Manejo de muestras sanguíneas

TEMA7
MANEJO DE MUESTRAS SANGUINEAS:
Segun la prueba a realizar extraera un mayor o menor volumen de sangre en un tipo u otro de recipiente, entre
ellos cabe destacar:
• Porta objetos de cristal bien desengrasado: Suelen utilizarse para recogida de sangre capilar.
• Toma de sangre sobre capilares de vidrio, hay de dos tipos:
♦ Heparinizados: para la determinación del hematocrito y gasometria en neonatos. (color rojo)
♦ No heparinizados: Para la dterminación del tiempo de coagulación (azul)
• Toma sobre recipientes de plastico esteriles: Con anticoagulante incorporado en sus paredes, se
recogen en ellos muestras para determinaciones como recuentos, formula leucocitaria, VSG,
hemoglobina, etc.
• Toma sobre recipientes de vidrio esteriles, con o sin anticoagulante incorporado. Suelen utilizarse
para las pruebas anteriores, además de las pruebas de coagulación que los requieran.
ANTICOAGULANTES:
Cuando se requiere sangre total o plasma, se utilizan anticoagulantes químicos que permiten el estudio de sus
componentes, ya que evita la coagulación sanguínea que haria imposible la manipulación técnica de la
muestra.
TIPOS DE ANTICOAGULANTES MÁS UTILIZADOS EN ANALISIS CLINICOS:
• Oxalato
• Citrato
• Fluoruro
• Edta
• Heparina: Es el anti coagulante presente en bajas concentraciones en la sangre humana normal.
• Forma de utilización: Se encuentra en el comercio en forma de sa sódica, potásica o de litio. También se
puede utilizar en forma de sal de amonio.
• Mecanismos de acción: Inhibe la acción de protrombina a trombina, la transformación de fribrinogeno en
fibrina por acción de la trombina y es un factoe estabilizador plaquetario( evita su aglutinación).
• Concentraciones o dosis: lo más conveniente es utilizar 75 U de heparina por ml de sangre (
aproximadamente 0.75 mg/ml)
d) Preparación:
1º Se disuelven 300mg de heparinato de amonio en 20 ml de agua destilada.
2º En cada tubo se introduce el equivalente a 50 ul de solución por ml de sangre.
3º Se deseca a Tª de 90−100º C, cuando más alta es la temperatura de secado menor es la solubilidad del
producto remanente.
• Precauciones, ventajas e inconvenientes:
• Su precio es relativamente alto.
1
• A razon de 0,1−0,2 mg/ml de sangre no afecta al volumen corpuscular.
• Es el mejor anticoagulante para prevenir la hemolisis y para las pruebas de fragilidad osmótica.
• No resulta satisfactorio su uso para el recuento de leucocitos o para la preparación de extensiones de
sangre, pues en este segundo caso produce un fondo azul en las preparaciones teñidas con colorante
de Wright.
• Aplicaciones:
• Hematocrito
• Pruebas de fragilidad osmótica.
ERRORES DE MANIPULACIÓN DE MUESTRAS CON ANTICOAGULANTE:
Al utilizar cualquier anticoagulante hay que tener en cuenta:
♦ Las extensiones de sangre deben prepararse inmediatamente.
♦ Si en el plazo de 2−3 horas no van a llevarse a cabo otras determinaciones, la sangre debe
refrigerarse a 4º C.
♦ Si la sangre se mantiene a Tª ambiente, es probable que entre 6− 24 horas se hinchen los
eritrocitos elevándose el hematocrito y el VCM, disminuyendo la CHCM y la VSG.
♦ Durante 24 horas no se modifican: recuentos, hemoglobina, hematocrito y los indices
eritrocitarios, si la sangre se ha mantenido incoagulada en EDTA y se ha almacenado a 4º C
♦ Homogenizar bien la sangre con anticoagulante.
MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS:
CONSERVACIÓN: En algunas ocasiones es necesario conservar las muestras durante un tiempo prolongado
antes de su análisis para ello es importante que el TEL conozca:
Factores que influyen en la conservación de de una muestra:
• Temperatura: como norma general para la conservación de muestras en el laboratorio, se emplean las
siguientes temperaturas:
♦ Temperatura ambiente (18−30º C)
♦ Temperatura de nevera (4ºC)
♦ Temperatura de congelación (−5º C)
Generalmente cuando más baja es la temperatura, mayor es la estabilidad ( se inhiben los procesos
encimáticos que alteran la muestra, asi como el posible crecimiento microbiano)
• pH: Ciertos componentes de la sangre son mucho más estables cuando aumenta o disminuye el pH.
• Preservativos químicos: existen dos grupos.
♦ Los que evitan transformaciones bioquímicas de la muestra ente ellos está el Fna.
♦ Los que intentan evitar la proliferación microbiana, entre ello está el timol, antibióticos, etc.
Conservación de la sangre entera:
• La sangre entera puede ser conservada para un análisis hasta 4 horas sin tratamiento alguno. Tanto a
20º C como a 4º C
• Como norma general siempre que se pueda realizar cualquier análisis de sangre antes de las 4 horas
de su recogida.
• No debe conservarse largos periodos ni siquiera a 4º C.
2
• Se desaconseja totalmente pretender conservarla a temperatura ambiente.
• No existe ninguna sustancia química que añadida a la sangre entera, impida la producción de
modificaciones de importancia diagnóstica significatica.
• No debe ser congelada.
Conservación de plasma y suero:
• A temperatura ambiente no cabe esperar modificación alguna de los metabolitos y enzimas durante las
primeras 6 horas.
• A 4ºC y en recipiente cerrado, plasma y suero pueden ser conservados hasta 24 horas sin que
presenten modificaciones.
• Si deben conservarse por más tiempo es necesario congelarlos o liofilizarlos.
TRANSPORTE DE MUESTRAS SANGUINEAS:
Se tendrá en cuenta los siguientes puntos:
• hay que evitar confusiones, tener perfectamente rotulados los tubos antes, durante y después del
transporte.
• Asegurarse que los tubos estan perfectamente cerrados antes de transportarlos.
• Transportarlos cuidadosamente, pues, movimientos bruscos, vibratorios, etc. Podrían provocar
hemólisis.
• No transportarlos en recipientes que tengan altas o bajas temperaturas o que contengan algun foco
próximo, frio o caliente.
OBTENCIÓN DE DISTINTOS TIPOS DE MUESTRAS:
Sangre entera: Mezclaremos la sangre extraida con anticoagulante. Tras homogenizar suave y perfectamente
tendremos la sangre entera preparada para su estudio.
Suero: Se obtiene por coagulación de la sangre. Se produe a mayor velocidad si el proceso se realiza a 37º C.
Para ello colocaremos el tubo conteniendo la sangre sin anticoagulante, en un baño termostatado.
La cantidad de suero obtenida por coagulación espontanea, es a menudo insuficiente ; por tanto después de la
coagulación se suele centrifugar durante 5− 10 min. Tras la separación de coagulo y suero, guardaremos este
perfectamente etiquetado y refrigerado (4−5º C), si se va a tardar más de 4 horas en utilizarlo lo
congelaremos.
Sangre desfibrinada:
Es aquella desprovista de los factores de la coagulación, para su obtención se coloca en un matraz erlenmeyer
el mismo número de perlas de vidrio que ml de sangre se vaya a desfibrinar. A continuación se imprime al
matraz un movimiento de rotación sobre su base. Alk cabo de 2−3 minutos se puede observar que el ruido que
las perlas hacian al chocar contra las paredes del matraz, deja de oirse, eso se debe a que la fibrina que se va
formando en el proceso de la coagulación, se deposita sobre ellas, atrapándolas. A partir de ese momento se
prosigue el movimiento rotatorio durante 10 minutos. A partir de sangre desfibrinada , se puede obtener suero
por centrifugación.
Plasma: Para su obtención centrifugaremos la sangre entera anticoagulada 3−4 minutoa a 2000−3000 r.p.m.
