5. biosintesis del dna - OCW Usal
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5. BIOSINTESIS DEL DNA Verónica González Núñez Universidad de Salamanca ESQUEMA. Biosíntesis del DNA 1. Introducción - Hitos en la investigación en el DNA - Importancia en la investigación en DNA - El DNA: estructura y funciones 2. El DNA superenrollado y topoisomerasas - El DNA superenrollado (supercoiled) - Topoisomerasas: topoisomerasas tipo I y tipo II ó DNA girasas 3. La horquilla de replicación - Las estructuras θ - La DNA girasa - Modelo de replicación semidiscontinua HISTORIA. Hitos en la investigación en el DNA (I) http://www.dnai.org/timeline/index.html 1869. Miescher: Aislamiento de los ácidos nucleicos Sustancia de carácter débilmente ácido presente en leucocitos y de función desconocida. Se llamó ácido desoxirribonucleico o DNA 1886. Mendel: Leyes de la herencia 2 factores determinan un carácter & cada uno de ellos es heredado de un progenitor 1912. Bragg: Difracción de rayos X La estructura atómica de un cristal puede deducirse a partir del patrón de difracción de rayos X Fue una técnica clave para determinar la estructura del DNA 1924. Estudios de microscopía indican que tanto el DNA como las proteínas se encuentran presentes en los cromosomas HISTORIA. Hitos en la investigación en el DNA (II) 1928. Griffith: Transformación La información genética puede transmitirse desde una bacteria muerta por calor a otra viva. El material genético es una molécula termoestable 1930. Beadle & Tatum: relación entre genes y proteínas Hipótesis de “un gen – una proteína” 1944. Avery, McLeod & McCarty: El agente transformador de las bacterias de Griffith es el DNA El DNA, y no las proteínas, es la molécula de la herencia Gran escepticismo en la comunidad científica debido a la que el DNA presenta un estructura “demasiado simple” Historia. Hitos en la investigación en el DNA (III) 1949. Chargaff: Leyes de Chargaff La composición del DNA es específica para cada especie, pero varía de una especie a otra Siempre se cumple que la cantidad de A = T & G = C 1952. Franklin & Wilkins: Imágenes de difracción de rayos X del DNA Claves para elucidar la estructura del DNA 1953. Watson & Crick: Estructura del DNA Basada en las leyes de Chargaff y en la fotografía 51 de Franklin La estructura del DNA implica también un posible modelo de replicación 1957. Crick: Dogma central de la Biología Molecular DNA Æ RNA Æ Proteína Historia. Hitos en la investigación en el DNA (IV) 1958. Meselson & Stahl: Modelo semiconservativo de la replicación del DNA 1961. Jacob & Monod: RNA Es la molécula intermediaria en la síntesis de proteínas Hall & Spiegelman: Hibridación de DNA & RNA Crick & Brenner. El código genético El código genético está formado por tripletes no solapantes Yanofky: Los genes son colineales con los polipéptidos que codifican 1962. Crick, Watson & Wilkins: Premio Nobel Concedido por determinar la estructura del DNA 1961-65. Descifrado del código genético. Papel de Ochoa 1968. Okazaki: Fragmentos de Okazaki Modelo para la síntesis de la hebra rezagada Historia. Hitos en la investigación en el DNA (V) 1970. Hamilton Smith: Aislamiento de la primera enzima de restricción Temin and Baltimore: Descubrimiento de la retrotranscriptasa Replanteamiento del dogma central de la Biología Molecular 1972. Cohen & Boyer: Tecnología del DNA recombinante 1975. Kronberg: Estructura de la cromatina 1975-1977. Método de Sanger Perfeccionamiento de las técnicas de secuenciación del DNA 1978. Clonación del primer gen humano (insulina) 1980s. Empleo de insulina humana recombinante para el tratamiento de la diabetes Prusiner: Acuña el término de prion Mullis. PCR Historia. Hitos en la investigación en el DNA (VI) 1990s. Fodor & Brown: DNA chips & Microarrays Venter: 1° secuencia completa de un organismo vivo (H. influenzae) Ingenieria genetica: Era de los organismos transgénicos 2000s. Proyecto Genoma Humano. Controversia Craig Venter & Celera Avance muy rápido del conocimiento y de las técnicas en Biología Molecular Aplicaciones Biomédicas & Biotecnológicas 2010. Venter Generación del primer organismo cuyo DNA es completamente artificial (Mycoplasma mycoides) IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACION EN EL DNA Comprender las bases moleculares de la herencia Determinar la transmisión