Revisión Inmunología Vol. 25 / Núm 2/ Abril-Junio 2006: 115-130 Receptores tipo Toll: entre el reconocimiento de lo no propio infeccioso y las señales endógenas de peligro M. Mesa-Villanueva, P.J. Patiño Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Facultad de Medicina – Corporación Biogénesis, Universidad de Antioquia, Sede de Investigación Universitaria, Medellín, Colombia. TOLL LIKE RECEPTORS: BETWEEN INFECTIOUS NON-SELF RECOGNITION AND THE ENDOGENOUS DANGER SIGNALS Recibido: 25 Mayo 2006 Aceptado: 13 Junio 2006 RESUMEN Los receptores tipo Toll (TLR) se conocen clásicamente por su expresión en las células presentadoras de antígeno (APC) donde participan en el reconocimiento de estructuras moleculares asociadas a los patógenos (PAMP) que no están presentes en las células del hospedero. Sin embargo, como lo demuestran varios estudios recientes, los TLR tienen una distribución tisular mucho más amplia, pueden reconocer moléculas derivadas de los tejidos lesionados del hospedero y desencadenan respuestas no solo inmunes sino también metabólicas y de comportamiento propias de los estados de enfermedad. De acuerdo con estas observaciones es posible considerar a los TLR como receptores de señales de peligro tanto exógenas como endógenas, y por tanto como un puente entre la teoría del reconocimiento de lo no propio infeccioso y la teoría del peligro, lo cual plantea una serie de repercusiones que van más allá de la respuesta inmune. PALABRAS CLAVE: Receptores tipo Toll/ Inmunidad natural/ Células presentadoras de Ag/ Linfocitos/ Fagocitos/ Fibroblastos/ Adipocitos/ Epitelio/ Microglia/ Osteoclastos/ Proteínas de choque térmico/ Ácido hialurónico. ABSTRACT Toll like receptors (TLR) are classically known by their expression in antigen Presenting Cells (APC), where they participate in recognition of pathogen molecular patterns (PAMP), absent in host cells. However, recent studies show a broader tissue spectrum for TLR expression, being able to recognize molecules derived from injured host tissue and triggering immune, metabolic and behavioral responses typically observed in disease stages. Based on the latter observations, it is feasible to consider TLR as receptors for «danger signals» derived from exogenous and endogenous injuries and therefore as a bridge between two immunological theories; the non-infectious self recognition and the danger theory. The latter assumption has implications beyond the immune response. KEY WORDS: Toll-like receptors/ Immunity-natural/ Antigen presenting cells/ Lymphocytes/ Phagocytes/ Fibroblasts/ Adipocytes/ Epithelium/ Microglia/ Osteoclasts/ Heat-shock proteins/ Hyaluronic acid. 115 RECEPTORES TIPO TOLL: ENTRE EL RECONOCIMIENTO DE LO NO PROPIO INFECCIOSO Y LAS SEÑALES ENDÓGENAS DE PELIGRO INTRODUCCIÓN Uno de los enigmas más interesantes en el campo de la inmunología es porqué se genera una respuesta inmune y para responderlo se han planteado varias teorías. El modelo inicial fue propuesto por Frank Macfarlane Burnet a mediados del siglo XX y se conoce como «la discriminación propiono propio». Esta teoría ha prevalecido desde su planteamiento y sostiene que el sistema inmune se activa en presencia de componentes extraños en tanto que no responde, es decir tolera los componentes propios. Según la propuesta de Burnet, la respuesta inmune se iniciaba cuando los linfocitos B (LB) reconocían los antígenos (Ags) no propios mediante su receptor específico, el Receptor de las células B (BCR). En 1969, Bretscher y Cohn propusieron al linfocito T ayudador (LTh) como indispensable en la provisión de una segunda señal (señal 2 de ayuda) que evitaba la muerte de los LB que habían recibido la señal proveniente del Ag (señal 1). En 1974 el modelo fue modificado nuevamente por Lafferty y Cunningham por la inclusión de una nueva célula, la célula presentadora de antígeno (APC) que proveía otra segunda señal que llamaron señal 2 coestimuladora del LTh. Durante muchos años se estudió la señal 2 de ayuda derivada del LTh y se ignoró la señal 2 coestimuladora de la APC porque se desconocía de qué forma la APC podía diferenciar lo propio de lo extraño. Ante la imposibilidad de explicar muchos fenómenos inmunológicos con este modelo, Charles Janeway en 1989, encontró una forma ingeniosa de integrar la coestimulación en el modelo del reconocimiento de lo propio versus lo no propio, cuando planteó la teoría de «la discriminación entre lo no propio infeccioso y lo propio no infeccioso». Janeway acuñó el término «Receptores de reconocimiento de Patrones» (PRR) para referirse a receptores no clonales, codificados en la línea germinal y expresados en las APC para reconocer productos microbianos, ausentes en las células del hospedero, tales como el lipopolisacárido (LPS); es decir estos PRR le permitirían a las APC discriminar entre lo no propio infeccioso y lo propio no infeccioso. Este modelo ubica el inicio de la respuesta inmune en el reconocimiento de los agentes infecciosos no por los linfocitos sino por las APC; de acuerdo con esta propuesta y partiendo de la hipótesis de que normalmente las APC están en reposo y deben «activarse» mediante algún tipo de señal, Janeway sugirió que la unión de los PRR a sus ligandos activaba a las APC, las cuales solo entonces aumentarían la expresión de moléculas coestimuladoras para activar al LT. Sin embargo, aunque la adición de los PRR explicaba la respuesta inmune a las bacterias y otros patógenos evolutivamente distantes, no podía explicar la respuesta inmune a trasplantes y tumores, ni la disfunción observada en las enfermedades autoinmunes(1). 116 VOL. 25 NUM. 2/ 2006 Para resolver este vacío, en 1994, Polly Matzinger propuso la «teoría del peligro» según la cual, las APC son estimuladas no por los PAMP sino por señales de alarma/peligro liberadas por los tejidos lesionados como aquellos expuestos a patógenos, toxinas, daño mecánico y muerte por necrosis; señales que nunca son emitidas por células saludables o que sufren muerte fisiológica. En ese momento se desconocía cuáles podían ser esas señales de peligro; sin embargo, sin importar su naturaleza, lo que proponía esta teoría era que estas señales endógenas liberadas en respuesta al peligro eran las que iniciaban la respuesta inmune. A diferencia del modelo de discriminación propio-extraño que sostiene que lo extraño es esencial para desencadenar una respuesta inmune, la teoría del peligro sugiere que el estado de activación de una APC depende de la salud de su entorno; de esta manera, las células saludables envían «señales de normalidad» a las APC, en tanto que las células estresadas, dañadas, destruidas anormalmente ó muertas por necrosis envían señales de alarma que alertan a las APC. El modelo del peligro planteó dos aspectos novedosos en la inmunología; el primero, que no es la naturaleza extraña del patógeno el rasgo importante que desencadena la respuesta inmune sino las señales que libera la célula lesionada; y el segundo, que el reconocimiento de lo propio no es garantía de tolerancia porque si lo propio está alterado también puede inducir una respuesta(2) (Fig. 1). La teoría de lo no propio infeccioso y la teoría del peligro tienen en común que ubican el inicio de la respuesta inmune en la APC; según sus supuestos, esta célula debe ser activada ya sea por PAMP de los patógenos o por señales de peligro derivadas del tejido lesionado. El modelo de lo no propio infeccioso ha sido respaldado por el descubrimiento de los TLR y de los receptores con dominios de oligomerización para unión a nucleótidos (NOD). Estas moléculas actúan como PRR de PAMP derivados de patógenos como bacterias y hongos en organismos tan distantes en la escala evolutiva como insectos y mamíferos. Por otro lado, la teoría del peligro ha sido respaldada por el hallazgo de señales de alarma endógenas tales como DNA, RNA, proteínas de choque térmico (HSP), interferón alfa (IFN-α), interleucina 1 beta (IL-1β), el ligando de CD40 (CD40L) y los productos del hialuronano que se generan durante la ruptura de los vasos sanguíneos. Aunque no se conocen completamente los receptores de estas señales de peligro, las investigaciones recientes muestran que muchas de ellas son reconocidas por los mismos TLR y NOD. Se podría sugerir entonces que estos receptores reconocen señales exógenas o endógenas de peligro y que hacen parte de un sistema que alerta al organismo para defenderse tanto de las agresiones del medio externo como del interno(3). De acuerdo con esta INMUNOLOGÍA M. MESA-VILLANUEVA, P.J. PATIÑO Figure 1. Teorías sobre el inicio de la respuesta inmune. A. 1959: Modelo de discriminación propio vs no propio. B. 1969: El LB requiere una señal de ayuda del LTh. C.1975: El LTh requiere una señal coestimuladora 2 de la APC. D. 1989: Modelo de discriminación propio vs no propio infeccioso; la APC requiere estimulación vía PRR. E. 1994: Modelo del peligro; la APC requiere estimulación por señales de peligro derivadas del tejido infectado o lesionado (Adaptado de Matzinger,P. Science. 