El sobrenadante obtenido es el plasma que al igual que el suero debe estar transparente, limpio y no contener
restos de hemólisis, a diferencia del suero contiene factores de la coagulación.
3
Si queremos plasma libre de plaquetas es necesarios una centrifugación a más velocidad y más tiempo que la
anterior. Al igual que el suero tras la centrifugación, separaremos el plasma de los elementos formes
sanguíneos para evitar efectos metabólicos. En caso de no utilizarlos inmediatamente, lo conservaremos como
el suero.
Suspensiones de hematíes: En primer lugar procederemos al lavado de hematíes, para ello mezclaremos la
sangre anticoagulada con suero fisiológico en un tubo de hemólisis en proporción 1/5 centrifugaremos 3−4
minutos a 3000rpm, tras lo cual separaremos el sobrenadante con la ayuda de una pipeta pasteur.
Seguidamente añadiremos al tubo de centrifuga suero fisiológico, homogenizamos y repetimos el proceso
anterior. El lavado finaliza cuando el sobrenadante aparece limpio y transparente.
A partir de estos hematíes lavados, prepararemos las suspensiones mezclando un determinado volumen de
ellos en suero fisiológico o tampón fosfato.
Muestras desproteinizadas: Generalmente se desproteiniza suero o plasma.
Se puede realizar con los siguientes métodos.
Métodos físicos: Entre ellos;
• Absorción de las proteinas a una sustancia añadida.
• Ultrafiltración
• Microdifusión
• Desnaturalización por calor de proteinas.
Métodos químicos: constan de dos fases:
• Precipitación química
• Centrifugación o filtración.
PROBLEMAS TÉCNICOS MÁS FRECUENTES:
LIMPIEZA TOTAL DE LOS RECIPIENTES DE RECOGIDA:
Todo el material de laboratorio debe estar química y bacteriológicamente limpio.
TRANSVASE DE MUESTRAS: Para vaciar la jeringa utilizada en la extracción, hay que quitar la aguja, tras
lo cual presionaremos pausadamente el embolo dejando resbalar la sangre lentamente por las paredes del
recipiente donde la depositamos. Estas operaciones son imprescindibles para evitar la hemólisis. Para
transvasar la sangre de un recipiente a otro podemos utilizar pipetas manuales o automáticas.
HOMOGENIZACIÓN PERFECTA DE LA MUESTRA:
Se de be homogenizar perfectamente siempre que se mezcle con anticoagulante, para ello no se debe agitar ni
someterla a movimientos bruscos ni energéticos. La homogenización la debemos realizar:
• manualmente: Invirtirndo suavemente el tubo 6 u 8 veces.
• Automáticamente: Son homogenizadores o agitadores automáticos.
HEMOLISIS COMO FUENTE DE ERROR:
La hemolisis suele ser reconocida a simple vista en plasma y suero, ya que aparecen enrojecidos. Las causas
4
de su producción son múltiples: hemólisis intravascular , aspiración demasiado energética, agitación, vaciado
rápido de la jeringa, contaminación, centrifugación energética, etc.
Los principales errores e inconvenientes que nos pueden acarrear una muestra parcial o totalmente hemolizada
son:
• Obtención de recuentos anormales bajos.
• Dificultad en la visualización de los frostis.
• Alteraciones de la VSG.
• Disminución del hematocrito.
• Alteraciones de las pruebas de coagulación
• En general en casi todas las determinaciones.
MUESTRAS LIPEMICAS:
Son sueros y plasmas de aspectos lechoso o latescente, debido a la gran cantidad de lípidos que poseen.
MUESTRAS ICTERICAS:Son sueros y plasmas con color amarillo intenso.
CAMBIOS O ALTERACIONES SANGUINEAS:
En la concentración: ocurren por dilución o evaporación para evitarlos tomaremos las siguientes
precauciones:
• Utilizar jeringas, agujas y pipetas perfectamente secas.
• Emplear anticoagulantes secos.
• No dejar la sangre en recipientes destapados durante mucho tiempo.
• Tapar los tubos al centrifugar las muestras.
