Regeneración in vitro de plantas de paraíso por cultivo de raíces

Regeneración in vitro de plantas de paraíso
por cultivo de raíces
Vila, Silvia K. - Rey, Hebe Y. - Mroginski, Luis A.
IBONE - CC 209 - Facultad de Ciencias Agrarias - UNNE.
Sargento Cabral 2131 - (3400) Corrientes - Argentina.
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ANTECEDENTES
El uso de raíces como una fuente de explante para propagación in vitro es limitado a un pequeño número de
especies (Bhat et. al., 1992; Vinocur et. al., 2000; Kerbauy, 1991, 1993).
La regeneración de yemas en cultivo de raíces ha sido observada, principalmente en especies que, normalmente,
presentan esa capacidad en condiciones naturales (Kerbauy, 1998). En paraíso se informó acerca de la capacidad
de brotación de raíces de árboles de 12 años de edad que crecían bajo condiciones de disturbio (Tourn et. al.,
1999). Sin embargo, aun no se han publicado trabajos acerca de la obtención de plantas a través del cultivo in
vitro de raíces.
En este trabajo se da a conocer un procedimiento que permite la obtención de yemas y posteriormente de plantas
a partir del cultivo in vitro de raíces de paraíso.
MATERIALES Y METODOS
Se trabajó con Melia azedarach L. Semillas obtenidas de árboles que crecen en la Facultad de Cs. Agrarias
(UNNE) fueron desinfectadas en etanol al 70% (durante 2 min.), seguido de su inmersión en NaOCl al 0.8 % + 2
gotas de Tween (durante 15 min.) y finalmente, fueron lavadas con agua destilada estéril. Las semillas fueron
asépticamente puestas a germinar en frascos de vidrio. Las raíces de plantas de 15 días fueron desinfectadas en
etanol 70% (20 segundos) y posteriormente sumergidas en una solución de NaOCl (0,3 %) durante 5 minutos y
enjuagadas 4 veces con agua destilada estéril.
La raíces secundarias (2 cm. de longitud) fueron cultivadas en tubos de vidrio de 11 cc., conteniendo 3 ml del
medio MS (Murashige & Skoog, 1962) diluido 4 veces (3% sacarosa) y suplementado con diferentes
concentraciones y combinaciones entre benciladenina (BAP), hemisulfato de adenina (SA), cinetina (CIN) y
thidiazuron (TDZ). El pH de los medios fue ajustado a 5,8, antes del agregado de 0,7 % de agar. Los tubos
fueron obturados con papel de aluminio y esterilizados en autoclave durante 20 min. a 0,101 MPa. Los cultivos
(obturados con Resinite AF 50) fueron incubados en oscuridad o luz a 27 ± 2oC, con un fotoperíodo de 14 hs.
(116 µm/seg/m2). Los resultados fueron analizados con análisis de variancia y las comparaciones de medias
fueron hechas con el test de comparación múltiple de Duncan al nivel 5% de probabilidad.
RESULTADOS Y DISCUSION
Al cabo de 30 días de cultivo se pudo apreciar la diferenciación de yemas a partir de raíces secundarias, las
mejores respuestas fueron logradas en los medios que contenían TDZ, mantenidos en condiciones de luz (Fig. 1).
Cuando los explantes fueron incubados en condiciones de oscuridad, los valores de regeneración de yemas
disminuyeron y la permanencia bajo estas condiciones produjo la mortandad de las mismas.
Fig. 1. Efecto de 6 medios de cultivo sobre la obtención de yemas a partir de raíces, mantenidos
bajo condiciones de oscuridad y luz (la barra indica la media ± el error estándar).
KIN 0.1 + SA 3
50
5.0
25
2.5
0
0.0
mg/L
% de explantes c/yemas
No de yemas
TDZ 3
TDZ 0. 1
TDZ 0.0 1
BAP 6
BAP 3
BAP 1
TDZ 3
TDZ 0. 1
TDZ 0.0 1
0.0
BAP 6
0
BAP 3
2.5
BAP 1
25
7.5
o
5.0
75
N de yemas/explante
50
Explantes c/yemas (%)
Luz
7.5
No de yemas/explante
Explantes c/yemas (%)
Oscuridad
75
KIN 0.1 + SA 3
mg/L
% de explantes c/yemas
No de yemas
Con el fin de mejorar las respuestas se ensayaron concentraciones más bajas de BAP y TDZ. Si bien, no se
obtuvieron diferencias en cuanto a número promedio de yemas por explante, se apreciaron diferencias
significativas entre tratamientos en cuanto a porcentaje de explantes con yemas, siendo el mejor medio para tal
fin ¼ MS +BAP 0,1 mg/L + KIN 0,1 mg/L + SA 3 mg/L (P<0,05) (Fig. 2).
