Genética Microbiana Tema 9 DNA móvil Barbara McClintock (1902-1992) Variegación del color de los granos de maíz El color oscuro se pierde en algunos grupos de células de aquellos heterocigotos C/c que portan al menos una copia del alelo Ac (dominante) En algunos granos el alelo C ha mutado (alelo Cu) dando color claro, pero revierte con mucha facilidad (manchas oscuras) La inestabilidad de C se debe a la presencia en el mismo cromosoma de un elemento Ds+, que provoca la pérdida del extremo del cromosoma, donde se localiza C La inestabilidad de C se debe a la presencia en el mismo cromosoma de un elemento Ds+, que provoca la pérdida del extremo del cromosoma, donde se localiza C Ds es un transposón defectivo, que necesita de la transposasa de Ac para saltar. Su salto puede provocar la rotura del cromosoma Muchos fenotipos variegados se deben a la acción de elementos móviles en el genoma Detección de un elemento móvil bacteriano por su inserción en un fago lambda (aumento de su densidad) Hibridación de DNA de fagos lamda silvestres con mutantes que llevan una secuencia IS: estructuras en “chupachup” debido a las secuencias repetidas invertidas de las IS Las secuencias IS controlan su propia transposición hisG 707 hisD 595 hisC 142 IS200 ORF translational repressor (bp 66-139) 1 p transcriptional terminator (bp 9-32) Algunos transposones procarióticos Un transposón surge por combinación de dos IS Un transposón surge por combinación de dos IS Estructura en “chupachup” producida por la hibridación de secuencias repetidas invertidas La evolución de los transposones puede eliminar las secuencias IS autónomas en los extremos Plásmido Plásmido R que lleva un transposón Integrón El cointegrado es un intermediario en la transposición replicativa El cointegrado es un intermediario en la transposición replicativa Transposición no replicativa: Tn10 La transposición produce pequeñas repeticiones directas de la secuencia diana La transposición puede conllevar la formación de deleciones en las secuencias adyacentes Taylor, 1963 Fago Mu (“Mutador”) ~1% de los lisógenos son auxótrofos El profago Mu se inserta aleatoriamente en el genoma del hospedador Tras la inducción, Mu se replica transponiéndose Fago Mu El fago Mu se transpone de forma masiva antes de lisar El fago Mu transduce los genes adyacentes: al empaquetarse se lleva 2 kb adicionales -35 -10 GATCCCTAGTAATGG CTAGGGATCATTACC Promotor metilado = inactivo Promotor hemimetilado o desmetilado = activo DNA DNA Elementos de inserción (IS) Transposones compuestos Transposones con resolvasa (familia Tn3) Integrones Transposones conjugativos DNA RNA DNA Retrones Retrotransposones Intrones móviles etc. Retrovirus y retrotransposones Retrovirus y retrotransposones Retrotransposón con repeticiones terminales largas (LTR) Retrotransposones de levaduras: elementos Ty Retrotransposones de levaduras: elementos Ty Retrotransposones de levaduras: elementos Ty Retrotransposones de levaduras: elementos Ty Ty-1 Ventajas de los transposones como mutágenos 1. Pueden insertarse en muchos sitios 2. El gen interrumpido sufre pérdida total de función 3. El transposón confiere a la mutación un fenotipo seleccionable 4. La reversión de la mutación está asociada a la pérdida del marcador del transposón 5. Las inserciones en operones son polares sobre los genes distales F’ 114 ts lac+ zzf::Tn10 Selección: Resistencia a tetraciclina Control de ausencia del vector: Fenotipo Lac- en medio indicador Procedimientos de contraselección: 1. Incubación a temperatura restrictiva 2. Transducción no homóloga Ejemplo de escrutino: búsqueda de auxótrofos E. coli portadora del F’ ts lac+ zzf::Tn10 Incubación a 42oC étodos de Gen é Medio MacConkey Estirpe donadora: lleva un plásmido que no es empaquetable en la cápsida del fago transductor. El plásmido lleva un transposón. Lisis Estirpe receptora: no lleva plásmido. Seleccionar transductantes que hayan incorporado el marcador dominante del transposón. Derivados sofisticados de transposones bacterianos: transposones defectivos IS10L tcR IS10R Tn10 tcR mini-Tn10 Fusión de genes AUG AUG Fusión de proteínas MudJ Km-r lacZY promotor Lac+ promotor Lacpromotor Lac- Tn5 Kmr recA1 50% ligamiento por cotransducción Transducir seleccionando Kmr Lisado 1 de cada 2 transductantes llevará el alelo recA1 Tn10 Tcr pyrB 90% ligamiento por cotransducción 1. Mutagenizar un lisado con hidroxilamina 2. Transducir la estirpe silvestre seleccionando Tcr 3. Buscar auxótrofos Pyr- entre los transductantes