En la composición de solutos sólidos:
Se deben generalmentea la acción de microorganismos y enzimas la cual se minimiza:
• manejando la sangre, cuando sea posible de forma esteril.
• Separando lo antes posible el plasma o suero de las celulas.
• Refrigerar o congelar la muestra cuando se demore la determinación.
En la composición de productos gaseosos:
Para evitar la pérdida o incorporación de gases a la muestra sobre todo CO2 y O2, tomaremos las siguientes
precauciones.
• Llenar los envases que contienen las muestras casi hasta el máximo de su capacidad y cerrarlos con
cierre hermético.
• Evitar en lo posible los trasvases.
• No manipular la muestra con movimientos rápidos.
• En general se recomienda el trasvase de la muestra al aparato de determinación de gases sanguíneos,
directamente a la jeringa con que hemos efectuado la extracción.
•
TEMA 8
HEMOGRAMA
5
FUNCIONES DE LA SANGRE: podemos dividir las funciones de la sangre en tres grandes grupos:
• transporte a todo el organismo de las sustancias nutritivas y oxígeno a los tejidos asi como el
anhídrido carbónico y catabolitos a los órganos de eliminación.
• Transporte de mensajes en forma de sustancias químicas que actuan sobre diversos tejidos regulando
su función.
• Participación en los procesos homeóstaticos y de defensa del organismo.
COMPOSICIÓN DE LA SANGRE: La sangre es una suspensión de células en un líquido complejo,
denominado plasma.
Las celulas sanguíneas suponen aproximadamente el 40% del volumen total siendo de tres tipos; leucocitos,
hematíes y plaquetas.
El plasma que supone el resto de la sangre está formado en un 90% por agua en la que se encuentran disueltas
diversas sustancias.
CALCULO DE SUSTANCIAS ERITROCITARIAS:
Volumen corpuscular medio:
Hematrocito en %
VCM=−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− x10
Nº de hematíes/mm3 expresado en millones.
Ejemplo: Una muestra con un hematocrito de 44% y un recuento de hematíes de 6,5 millones/mm3
44
VCM=−−−−−−− x 10 = 67,7 um3
6,5
Interpretación de resultados:
85+−10 um3 .................................Normocitosis
menor a 75..................................Microcitosis
Mayor a 95.................................. Macrocitosis
HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIA:
Hemoglobina expresada en g/100ml
HCM= ...........................................................................x 10
Nº de hematíes/mm3 expresado en millones
Ejemplo: Una muestra con una hemoglobina de 150g/l y un recuento de hematíes de 8 millones/mm3.
6
150g/l : 10.............15g/100ml
15
HCM=.........................x10= 19pg
8
Interpretación de resultados:
29,5+−2,5pg...........Normocromía
mayor a 32pg ........hipercromia
menor a 27pg.........hipocromia
CONCENTRACIONES DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR:
Hemoglobina expresada en g/100ml
CHCM=−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−x100
Hematocrito en %
Ejemplo: Una muestra con un hematocrito del 41% y una hemoglobina de 23g/100ml
23
CHCM=−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−x100=56%
41
Interpretación de resultados:
32,5+−2,5%.....................Normocrómico
Mayor a 35%..................Hipercrómico
Menor a 30%..................Hipocrómico.
TEMA 9
HEMATOCRITO:
Es el volumen ocupado por los hematíes respecto al volumen de sangre total.
Se puede determinar de 2 formas:
Métodos directos:
• Microhematocrito
• Macrohematocrito
7
Método indirecto.
METODOS DIRECTOS:
Se basa en la centrifugación de la sangre con el fin de empacar los hematíes, posteriormente se mide el
espacio que estos ocupan y se expresa como porcentaje del espacio ocupado por la sangre total.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:
Los resultados normales son los siguientes:
Adultos
• Hombres−−−−−−−−45+−5%
• Mujeres−−−−−−−−−−42+−5%
Niños
• 3 meses−−−−−−−−−−−−38+− 6%
• 3 a 6 años−−−−−−−−−−40+−4%
• 10−12 años−−−−−−−−−−41+−4%
Recien nacido−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−54+−10%
Casos frecuentes en que disminuye el valor son: anemia, hemorragia y microcitosis, mientras que aumenta en
caso de policetemia vera, macrocitosis y deshidratación.