7.5
50
5.0
25
2.5
0
0.0
TDZ 1
mg/L
KIN 0,1 + SA 3
% de explantes con yema
TDZ 0,1
TDZ 0,01
BAP 2
BAP 1
BAP 0,1
o
75
N de yemas/explante
Expl. c/yemas (%)
Fig. 2. Efecto de 6 medios de cultivo sobre la obtención de yemas a partir de raíces (la
barra indica la media ± el error estándar).
N o de yemas
Con el fin de obtener vástagos las yemas fueron subcultivadas a cuatro medios de cultivo. Fue posible la
elongación de yemas provenientes de todos los medios de cultivo de origen. Si bien, hubo elongación de yemas
en todos los medios ensayados, el mejor medio fue MS + BAP 0,1 mg/L + KIN 0,1 mg/L + SA 0,6 mg/L excepto
para el origen 1/4 MS + BAP 2 mg/L + KIN 0,1 mg/L + SA 0,6 (Fig. 3), esto podría deberse a que las yemas
formadas en este medio no fueron tan vigorosas como aquellas formadas con menores concentraciones de BAP.
Fig. 3. Efecto del medio de origen de yemas y del medios de elongación de
estas sobre la obtención de vástagos (la barra indica la media ± el error
estándar).
% de vástagos
80
60
40
20
0
1/4 MS + BAP 0,1
+ KIN0,1 + SA 3
1/4 MS + BAP 1
+ KIN0,1 + SA 3
1/4 MS + BAP 2
+ KIN0,1 + SA 3
Medios de origen en mg/L
% de vástagos
80
60
40
20
0
1/4 MS TDZ 0,01
1/4 MS TDZ 0,1
1/4 MS TDZ 1
Medios de origen en mg/L
MS
MS + BAP 0,01mg/L + KIN 0,1 mg/L + SA 0,6 mg/L
MS + AG 0,1 mg/L
MS + AG 1 mg/L
Para la obtención de plantas, los vástagos fueron subcultivados al medio de enraizamiento MS + IBA 2,5 mg/L
durante 4 días de inducción. El porcentaje de enraizamiento dependió de los medios de obtención de vástagos de
donde provenían (Fig. 4). Lográndose los mejores porcentajes en los vástagos que provenían de MS y MS +
BAP 0,1 mg/L + KIN 0,1 mg/L + SA 0,6 mg/L.
Fig. 4. Efecto del medio de elongación de yemas sobre el enraizamiento de vástagos en MS +
2,5 mg/L de IBA (la barra indica la media ± el error estándar).
Enraizamiento (%)
100
75
50
25
0
MS
MS + BAP 0.1 + KIN 0.1 + SA 0.6
M S + AG 0.1
M S + AG 1
Medios de 1er subcultivo en mg/L
2,5 mg/L de IBA durante 4 días
CONCLUSIONES
Se concluye que es factible la regeneración de plantas de Melia azedarach, a partir de raíces provenientes de
plantas de 15 días; recomendándose el siguiente procedimiento: a) Inducción de yemas por cultivo de raíces
secundarias de 2 cm en MS + BAP 0,1 mg/L + KIN 0,1 mg/L + SA 3 mg/L, mantenidos en luz. b) Elongación de
las yemas obtenidas en el medio MS + BAP 0,1 mg/L + KIN 0,1 mg/L + SA 0,6 mg/L. c) Enraizamiento de los
vástagos regenerados mediante su cultivo en MS + 2,5 mg/L de IBA durante 4 días de inducción.
BIBLIOGRAFIA
Bhat, S.R.; P. Chitralekha & K.P.S. Chandel. 1992. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 29: 19 - 25.
Kerbauy, G.B. 1991. J. Plant Physiol. 138: 248 - 251.
Kerbauy, G.B. 1993. Revta brasil. Bot. 16(1): 1 - 8.
Kerbauy, G.B. 1998. In: Torres, A.C.; L.S. Caldas & J.A. Buso (eds.). Cultura de Tecidos e Transformaςão
Genética de Plantas. pp 161 - 181. Embrapa-SPI.
Murashige, T. & F. Skoog. 1962. Physiol. Plant.15: 473 - 497.
Tourn, G.M.; M.F. Menvielle; A.L. Scopel & B. Pidal. 1999. Plant and soil. 217:111 - 117.
Vinocur, B.; T. Carmi; A. Altman & M. Ziv. 2000. Plant Cell Reports. 19: 1146 - 1154.