se relaciona con un propágulo de una planta transgénica o de una planta transformada proporcionada por esta invención, o de un clon o descendiente de dichas plantas. En una realización particular, dicho propágulo comprende una semilla. 35 En otro aspecto, la invención se relaciona con una semilla de una planta que comprende (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i), es decir, la segunda secuencia de nucleótidos definida en la construcción de la invención. 40 En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicha construcción de la invención en la producción de plantas, por ejemplo, plantas transgénicas, con resistencia mejorada frente a CYSDV. 45 Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para generar resistencia frente a CYSDV en plantas susceptibles a la infección por dicho virus que comprende transformar una célula vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con una construcción de la invención y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada. 50 55 60 La construcción de la invención puede ser utilizada en procesos de mejora de plantas susceptibles de ser infectadas por CYSDV, tales como las cucurbitáceas, algunas de las cuales, o sus frutos, son consumidas por los seres humanos o por los animales. Estas plantas con resistencia mejorada frente a CYSDV constituyen una importante mejora de las plantas tradicionales puesto que permiten aumentar el rendimiento de las cosechas, reduciendo de ese modo las pérdidas económicas causadas por CYSDV. En una realización particular, una construcción de la invención se utilizó para transformar una cepa desarmada de Agrobacterium. La integridad de las secuencias introducidas en Agrobacterium se comprobó mediante ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Una cepa de Agrobacterium portadora de la construcción genética ı́ntegra se utilizó para transformar plantas de melón y de pepino utilizando procedimientos habituales. A partir de esa transformación se obtuvo un número de plantas capaces de crecer en medio de selección y, por tanto, supuestamente transgénicas. La presencia del transgén en esas plantas se confirmó mediante PCR. Aquellas plantas que resultaron positivas mediante este ensayo (generación T0) se seleccionaron para llevar a cabo ensayos preliminares de susceptibilidad a la infección viral en T0 y para obtener semillas de una siguiente generación (T1). Los ensayos preliminares de susceptibilidad en T0 sirvieron para seleccionar lı́neas de T1 que se ensayaron también para susceptibilidad a la infección 8 ES 2 200 696 A1 por CYSDV. Los ensayos de susceptibilidad a CYSDV se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 3. 5 Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma. Para la realización de la parte experimental se ha seguido, de forma general, a Sambrook y Russell (2001) en las técnicas de Biologı́a Molecular y a Foster y Taylor (1998) en las técnicas de Virologı́a. Ejemplo 1 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Secuenciación del RNA1 de CYSDV Para la secuenciación del RNA1 de CYSDV se usó como molde dsRNA purificado a partir de plantas de pepino infectadas con el virus. La preparación de dsRNA se hizo como se describe en Valverde y col. (1990) incluyendo las modificaciones descritas por Célix y col. (1996). A partir de este dsRNA se generó una librerı́a de cDNA utilizando oligonucleótidos al azar, obteniéndose en torno a 500 clones recombinantes. Una proporción de estos clones fue secuenciada en sus extremos utilizando los oligonucleótidos M13 universal y reverse, capaces de iniciar la reacción de secuenciación en regiones del vector utilizado en el clonaje que son flanqueantes a los insertos. Las secuencias ası́ obtenidas se compararon con la secuencia correspondiente al RNA1 de LIYV (Klaasen y col., 1995). Cuatro de los clones secuenciados mostraron homologı́a de secuencia con regiones genómicas del RNA1 de LIYV (señaladas con un segmento horizontal