OBSERVACIÓN AL MÉTODO:
• El anticoagulante utilizado debe ser seco con el fin de no diluir la sangre
• Si añadimos como anticoagulante oxalato ámonico−potásico, en exceso la lectura será anormalmente
baja, debido a la contracción de los hematíes por aumento de la presión osmótica externa.
• Otro error se puede producir por variación del diámetro a lo largo de del tubo, estos deben estar
perfectamente calibrados.
MÉTODO INDIRECTO:
Recuento de hematíes x VCM= hematocrito.
TEMA 10
VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)
La velocidad de sedimentación globular es la distancia que descienden los elementos formes de la sangre en
una unidad de tiempo, cuando situamos a esta en una columna.
La VSG se calcula a la hora y a las 2 horas, expresándose como los milímetros que las celulas han descendido
en ese periodo de tiempo. La determinación de la VSG a la segunda hora , muy utilizada anteriormente ha
resultado ser poco fiable.
En el método de Westergreen la sangre se diluye un 20% con citrato sódico al 3,8%.
8
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:
Los valores normales de VSG oscilan entre 1−8mm/h, aunque varian con la edad y el sexo.
Además de la VSG a la 1ª y 2ª hora los resultados se ofrecen como indices de katz, entendiendo por tal:
A+(B/2) A=mm de sedimentación en 1ªh
Indice de Katz=−−−−−−−−−−−−−−−−− B=mm de sedimentación en2ªh
2
La VSG aumenta en los siguientes casos:
• Durante el embarazo.
• Con la edad
• En las anemias
• En las disproteinemias
• Enfermedades reumáticas
• Tuberculosis
• Infecciones crónicas o agudas
• Neoplasias
• Otras enfermedades degenerativas.
Mientras que disminuye en los siguientes casos:
• Policitemia vera
• Alteraciones congénicas eritrocitarias
• Hipofibrinogenémia
• Insuficiencia cardiaca congestiva.
OBSERVACIONES DEL MÉTODO:
• es una prueba inespecífica, imprecisa, que es necesario interpretar con prudencia.
• Los resultados no son fiables.
Causas de error:
• Si la dilución con el anticoagulante es demasiado elevada, la VSG estará disminuida.
• Un aumento o disminución muy acusado de la temperatura ambiente dará valores aumentados o
disminuidos respectivamente.
• La vibración de los tubos aumenta los resultados.
• La presencia de coagulos de fibrina o burbujas en la sangre invalida los resultados de la prueba.
• Si se deja la sangre en la pipeta más o menos tiempo del indicado.
• El defecto de calibración de la pipeta y la no verticalidad de esta.
PREPARACIÓN DE EXTENSIONES SANGUINEAS Y TINCIONES:
Las preparaciones sanguíneas teñidas las utilizaremos fundamentalmente para:
• Formula leucocitaria
• Estudio morfológico de leucocitos.
9
• Estudio morfológico de hematíes
• Estudio morfológico de plaquetas
• Estudio de la disposición de hematíes y plaquetas
• Recuentos de reticulocitos.
TINCIONES
Giemsa: Metanol 4−5 min.
Giemsa 2−3 min.
Wright: Se pone el tinte contando las gotas hasta cubrir el porta y se deja 1min
Se pone las mismas gotas de agua destilada y se deja 3−4 min.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:
• Los eritrocitos de rosa naranja a rosado.
• Los granulos de los neutrofilos se tiñen de rosa a lila; de los eosinófilos , anaranjado a rosado y de los
basófilos, azul oscuro a violeta.
• El citoplasma de los neutrofilos se colorea de rosa pálido; de los linfocitos azul claro y de los
monocitos azul grisáceo claro,
• Los núcleos de los neutrofilos y linfocitos se tiñen de violeta azulado oscuro y de los monocitos
purpura azulado claro.
Las plaquetas contienen un granulo central púrpura rojizo, rodeado de una aureola azul claro.
10