de caracteres hereditarios Creación de organismos genéticamente modificados (GMOs) que presenten ciertas ventajas: terapia génica, alimentos transgénicos, producción de fármacos, bioingeniería, biorremediación etc Aplicaciones biomédicas: enfermedades hereditarias Nuevos avances y técnicas en investigación La información genética ha de pasar de una generación a otra con la mayor fidelidad posible, tanto en organismos sencillos (ej. bacterias) como en complejos (ej. animales) ESTRUCTURA DEL DNA (I) El DNA es el portador de la información genética Funciones Replicación: transmisión de hereditarios a la descendencia los caracteres Paso de la información genética de una generación a otra sin errores, tanto en organismos sencillos (ej. bacterias) como en complejos (ej. mamíferos) Errores en la replicación: mutaciones y posibilidad de evolución Transcripción DNA Æ RNA Composición química Desoxirribonucleótidos con 4 bases nitrogenadas: A, G, T & C La composición química exacta es específica de cada especie, y difiere de una especie a otra Estructura del DNA (II) Polímero lineal de desoxirribonucleótidos unidos entre sí mediante enlaces fosfodiéster entre los carbonos 3’ y 5’ de la desoxirribosa Doble hélice antiparalela Una cadena es 5’ Æ 3’ y la otra, 3’ Æ 5’ Φ = 20 Ǻ Enrollamiento plectonémico dextrógiro: las dos hebras no pueden separarse sin desenrollar la hélice El esqueleto carbonado y los grupos fosfato se sitúan en la parte externa para evitar las repulsiones electrostáticas Las bases nitrogenadas se sitúan en el interior 10 bases por vuelta de hélice Fuente de la imagen http://en.wikipedia.org/wiki/Category:Biochemistry Creative Commons Attribution-Share Alike license Estructura del DNA (III) Apareamiento de bases por puentes de hidrógeno A = T: 2 puentes de hidrógeno G = C: 3 puentes de hidrógeno Los residuos aromáticos de las bases nitrogenadas son planares Las bases se sitúan paralelamente entre sí, y perpendicularmente al eje de la hélice Interacciones hidrofóbicas entre las bases de la misma cadena ayudan a la estabilización de la hélice Complementariedad de bases Estructura del DNA (IV) La doble hélice del DNA presenta dos tipos de surco: mayor y menor Dichos surcos, junto con alteraciones en la conformación del DNA debido a la secuencia específica de bases nitrogenadas, juegan un papel determinante en el acceso de diversas proteínas al DNA 3 conformaciones posibles para el DNA: A, B & Z Las distintas conformaciones que puede adoptar el DNA dependen de: - la composición en %(G+C) y % (A+T) - el grado de solvatación - la presencia de distintos cationes en el medio La información hereditaria se localiza en la secuencia de bases de cada cadena nucleotídica La propia estructura del DNA aporta un posible mecanismo de replicación LA REPLICACION DEL DNA ES SEMICONSERVATIVA 3 posibles modelos de replicación del DNA - conservativo - semiconservativo - disperso Experimento de Meselson y Stahl Marcaje radiactivo del DNA con N15 y centrifugación en gradiente de densidad de CsCl DNA parental: N15 Cada molécula de DNA “hijo” posee una cadena paterna y otra de nueva síntesis (½ N14 & ½ N15), por lo que presenta una densidad intermedia En la siguiente ronda de replicación, hay cadenas con densidad intermedia y otras con densidad de N14 ÆEl modelo semiconservativo es el correcto Cada una de las cadenas de la doble hélice original actúa como molde para la síntesis de la cadena complementaria DNA SUPERENROLLADO = supercoiled DNA (I) Los DNAs circulares suelen adoptar una conformación superenrollada En estos DNAs, el número de vueltas no puede alterarse sin romper al menos un enlace covalente de una hebra dsDNA DNA circular DNA superenrollado DNA superenrollado = supercoiled DNA (II) La topología de una superhélice puede expresarse como L=T+W L: número de enlace o “linking number” Número de veces que una hebra de DNA se enrolla sobre la otra Permanece inalterado siempre que no se rompan los enlaces covalentes Es una propiedad topológica de la molécula T: número de giro o “twist” Número total de vueltas de una hebra de DNA sobre el eje del dúplex en una determinada conformación W: número de torsión o “writhing number” Número de vueltas que el eje dúplex realiza sobre el eje de la hélice en una determinada conformación DNA superenrollado = supercoiled