sombreado en la Figura 2). Las secuencias de estos clones se utilizaron para generar otro conjunto de clones de cDNA que cubrieran la longitud completa del RNA1 de CYSDV usando dos estrategias: una para generar clones de cDNA a los extremos 5’ y 3’ del RNA1, y otra para generar clones internos. Para generar clones de cDNA a los extremos 5’ y 3’ del RNA1 se procedió como sigue. En primer lugar se añadió una cola de poli(A) a los extremos 3’-OH libres de los dsRNAs. Ası́, a 9 µl de dsRNA a una concentración aproximada de 10 ng/µl se añadió 1 µl de hidróxido de metil mercurio 0,1 M (SIGMA Chemical Co., St Louis, MO, USA) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Al cabo de ese tiempo se añadió 1 µl de (β-mercaptoetanol 1,4 M, se mezcló y se incubó en hielo durante 10 minutos. A esta mezcla se añadieron 4 µl de tampón concentrado 5 veces de la poli(A) polimerasa de levadura (USB Co., Cleveland, Ohio, USA), 1 µl de ATP 2 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech, UK), 1 µl de poli(A) polimerasa de levadura (USB) y 2 µl de agua. Esta mezcla se incubó a 37◦ C durante 30 minutos, se extrajo con fenol-cloroformo y se precipitó con etanol. El concentrado seco resultante de esta precipitación se disolvió en 11 µl de agua y se le añadió 1 µl de hidróxido de metil mercurio 0,1 M, se incubó 10 minutos a temperatura ambiente y se le añadió 1 µl de (βmercaptoetanol 1,4 M. A continuación, se procedió a la sı́ntesis de cDNA utilizando un oligo(dT) que iniciase en la cola de poli(A) añadida. Ası́, a los 13 µl anteriores se anadieron 5 µl de tampón 5 veces concentrado de la transcriptasa reversa (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 2 µl de dNTPs 5 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech), 1 µl de DTT 100 mM, 1 µl de transcriptasa reversa (Expand RT, Boehringer) y 2 µl de oligo(dT) a una concentración de 100 ng/µl. Esta mezcla se incubó durante 1 h y 30 minutos a 37◦C. Al cabo de este tiempo se procedió a amplificar por PCR los cDNAs ası́ generados mediante el uso de oligonucleótidos especı́ficos diseñados a partir de las secuencias previamente obtenidas (segmentos horizontales sombreados en la Figura 2) y el oligo(dT). El oligonucleótido empleado para amplificar el extremo 3’ se denominó U28-475 y el oligonucleótido empleado para amplificar el extremo 5’ se denominó U31-617 (Tabla 1). La amplificación por PCR dió lugar a fragmentos de DNA únicos y de aproximadamente 1,8 kbp y 0,9 kbp para los extremos 3’ y 5’, respectivamente. Ambos fragmentos fueron ligados al plásmido pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) y clonados en E. coli. Por cada fragmento de cDNA se secuenciaron dos clones (clones pLM0,9-11, pLM0,9-12, pLM2 y pLM44; Figura 2) y cada posición (nt) en esos clones ha sido leı́da al menos dos veces. TABLA 1 Oligonucleótidos utilizados 55 60 Nombre Secuencia 5’-3’ del oligonucleótido Posición en el RNA1 de CYSDV MA146 U31-617 511 CCATGTTAAGGTAGTACTGG GTTTACAGGATTTTATGGTC TATGGTACCCGTTACAAGTCT 841-860 950-931 1235-1255 9 ES 2 200 696 A1 TABLA 1 (Continuación) Oligonucleótidos utilizados Nombre 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 MA147 U148-1274 U148-32 U28-475 L28-821 Oligo(dT) MA160 MA161 MA174 Secuencia 5’-3’ del oligonucleótido Posición en el RNA1 de CYSDV CTGGGCATAGCAATCTTGGCTC AGGGAAGGTCACTCAAATCA CGGATTGAAAAACTGTTGA CCCGATCCGAAGGTCAGATT TGTCGGAAAAGAAATGATT CCCTCTAGATATCTCGAGTCGAC(T)17 CGCATATGTCCTTGGTAAATCC GTCCCGGGTTCCAGTATATCTCG GTCCCGGGTGTGATAAGCCTCC 1314-1293 2605-2624 3058-3040 7301-7320 7665-7647 6116-6132 6974-6958 6827-6812 Para generar clones internos a los extremos del RNA1 se diseñaron oligonucleótidos especı́ficos a partir de las secuencias obtenidas inicialmente (señaladas con un segmento horizontal sombreado en la Figura 2) que se usaron en reacciones de RT-PCR usando como molde dsRNA. Estos oligonucleótidos especı́ficos fueron MA147, U148-32 y L28-821, complementarios a la supuesta secuencia