Tema 19. Anticuerpos Monoclonales y Policlonales. Producción y

Tema 19. Anticuerpos Monoclonales y Policlonales.
Producción y Purificación. Aplicaciones
Concepto de suero policlonal y monoclonal
Cuando se inocula un antígeno (o penetra un patógeno) se produce una respuesta de
anticuerpos frente a cada uno de los determinantes antigénicos (epitopos) del antígeno.
Todos los anticuerpos se producen de forma simultánea, todos reaccionan con el antígeno,
pero solo con un determinante concreto. Esto es lo que se produce en la respuesta inmune
normal, y a esta mezcla de anticuerpos es a la que se denomina suero Policlonal, porque
procede de varios linfocitos B que se expandieron (tras reconocer al antígeno) produciendo
cada uno un clon celular.
En cambio si la inoculación o inmunización la realizásemos con un antígeno que contuviese
un único epitopo, solo se activaría un clon celular y se produciría un único anticuerpo. A un
suero que tuviese estas características se le denomina suero monoclonal. Esta situación, no
se produce en condiciones normales, pero en determinadas condiciones patológicas
aparecen neoplasias de células B y de los plasmocitos derivados de ellas (Mieloma
múltiple). Como son células productoras de anticuerpos, estos se acumulan en la sangre en
grandes cantidades. Como ocurre en todos los procesos tumorales el origen está en una
célula que se maligniza y se multiplica de forma autónoma e independiente de los sistemas
de regulación del organismo, lo que es lo mismo que decir que todas las células del
mieloma proceden de una misma célula y, por tanto, producen el mismo anticuerpo.
Aunque existen mielomas de cada una de las cinco clases de inmunoglobulinas los más
frecuentes producen los isotipos IgA e IgG.
Producción de anticuerpos
A partir de un suero policlonal se puede obtener un suero especifico para el antígeno
mediante aislamiento y purificación. Si bien los anticuerpos obtenidos, todos ellos
especificos para el antígeno, variaran en su afinidad para el mismo al proceder de distintos
clones. Este seria un suero, por tanto, policlonal. La Técnica básicamente consiste en
efectuar una cromatografía de afinidad en columna. En esta técnica se une el mismo
antígeno que se utilizó para la inoculación a unas bolitas especialmente preparadas para que
lo capturen. Una vez recubiertas por el antígeno se “empaquetan” las bolitas en un tubo fino
(se le llama “columna”) y se hace pasar por el al suero que se desea purificar. Los
anticuerpos específicos para el antígeno retenido sobre las bolitas se unen a el y el resto de
los anticuerpos y proteínas del suero sale por la parte inferior. El paso final es la ruptura de
las uniones entre antígeno y anticuerpos (cosa que se hace añadiendo a la columna una
solución hipertónica u otra con pH ácido, con lo que los anticuerpos específicos se eluyen
(salen) por la parte inferior.
Obtención de anticuerpos monoclonales
En 1975 Kohler y Milstein desarrollaron la técnica de los hibridomas, mediante la que
pueden producirse en el laboratorio anticuerpos monoclonales específicos para un antígeno
(determinante antigénico) concreto. La técnica se desarrolló inicialmente utilizando células
de ratón, pero en la actualidad se producen hibridomas a partir de células de varias
especies, incluyendo la humana.
Fusión.
La técnica consiste básicamente en fusionar células linfoides (productoras de anticuerpos)
con células de mieloma (tumorales) en presencia de poli-etilen-glicol (PEG), que provoca
la fusión de las membranas y la formación de híbridos celulares. Las células productoras
del anticuerpo se obtienen a partir de los órganos linfoides periféricos (bazo y/o ganglios
linfáticos) de animales hiper-inmunizados con un antígeno o patógeno concreto. Las células
de mieloma a utilizar deben reunir, al menos, las siguientes características:
•
Ser histocompatibles con las células productoras de anticuerpos
•
No secretar inmunoglobulinas
•
No tener la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT) Los
híbridos resultantes pueden ser de cualquier tipo: Linfocito-Linfocito, Linfocito-Mieloma o
Mieloma-Mieloma. Los que conocemos como Hibridomas son los híbridos LinfocitoMieloma.