DNA (III) Superenrollamiento hacia la derecha = negativo Ayuda a abrir la hélice ó a relajarla Superenrollamiento hacia la izquierda = positivo Aumenta la torsión Los superenrollamientos pueden ser trenzados (= interwound) ó toroidales toroidal trenzado = interwound sobre el propio eje dúplex el eje dúplex se enrolla sobre otra estructura cilíndrica Ejemplo: sobre una estructura proteica DNA superenrollado = supercoiled DNA (IV) Existen conformaciones topológicamente equivalentes Topoisómeros Conformaciones del DNA topológicamente equivalentes Por ejemplo: desenrollar una vuelta el DNA ó introducir un superenrollamiento negativo disminuyen el numero de enlace en una unidad: ΔL = -1 Superenrollamiento negativo ΔW = -1; L = n-1 Rotura de un enlace fosfodiéster L=n ΔT = -1; L = n-1 TOPOISOMERASAS Enzimas que eliminan ó introducen superenrollamientos Determinan el grado de superenrollamiento del DNA Æ Alteran el estado topológico, pero no la estructura covalente Acción imprescindible para que la replicación y la transcripción tengan lugar 2 Tipos de topoisomerasas Tipo I Rotura de una sola cadena de DNA No necesitan aporte ε Tipo II ó DNA girasas Roturas en las dos cadenas de DNA Hidrólisis de ATP Topoisomerasas tipo I o “nicking-closing enzymes” (I) Relajan el DNA superenrollado - catalizan la introducción de superenrollamientos negativos - reducen el número “L” en una vuelta ó unidad por ciclo, hasta que el superenrollamiento está completamente relajado - no necesitan de aporte ε Pasos 1. La enzima rompe un enlace covalente en una de las cadenas 2. Unión de la cadena de DNA a la proteína a través de un enlace fosfodiéster con un residuo de Tyr (ataque nucleofílico del –OH de la Tyr a un enlace fosfodiéster y posterior trans-esterificación) y un grupo –OH libre en el DNA Æ se preserva la ε almacenada en el enlace fosfodiéster 2. Paso de una vuelta de la cadena intacta por la rotura 3. La enzima repara el enlace Estructura de las topoisomerasas tipo I Monómeros de 100 Kda Presentes en procariontes y eucariontes Estructura - formada por 4 dominios - forma de “pinza” - una cavidad central que permite acomodar una doble hélice de DNA - la superficie interna de dicha cavidad presenta cargas Q+, lo que permite la estabilización del DNA Camptotecina Inhibidor de la Topo I Impide la religación del DNA Empleado en Quimioterapia Fuente de la imagen: RCSB PDB. N. acceso: 1CY0 Topoisomerasas tipo II o DNA girasas Heterodímero de 375 KDa (subunidad A -105 KDa- & B -95 KDa-) Cataliza superenrollamientos negativos acoplados a la hidrólisis de ATP Æ la DNA girasa convierte la ε del ATP en ε de torsión del superenrollamiento Estructura Los extremos C-terminales presentan gran cantidad de residuos de Arg que actuan como superficie de unión al DNA En procariontes: genera superenrollamientos negativos (9 Kcal/mol) En eucariontes: relaja superenrollamientos positivos (importancia en la replicación) Importancia de la DNA girasa - La replicación del DNA implica la apertura de la doble hélice, por lo que se producen superenrollamientos en otras partes de la molécula - Estos superenrollamientos han de ser eliminados por medio de la DNA girasa con gasto de ATP Topoisomerasas tipo II o DNA girasas (II) Mecanismo de inversión de signo Conversión de un superenrollamiento toroidal hacia la derecha en otro enrollado hacia la izquierda Æ El número de enlace disminuye en dos unidades = se introducen dos vueltas por reacción 1.Se unen dos heterodímeros y 200bp del DNA se enrollan sobre la DNA girasa 2. Unión del ATP y corte en las dos cadenas Se producen roturas en las dos cadenas del DNA 3. Unión covalente a residuos de Tyr de la subunidad A Este anclaje evita la libre rotación de la hélice de DNA 3. Paso del DNA dúplex por la rotura 4. Sellado de la rotura 5. Hidrólisis del ATP y separación de la girasa del DNA Topoisomerasas tipo II o DNA girasas (III) DNA girasas bacterianas Dianas farmacológicas para antibióticos: se inhibe la replicación y la transcripción - Novobiocina se une a la subunidad B de la DNA girasa y evita la unión del ATP a la enzima - Acido oxolínico se une a la subunidad A de la DNA girasa y parece que bloquea el sellado de la rotura - Acido nalidíxico: bloquea el corte y religación de las cadenas de DNA - Ciprofloxacina DNA girasas eucarióticas Dianas