viral, y MA146, 511 y U148-1274, idénticos a la supuesta secuencia viral (Tabla 1). En el experimento de RT-PCR se utilizaron las combinaciones de oligonucleótidos siguientes: MA147 y MA146, U148-32 y 511 y L28-821 y U148-1274. La sı́ntesis de la primera cadena del cDNA se realizó utilizando 10 µl de dsRNA de plantas infectadas a una concentración de 10 ng/µl por cada una de las tres combinaciones de oligonucleótidos empleados. A este RNA se añadió 1 µl de hidróxido de metil mercurio 0,1 M y se mantuvo a temperatura ambiente 10 minutos. A continuación se añadieron los reactivos siguientes: 1 µl de β-mercaptoetanol 1,4 M, 5 µl del tampón de transcriptasa reversa concentrado 5 veces (Boehringer Manheinn, Manheinn, Alemania), 1 µl de una mezcla de dNTPs 10 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech, UK), 1 µl de DTT 100 mM, 1 µl de transcriptasa reversa (Expand RT, Boehringer), 2 µl de los oligonucleótidos complementarios (a una concentración de 100 ng/µl), todo ello en un volumen final de 25 µl. Esta mezcla se mantuvo a 37◦C durante 1 h y 20 minutos. A continuación, se procedió a la sı́ntesis de la segunda cadena del cDNA. A 1 µl de la mezcla anterior se añadieron 5 µl de tampón de polimerasa Taq concentrado 10 veces (Bioline, Londres, UK), 2 µl de Cl2 Mg 25 mM, 1 µl de dNTPs 10 mM, 0,5 µl de los oligonucleótidos idénticos a la secuencia viral (a una concentración de 100 ng/µl) y 1 µl de polimerasa Taq (BioTaq; Bioline, Londres, UK), todo ello en un volumen final de 50 µl. Esta mezcla se sometió a los siguientes ciclos de PCR: un ciclo de desnaturalización a 94◦ C durante 4 minutos, treinta ciclos de desnaturalización a 94◦ C durante 30 s seguida de la hibridación de los oligonucleótidos a 45◦C durante 30 s seguida de la polimerización del cDNA a 72◦ C durante 3 minutos, y un ciclo final de polimerización a 72◦ C durante 7 minutos. El resultado del PCR se comprobó por electroforesis de una alı́cuota en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Tras transiluminación con luz ultravioleta, en este gel se observaron bandas especı́ficas de los tamaños aproximados 0,5 kbp, 1,8 kbp y 5 kbp para las combinaciones de oligonucleótidos MA146/MA147, 511/U148-32 y U148-1274/L28-821, respectivamente. Estos fragmentos de DNA fueron ligados al plásmido pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) o al plásmido pGEM-T Easy vector System II (Promega Co., Madison, WI, USA) y clonados en E. coli. Por cada fragmento de cDNA se secuenciaron dos clones (clones pLM0,5-7, pLM0,5-9, pLM12-2, pLM12-9, pLM15 y pLM24; Fig. 2) y cada posición (nt) en esos clones ha sido leı́da al menos dos veces. Ejemplo 2 Preparación de las construcciones genéticas usadas para transformar plantas 55 60 Para la preparación de la construcción genética usada para transformar plantas se procedió como se esquematiza en la Figura 7. Mediante el uso de los oligonucleótidos MA160 y MA161 (Tabla 1) se amplificó mediante PCR sobre el plásmido pLM15 (Figura 2) un fragmento de DNA de 858 nt (nt 6116 al nt 6974 de la secuencia del RNA 1 de CYSDV [Figura 1]). Este fragmento se ligó al plásmido pGEM-T Easy System II (Promega) y se clonó en E. coli dando lugar a la construcción pRdRp (Figura 7). Usando los oligonucleótidos MA160 y MA174 se amplificó un fragmento de DNA de 711 nt (nt 6116 al nt 6827 de la secuencia del RNA1 de CYSDV [Figura 1]). De nuevo, este fragmento se ligó al plásmido pGEM-T Easy System II (Promega) y se clonó en E. coli dando lugar a la construcción p5’RdRp (Figura 7). El 10 ES 2 200 696 A1 5 10 15 fragmento EcoRI de 730 nt del pásmido p5’RdRp se escindió del plásmido, se purificó y se hizo romo en sus extremos (fragmento EcoRI-blunt) mediante tratamiento con el fragmento klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli. Este fragmento se ligó al vector pRdRp, que previamente se habı́a linearizado con SmaI. La ligación se usó para transformar E.coli y se seleccionaron colonias que hubieran