Selección
Los hibridomas se recuperan cultivando la mezcla celular anterior en un medio de cultivo
que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina. La aminopterina es un inhibidor del
ácido fólico, sustancia que interviene en la síntesis de los nucleósidos y nucleótidos
necesarios para la replicación del DNA. En este medio (y en cualquiera que se use) los
híbridos LB-LB y los LB no fusionados mueren, ya que tienen una vida media limitada.
Los híbridos M-M y las células de mieloma no fusionadas mueren por carecer de la enzima
HGPRT. La células que sobreviven son los hibridomas LB-M, que heredan la capacidad de
vivir indefinidamente y la alta capacidad biosintética propias de la célula tumoral y la
capacidad de producir anticuerpos y sintetizar guanina vía HGPRT de los linfocitos B.
HGPRT participa en la llamada “vía de salvamento”, mediante la cual una célula puede
usar la hipoxantina como precursor de otras bases nitrogenadas aun en presencia de
aminopterina
.
Como en la fusión se usan células linfoides procedentes de un animal hiper-inmunizado,
una parte de los hibridomas obtenidos son productores de anticuerpos y cada hibridoma
produce un solo anticuerpo (monoclonal). Tras la selección en medio HAT las células
supervivientes se reparten en los pocillos de placas de cultivo (rico en nutrientes e idóneo
para la proliferación celular) y se incuban para que se produzca su crecimiento. En aquellos
pocillos que presentan un crecimiento adecuado se recogen muestras del sobrenadante y se
analizan en ELISA para ver si contienen anticuerpos específicos para el antígeno inicial
(con el que se hiper-inmunizó inicialmente al animal utilizado). La células de los pocillos
positivos se recuperan y, mediante un proceso de dilución límite o clonación, se reaparten
en los pocillos de nuevas placas a 1 célula por pocillo. Los pocillos que producen buenos
clones se muestrean en busca de los anticuerpos y, los positivos, se vuelven a cionar.
Mantenimiento
Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden en recipientes de cultivo de mayor
capacidad y se recogen las células por centrifugación, se suspenden en medio de cultivo
suplementado con suero fetal de ternera y dimetil-sulfóxido (DMSO) para congelarlas,
primero a -70ºC y luego en nitrógeno líquido.
La producción del anticuerpo monoclonal se hace a partir del sobrenadante de cultivos en
masa o tras la inoculación intraperitoneal del hibridoma en animales histocompatibles. En
este último caso se produce un tumor que produce anticuerpos en esa localización
acompañado de ascitis (acumulación de líquido en el peritoneo) y en el liquido ascítico (que
se recupera por punción) hay una gran concentración de anticuerpos. En ambos casos los
anticuerpos monoclonales se separan y purifican por los métodos convencionales.
Aunque son susceptibles de mutar, los hibridomas mantienen sus características durante
muchas generaciones.
Aplicaciones.