farmacológicas en quimioterapia -Doxorubicina Inhibidor de la Topo II Se intercala en el DNA e impide la progresión de la enzima LA HORQUILLA DE REPLICACION Estructuras θ Autorradiografías con [3H]-timina: en la replicación del DNA circular de bacterias aparecen estructuras en forma de ojo ó burbuja Æ Estructuras θ Las dos cadenas del dsDNA paterno se separan y se sintetizan las cadenas complementarias en las dos direcciones Æ Replicación bidireccional Cada burbuja de replicación presenta dos horquillas de replicación Las horquillas de replicación de la burbuja se mueven en sentidos opuestos hasta completar la replicación del cromosoma circular bacteriano (al lado opuesto del origen) La horquilla de replicación (II) Replicación del cromosoma de E. coli - Existe un solo origen de replicación por cromosoma con 2 horquillas (= 1 estructura θ) - Punto donde comienza la replicación: Ori C - Replicación bidireccional - Separación de las dos hebras hijas de dsDNA con la ayuda de una topoisomerasa Superenrollamientos - Replicación del DNA Æ apertura de la doble hélice y formación de superenrollamientos - Eliminación por la DNA girasa con gasto de ATP DNA-POLIMERASAS 3’ El DNA es replicado por DNA polimerasas (DNA-dependientes) 5’ Polimerización de dNTPs (DNA)n + dNTP ÅÆ (DNA)n+1 + PPi (PPi Æ 2Pi) H 3’ 5’ Unión del dNTP al extremo –OH 3’ de la cadena naciente Mecanismo Ataque nucleofílico del 3’ –OH de la cadena cebadora sobre el α-fosfato y formación de un enlace fosfodiéster DNA-polimerasas (II) 3’ Requisitos de la DNA polimerasa Catión divalente: Mg2+ NO puede sintetizar una cadena de DNA de novo 5’ Molde ssDNA : se añaden los nucleótidos con la base complementaria al presente en el molde Cebador: extremo –OH libre en 3’ 5’ H 3’ MODELO DE REPLICACION SEMIDISCONTINUA Problema 1: las dos cadenas del dsDNA son antiparalelas y la replicación sólo transcurre en sentido 5’Æ3’ Solución: dos sistemas distintos de replicación para cada hebra Cadena conductora (leading strand) Síntesis contínua El molde es 3’Æ5’ y la nueva cadena de DNA se sintetiza 5’Æ3’ de forma continua Cadena rezagada (lagging strand) Síntesis por Fragmentos de Okazaki El molde es 5’Æ3’ y la cadena de DNA se sintetiza de manera discontinua en fragmentos de 1000-2000 nucleótidos en dirección 5’Æ3’ (100-200 nt en eucariontes) 3’ Cadena conductora 5’ Síntesis continua Cadenas retrasada 3’ Fragmentos de Okazaki 5’ 5’ 3’ Cadenas parentales Biosíntesis de los cebadores de RNA Problema 2: ¿Cómo se inicia la replicación si las DNA polimerasas necesitan un extremo –OH libre en 3’? Solución: cebador de RNA en 5’ (“primer”) = oligonucleótido (1-60 bases) complementario al DNA al que se van uniendo los dNTPs - En la cadena conductora: sintetizado por la RNA primasa (gen dnaG) RNA polimerasa - En la cadena retrasada con fragmentos de Okazaki: los cebadores son sintetizados por la RNA primasa La RNA polimerasa y la primasa forman parte del primosoma, y actúan de manera sinérgica en la replicación cebador de RNA Degradación de los cebadores de RNA 3’ 5’ Problema 3 Si el DNA no contiene ribonucleótidos, ¿como se eliminan los cebadores de RNA? 1. Síntesis del cebador por la DNA primasa 5’Æ3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3. Eliminación de los cebadores por la DNA polimerasa I (actividad exonucleasa 5’Æ3’) y relleno de los huecos Æ actividad exonucleasa 5’Æ3’ 2. Los huecos en el DNA son rellenados por la DNA polimerasa I 3. Unión de los diversos fragmentos por la DNA ligasa 5’ 2. Síntesis de los fragmentos de Okazaki por la DNA polimerasa III 5’Æ3’ Mecanismo 1.Eliminación de los cebadores de RNA por la DNA polimerasa I 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 4. Ligación de los fragmentos por la DNA ligasa 3’ 5’ 3’ 5’ Mecanismo de acción de las DNA ligasas Catalizan la formación del enlace covalente fosfodiéster entre el grupo 3’ –OH de un extremo y el grupo fosfato 5’ del otro. Siempre en dsDNA Necesidad de aporte ε: Bacterias: NAD+ Æ NMN + Ppi Animales: ATP Æ AMP + PPi ( PPi Æ 2Pi) Mecanismo catalítico de la DNA ligasa eucariótica y del bacteriófago T4 1. Activación de la enzima: E‐Lys‐NH2 + ATP Æ E‐Lys‐AMP + PPi (PPi Æ 2 Pi) 2. Formación del enlace fosfoanhidro E‐Lys‐AMP + P‐5’‐DNA Æ E‐Lys + AMP‐P‐5’‐DNA 3. Transesterificación DNA‐3’‐OH + AMP‐P‐5’‐DNA Æ DNA‐3’‐P‐5’‐DNA + AMP