incorporado el fragmento EcoRI-blunt en orientación opuesta a la del inserto correspondiente a la secuencia de CYSDV preexistente en pRdRp. Ası́ se originó la construcción denominada pIRRdRp (Figura 7). De esta construcción se escindió el fragmento EcoRI que se insertó en el sitio EcoRI del plásmido pExSem-2. El plásmido pExSem-2 es un derivado de pUC18 (Sambrook y col., 1989) que contiene el promotor y el terminador del 35S de CaMV (P35S y T35S, respectivamente); en pExSem-2, P35S y T35S están flanqueados por dianas de restricción HindIII y entre ellos existen otras tres dianas, EcoRI, NcoI y NdeI. Este último paso dio lugar a la construcción pExIRRdRp (Figura 7). El fragmento HindIII de pExIRRdRp fue escindido, purificado de gel de agarosa y ligado al vector psvs297-NOS que previamente se habı́a linearizado con HindIII. Las bacterias transformadas con esta ligación y que portaban el inserto adecuado fueron seleccionadas, dando lugar a la construcción psvsExIR (Figura 7), que es la que se ha utilizado para transformar plantas. Ejemplo 3 Análisis de la susceptibilidad de plantas a la infección viral 20 25 30 El procedimiento seguido para analizar la susceptibilidad de plantas a la infección por CYSDV ha comprendido los pasos de i) inoculación en condiciones controladas del virus en las plantas a testar y en los correspondientes controles y ii) seguimiento del desarrollo de la enfermedad y del progreso del virus en las plantas inoculadas. Los métodos de mantenimiento e inoculación de plantas con CYSDV están descritos en López-Sesé y Gómez-Guillamón (2000). Aquı́ se describen los métodos utilizados para la estima de la gravedad de sı́ntomas inducidos por CYSDV y para la medida de la acumulación de CYSDV en las plantas inoculadas. Para la comparación de sı́ntomas se elaboró una escala (0 a 5) de la gravedad de los sı́ntomas que puede inducir CYSDV en melón y pepino (Tabla 2). TABLA 2 Escala de la gravedad de los sı́ntomas que CYSDV puede inducir en plantas de melón y pepino 35 40 Escala Descripción 0 No sı́ntomas Ninguna hoja completamente amarilla. Clorosis internervial sólo en hojas basales, el resto de las hojas tiene moteado clorótico suave hasta la hoja 15 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay sı́ntomas. Ninguna hoja completamente amarilla. Clorosis internervial hasta la hoja 5 contada desde la hoja inoculada. Desde ésta, moteado clorótico hasta la hoja 14-15 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay sı́ntomas. 2 hojas básales completamente amarillas exceptuando los nervios, que permanecen verdes. Desde éstas, clorosis internervial en hojas basales que según se asciende en la planta se torna en moteado clorótico. La última hoja con moteado clorótico es la 11-12 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay sı́ntomas. 1-2 hojas básales completamente amarillas, las 2 siguientes amarillas con nervios verdes. Desde éstas, clorosis internervial en hojas basales que según se asciende en la planta se torna en moteado clorótico. La última hoja con moteado clorótico es la 7 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay sı́ntomas. 3-4 hojas básales completamente amarillas. Sı́ntomas de clorosis internervial y moteado clorótico hasta la 2-3 hoja contada desde el ápice. 1 2 45 3 50 55 4 5 60 Utilizando dicha escala, se realizaron estimas de gravedad de sı́ntomas sobre plantas correspondientes a lı́neas transgénicas y controles no transgénicos inoculadas simultáneamente; además, para minimizar 11 ES 2 200 696 A1 5 efectos no debidos a la infección viral sobre el desarrollo de sı́ntomas, el número y distribución de las plantas siempre obedeció a un diseño experimental apropiado. La determinación de la presencia ó ausencia de CYSDV y/o su nivel de acumulación en tejidos de plantas se realizó sobre muestras tomadas a las dos semanas y a las cinco semanas post-inoculación. La estima de la gravedad de sı́ntomas se realizó a las cinco semanas post-inoculación (siete semanas post-transplante desde el semillero a maceta). Los muestreos se realizaron en seis niveles distintos de las plantas analizadas: en la hoja cuarta sobre la hoja inoculada (nivel I), en la octava (nivel II), en la 16 (nivel III), en la 22 (nivel IV), en la 26 (nivel V) y en la 30 (nivel VI). Cada nivel fue tratado independientemente, para poder ası́ seguir la evolución de la distribución espacial de la infección viral en cada entrada de germoplasma considerada. 