Estos anticuerpos monoclonales (mAb) han permitido identificar y purificar gran número
de marcadores celulares tales como los CD, receptores de citoquinas, etc. También se usan
en investigación como herramientas para identificar y aislar moléculas, en las pruebas
inmunológicas de diagnóstico en el laboratorio clínico, como vehículos para el transporte
de drogas y radio-isótopos, etc. Pero quizás su aplicación mas prometedora es en el campo
de la terapeútica. Así ya se han desarrollado algunos contra enfermedades como el cancer
de colon, de mama, contra el linfoma no Hodgkin y otras leucemias y enfermedades como
artritis, enfermedad de Crohn, asma..etc
En este último apartado, Cuando se comenzaron a dar los primeros pasos en este
campo cundió un optimismo ilimitado, ya que se pensaba que podrían utilizarse, por
ejemplo para el cancer a modo de misiles teledirigidos, portadores de tóxicos o isótopos
radiactivos que podrían orientarse contra las células tumorales y depositar su carga letal,
eliminando las células cancerosas y dejando intactas las normales. Así hay en el mercado
una decena de anticuerpos monoclonales. Cubren desde la prevención del rechazo de un
órgano trasplantado hasta la oncoterapia. Pero la realidad mostro que las cosas son más
difíciles. Los anticuerpos monoclonales son proteínas del sistema inmunitario muy puras
que atacan dianas moleculares específicas. Para su infortunio, los individuos que recibieron
la primera hornada de anticuerpos monoclonales con fines terapéuticos tendían a desarrollar
sus propios anticuerpos contra los anticuerpos inyectados. Eso hizo que, por causas que no
acabamos de conocer, progresaran aún más en su patología. El hígado secuestraba tales
anticuerpos monoclonales y los eliminaba antes de que pudieran alcanzar sus objetivos.
Este fracaso hizo pasar del optimismo al desanimo a las empresas y laboratorios que
apostaron por este método. Esto era debido fundamentalmente a que tales anticuerpos eran
de origen murino y eran reconocidos como extraños por el sistema inmunitario humano,
produciendose, por tanto la respuesta frente a ellos.
No obstante mas adelante se descubrieron vías para corregir las deficiencias de los primeros
fármacos surgiendo los anticuerpos quiméricos y humanizados.
Anticuerpos quiméricos
Estos Ac son moléculas artificiales en la cual, las porciones constantes de las cadenas
pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables VE y VE son
obtenidas de un AcMo murino. El objetivo perseguido con la construcción de un AcQ es
reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratón o rata, pero sin afectar la
especificidad del Ac. Estos anticuerpos presentaban un 70% de componente humano y un
30% era de origen murino, por lo que a pesar de ser menos inmunogénicos que los
denominados anticuerpos monoclonales de primera generación seguían presentando
problemas de inmunogeneicidad.
Por ello se recurrio a los denominados:
Anticuerpos humanizados
Estos solo tienen de ratón los genes que entran en contacto con el antígeno. El 90 por ciento
del anticuerpo es así de origen humano, por lo que al ser inyectado en los pacientes no se
produce respuesta del S.I. En teoría solo llevan del ratón el paratopo de unión al antígeno.
El argumento que la soporta se basa en el supuesto de que el sitio de combinación al
antígeno, el paratopo, se forma a partir de la combinación espacial de las asas
hipervariables y que el resto de la región variable (regían denominada M) sólo funcionan
como un andamio cuya única función es servir de soporte estructural al paratopo. De esta
manera en estos los epitopos asociados a las regiones M múridas, los cuales están presentes
en los AcQ no se encuentran en los AcH.
Para producir un AcH es necesario, por tanto conocer la secuencia entera de los dominios V
múridos y la localización de las secuencias de ADN correspondientes a las 3 RDC
Hay dos aspectos que pudieran considerarse desventajosos en la producción de un AcH. En
primer lugar, la manipulación de las RDC y su posterior inserción en el contexto de
regiones M humanas, por lo general, conlleva a una disminución de la afinidad del Ac. Ello
se debe a que las regiones M no son sólo andamios; ellas juegan un rol determinante en el
arreglo tridimensional de las RDC
El otro aspecto tiene que ver con la complejidad de la técnica. Mientras que producir un
AcQ es un procedimiento relativamente expedito, la creación de un AcH es,
comparativamente, más laborioso, consume un tiempo considerable. En todo caso, el
objetivo fundamental perseguido por la producción de un AcH (eliminar la
inmunogenicidad del Ac múrido) no siempre es alcanzado. Se ha reportado cierta
inmunogenicidad "residual" en moléculas de Ac completamente humanizadas, ello debido,
aparentemente, a epitopos asociados con el idiotipo del Ac
Anticuerpos bifuncionales.
Ahora es posible construir anticuerpos con sitios de combinación diferentes que pueden,
por tanto, reconocer simultáneamente a dos antígenos. Son producidos artificialmente al
cruzar dos anticuerpos, uno dirigido contra el antígeno de superficie de la célula tumoral y
el otro contra una molécula estimuladora de la célula efectora (complejo célula T
receptora).
Fármacos desarrollados
Al mercado han llegado ya una decena de anticuerpos monoclonales. Tres más esperan una
pronta aprobación por la norteamericana Oficina de Alimentación y Farmacia (FDA). Dos
estarán equipados para llevar una dosis de radiactividad. Hay un centenar largo en fase de
ensayo en humanos, superadas con éxito las pruebas en animales. Siendo en la actualidad
un campo en expansión. En este sentido la empresa Genentech esta desarrollando, hasta
ahora con éxito, aunque aún no esta en el mercado unos anticuerpos monoclonales contra el
asma (Xolair). Estos eliminan los anticuerpos que desempeñan una función clave en el
asma y las alergias.
Así las cosas, y tomados en su conjunto, los nuevos tipos de anticuerpos monoclonales
ofrecen óptimas perspectivas ante una serie de enfermedades
Elección entre anticuerpos monoclonales y policlonales
Paradójicamente, los anticuerpos policlonales a veces proporcionan mayor especificidad
que los monoclonales frente al mismo antígeno. Ésto es porque las reacciones cruzadas no
deseadas se pueden eliminar de un suero policlonal mediante absorción con el antígeno
causante de la interferencia, mientras que las reacciones cruzadas no buscadas no se pueden
eliminar de un anticuerpo monoclonal porque tiene una única especificidad. La
especificidad de los anticuerpos policlonales se pueden mejorar también mediante
cromatografía de afinidad utilizando antígenos purificados.
Fragmentos de anticuerpos
A veces se desea evitar las funciones efectoras de los anticuerpos mediadas por Fc,
tales como uniones a receptores Fc cuando se pretende detectar antígenos de superficie.
Esto se puede evitar digiriendo el anticuerpo con enzimas proteolíticas. El tratamiento con
pepsina produce fragmentos F(ab')2 que se pueden separar de los Fc y del anticuerpo no
digerido usando cromatografía con proteína A- o proteína G-Sepharose. Alternativamente,
la digestión con papaína genera fragmentos Fab monovalentes.
Equilibrio antígeno-anticuerpo
Aunque la unión del anticuerpo al antígeno se puede detectar en segundos, el
equilibrio normalmente no se alcanza hasta que no pasan varias horas de la adición del
anticuerpo al antígeno. Para muchos ensayos, las incubaciones de 1-2 horas producen la
máxima unión. El rendimiento se ve afectado por la temperatura y por eso se pueden hacer
incubaciones más cortas a 37ºC mientras que las incubaciones largas (por ejemplo toda la
noche) se harán a 4ºC. El término temperatura ambiente que se emplea en muchas técnicas
se refiere a una temperatura de aproximadamente 20ºC.
Titulación de anticuerpos
El título de un anticuerpo se refiere a la mínima concentración (mayor dilución) de
anticuerpo que resulta todavía eficaz en un ensayo, por ejemplo la aglutinación. Los
anticuerpos deben titularse antes de utilizarlos en un inmunoensayo porque usar una
concentración muy grande es un desperdicio, puede dar señales inespecíficas y puede ser
poco sensible en ensayos de inhibición. Por otro lado, una concentración demasiado baja
obviamente produce una pérdida de sensibilidad.
Si se dispone de más de un anticuerpo monoclonal frente a un antígeno de interés, es
conveniente determinar si todos reconocen el mismo o diferentes epitopos del antígeno.