10 15 20 25 30 35 40 45 La presencia ó ausencia de CYSDV en material vegetal se determinó mediante la detección del virus utilizando las técnicas de hibridación molecular en improntas sobre membranas de nylon de secciones de tejidos (tissue-print; ver para un ejemplo Narváez y col., 2000). Además, en determinadas ocasiones fue necesario estimar la cantidad de virus y no sólo su presencia ó ausencia. Para ello se utilizó una técnica basada en la hibridación molecular conocida como dot-blot cuantitativo. El dot-blot cuantitativo consistió, brevemente, en lo siguiente. El RNA total de muestras de plantas (0,2 g) se extrajo siguiendo el método descrito por Célix y col. (1996). A continuación, por un lado se sometió a electroforesis en geles de agarosa una alı́cuota de estos extractos con objeto de estimar la cantidad de RNA total presente con respecto a patrones de cantidades conocidas y, por otro lado, se insertaron alı́cuotas de estos extractos en membranas de nylon que se sometieron a un proceso estándar de detección del RNA viral por hibridación molecular frente a una sonda diseñada para detectar especı́ficamente RNA viral. Para la realización de los dot-blots cuantitativos se insertaron también en las membranas cantidades conocidas de RNA viral que posibilitaron obtener para cada blot una curva patrón de cantidades de RNA viral frente a señal de hibridación. Las señales de hibridación se cuantificaron por densitometrı́a óptica. Las curvas patrones permitieron deducir por intrapolación las cantidades absolutas de RNA viral presente en cada extracto de RNA total. Finalmente, las cantidades absolutas de RNA viral se refirieron a las cantidades absolutas de RNA total de cada muestra. La sonda utilizada en las hibridaciones moleculares, tanto en improntas de tejidos como en dot-blot, fue de cRNA y obtenida por transcripción in vitro utilizando como molde el plásmido pLM12.2 (Figura 2). Es de destacar que este plásmido contiene una secuencia viral distinta de la usada para crear el transgén y que, por tanto, la sonda derivada de este plásmido sólo detecta RNA del virus y no RNA de tipo viral generado a partir del transgén. Para la preparación de las sondas se procedió como se describe a continuación. El plásmido pLM12.2 se linearizó utilizando el enzima de restricción SphI Para la reacción de transcripción in vitro se utilizaron 10 µl de este DNA linearizado a una concentración de 100 ng/µl a los que se añadieron 20 µl de tampón de transcripción concentrado 5 veces (Amersham Pharmacia Biotech), 10 µl de DTT 100 mM, 20 µl de una mezcla de rNTPs 2,5 mM que contiene DIG-11-UTP (Boehringer) en una concentración 1 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech) y 50 U de la transcriptasa SP6 (Amersham Pharmacia Biotech), todo ello en un volumen final de 100 µl. Esta mezcla se mantuvo a 37◦C durante 1 h 30 minutos. Transcurrido este tiempo se añadieron 10 U de DNasa libre de RNasas (Boehringer) y se continuó la incubación durante otros 30 minutos. A continuación, se añadieron a la mezcla 4 µl de EDTA 0,5 M, 5 µl de ClLi 8 M y 300 µl de etanol puro, se mantuvo a -20◦C durante 3 h y el cRNA precipitado se concentró por centrifugación. El precipitado seco se resuspendió en 50 µl de agua a los que se añadieron otros 50 µl de tampón carbonato de pH 10,2 para proceder a la hidrólisis controlada del cRNA. Esta mezcla se mantuvo a 60◦ C durante 56 minutos y, a continuación, se añadieron 5 µl de ácido acético al 10 %, 10 µl de acetato sódico 3 M y 250 µl de etanol puro. Se mantuvo a -20◦C durante 3 h y el cRNA precipitado se concentró mediante centrifugación. El precipitado seco se resuspendió en 100 µl de formamida al 50 %. La sonda ası́ preparada se utilizó a diluciones 1:1000 en tampón estándar de hibridación, siguiendo los procedimientos al uso. 50 Referencias Abou-Jawdah Y, Sobh H, Fayad A, Lecoq H, Delecolle B, Trad-Ferre J (2000) Cucurbit yellow stunting disorder virus - a new threat to cucurbits in Lebanon. 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Una construcción de ácido nucleico que comprende 5 una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV), y 10 (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i). 2. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (i) comprende una secuencia de nucleótidos del ORF 1b del RNA1 del CYSDV. 15 3. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (i) comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2. 4. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (ii) comprende la repetición invertida de la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2. 20 25 5. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, una secuencia de nucleótidos (iii), espaciadora, entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii). 6. Construcción según la reivindicación 5, en la que dicha secuencia de nucleótidos (iii) espaciadora comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 3. 7. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha primera secuencia de nucleótidos comprende un promotor funcional en plantas. 30 8. Construcción según la reivindicación 7, en la que dicho promotor funcional en plantas es un promotor constitutivo, inducible o especı́fico de tejido. 9. Construcción según la reivindicación 8, en la que dicho promotor funcional en plantas es el promotor 35S del Virus del mosaico de la coliflor (CaMV). 35 40 10. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, un terminador de la transcripción funcional en plantas. 11. Construcción según la reivindicación 10, en la que dicho terminador de la transcripción funcional en plantas es el terminador poli(A) de CaMV. 12. Construcción según la reivindicación 1, que comprende un promotor funcional en plantas capaz de regular la transcripción en plantas de una segunda secuencia de nucleótidos, y un terminador de la transcripción funcional en plantas, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: 45 (i) la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2; (ii) la repetición invertida de dicha SEQ. ID. N◦ : 2; y 50 55 (iii) entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii), la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 3. 13. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, una tercera secuencia de nucleótidos que permite seleccionar una planta transformada con dicha construcción, estando dicha tercera secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos y a un terminador de la transcripción funcional en plantas. 14. Construcción según la reivindicación 13, en la que dicha tercera secuencia de nucleótidos comprende el gen de la neomicin-fosfotransferasa II, capaz de conferir resistencia a kanamicina en una planta transformada con dicha construcción. 60 15. Construcción según la reivindicación 13, en la que dicho promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos es el promotor del gen nopalin sintetasa (pNOS). 15 ES 2 200 696 A1 16. Construcción según la reivindicación 13, en la que dicho terminador de la transcripción funcional en plantas es el terminador poli(A) del gen NOS. 5 17. Un vector que comprende una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. 18. Una célula vegetal transformada con una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o con un vector según la reivindicación 17. 10 19. Una célula vegetal transgénica que comprende, integrada en su genoma, una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. 20. Una planta transgénica que comprende, al menos, una célula transgénica según la reivindicación 19. 15 21. Una planta transformada con una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o con un vector según la reivindicación 17. 22. Una planta que es un clon o un descendiente de la planta de la reivindicación 20 ó 21. 20 23. Una planta hı́brida con resistencia mejorada frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV), preparada por cruce de una planta transgénica según la reivindicación 20, una planta transformada según la reivindicación 21, o un clon o descendiente de las mismas, según la reivindicación 22, con una segunda planta susceptible a la infección por CYSDV. 25 24. Un propágulo de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23. 25. Propágulo según la reivindicación 24, que comprende una semilla. 30 26. Una semilla de una planta que comprende la segunda secuencia de nucleótidos definida en las reivindicaciones 1 a 6. 35 27. Un método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas susceptibles a la infección por CYSDV, que comprende transformar una célula vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada. 40 28. Uso de una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la producción de una planta transgénica con resistencia mejorada a la infección por CYSDV. 45 50 55 60 16 ES 2 200 696 A1 17 ES 2 200 696 A1 18 ES 2 200 696 A1 19 ES 2 200 696 A1 20 ES 2 200 696 A1 21 ES 2 200 696 A1 22 ES 2 200 696 A1 23 ES 2 200 696 A1 24 ES 2 200 696 A1 25 ES 2 200 696 A1 26 ES 2 200 696 A1 27 ES 2 200 696 A1 28 ES 2 200 696 A1 29 ES 2 200 696 A1 30 ES 2 200 696 A1 31 ES 2 200 696 A1 Figura 7 32 ES 2 200 696 A1 LISTA DE SECUENCIAS <110> Consejo Superior de Investigaciones Cientı́ficas 5 <120> Métodos para generar resistencia frente al Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a CYSDV obtenidas mediante dicho método. <160> 3 10 <210> 1 <211> 9123 15 <212> ADN <213> Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) <400> 1 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1 ES 2 200 696 A1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2 ES 2 200 696 A1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3 ES 2 200 696 A1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4 ES 2 200 696 A1 5 10 15 20 25 <210> 2 <211> 711 <212> ADN 30 <213> Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) <400> 2 35 40 45 50 55 <210> 3 <211> 146 <212> ADN 60 <213> Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) <400> 3 5 ES 2 200 696 A1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6 kES 2 200 696 kN. solicitud: 200201437 kFecha de presentación de la solicitud: 21.06.2002 kFecha de prioridad: OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS 11 ESPAÑA 22 21 ◦ 32 INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 51 Int. Cl.7 : C12N 15/11, 15/40, A01H 5/00 DOCUMENTOS RELEVANTES Categorı́a Documentos citados Reivindicaciones afectadas Y WATERHOUSE et al. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc. Natl. Acad. Sci., 1998, Vol. 95, páginas 13959-13964. (Citado en la solicitud) 1-2,5-11, 13-28 Y CELIX, ANA et al. Characterizacion of cucurbit yellow stunting disorder virus, a Bemisia tabaci-transmitted closterovirus. Phytopathology, (1996), 86 (12), 1370-1376. (Citado en la solicitud) 1-2,5-11, 13-28 A KLAASSEN V.A. et al. Genome structure and phylogenetic analysis of lettuce infectious yellowsvirus, a whitefly-transmitted, bipartite closterovirus. Virology, 1995, 208 (1): 99-110. 1-28 A WO 9502056 A2 (THE UPJOHN COMPANY) 19.01.1995 1-28 Categorı́a de los documentos citados X: de particular relevancia O: referido a divulgación no escrita Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación misma categorı́a A: refleja el estado de la técnica de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones Fecha de realización del informe 26.01.2004 para las reivindicaciones n◦ : Examinador M. Hernández Cuéllar Página 1/1