2002. 296:301-305)(3). observación, no es de extrañar que la expresión de los TLR sea más amplia de lo que originalmente se pensó; en efecto, las investigaciones recientes han evidenciado expresión de TLR en muchas células no solo del sistema inmune sino también en los tejidos epitelial, adiposo y muscular entre otros. En cada uno de estos tejidos, los TLR son susceptibles de activación por sus ligandos respectivos y desencadenan respuestas diferentes que en general pueden verse como mecanismos de defensa del hospedero frente al peligro. En esta revisión se presentan algunas evidencias de la expresión y activación de los TLR no solo en células del sistema inmune sino también en tejidos distintos al sistema inmune, de manera que se pueda apreciar en conjunto como estas respuestas individuales hacen parte de un mecanismo mayor cuyo objetivo es proteger al hospedero del daño o la destrucción. Al parecer la alarma es general y se inducen respuestas no solo inmunes sino también metabólicas y de comportamiento que son claves en el manejo de las agresiones sin importar cual sea su origen. De esta manera, es posible considerar a los TLR y a otros receptores aun desconocidos como un puente que permite expandir el modelo del peligro más allá de las fronteras del sistema inmune. Los Receptores tipo Toll (TLR) son receptores transmembrana de tipo 1 que presentan homología con la proteína Toll de Drosophila y el receptor de la IL-1 (IL-1r). Estos receptores fueron descritos primero en Drosophila melanogaster, como un grupo de moléculas necesarias durante el desarrollo embrionario; posteriormente se observó que algunos de ellos protegían a la mosca adulta de las infecciones por hongos mediante la estimulación de la secreción de péptidos anti-fúngicos. Más adelante se empezaron a clonar genes relacionados en plantas, gusanos, aves y mamíferos, lo cual demostró su importancia en la escala evolutiva como parte del sistema inmune innato y como un mecanismo para reconocer patrones moleculares de organismos no relacionados (4-7). En la actualidad se conocen 11 TLR en humanos (TLR1-TLR11) que tienen un patrón de expresión variable en los tejidos linfoides y no linfoides. De modo característico, los TLR tienen un amplio rango de ligandos que incluyen motivos estructurales presentes en bacterias, hongos levaduras y parásitos (Tabla I), así como de algunos componentes derivados de los tejidos del hospedero(8) que se mencionarán posteriormente. Después de la interacción con su ligando respectivo, los TLR dimerizan y sufren un cambio 117 RECEPTORES TIPO TOLL: ENTRE EL RECONOCIMIENTO DE LO NO PROPIO INFECCIOSO Y LAS SEÑALES ENDÓGENAS DE PELIGRO VOL. 25 NUM. 2/ 2006 TABLA I. TLR de mamíferos: expresión y ligandos Receptor Expresión (mRNA) Ligando Origen del ligando TLR1 (con TLR2) M, N, LB, NK, CDi, CDpl Lipopéptidos triacilados (Pam3Cys) Factores solubles Bacterias y micobacterias Neisseria meningitidis TLR2 PMN, M, CD, CDi Lipoproteínas y lipopéptidos Peptidoglicano (PG) Ácido lipoteicoico (LTA) Lipoarabidomanano Modulina soluble en fenol Glicoinositolfosfolípidos Glicolípidos Porinas Lipopolisacárido atípico Lipopolisacárido atípico Zymosan Varios patógenos Bacterias Gram + Bacterias Gram + Mycobacteria S. epidermidis T. cruzi T. maltophilum Neiseria Leptospira interrogans Porphyromonoa gingivalis Hongos TLR3 CD, CDi RNA viral de doble cadena Poli(I:C) Virus Sintético TLR4 C.End, M, N, CD Lipopolisacárido (LPS) Poteína de fusión Proteína de la envoltura HSP60 Bacterias Gram Virus Sincitial respiratorio Virus de tumor mamario Chlamydia pneumoniae TLR5 M, CD, CDi Flagelina Bacterias TLR6 (con TLR2) M, CDi, CDpl Lipopéptidos diacilados (Pam2Cys) LTA Zymosan Mycoplasma Bacterias Gram + Hongos TLR7 CDpl Imidazoquinolina ss RNA Compuesto sintético Virus TLR8 M, CDi Imidazoquinolina ss RNA Compuesto sintético Virus TLR9 M, CDpl DNA con motivos CpG Bacterias y virus TLR10 CDi ND ND TLR11 Epitelio renal* ND Bacterias uropatogénicas M: monocito; N: neutrófilo; CD: célula dendrítica, CDi: CD inmadura; CDpl: CD plasmocitoide; C.End: célula endotelial; NK: Natural killer. * Murino. En humanos se expresa una forma truncada de la proteína. (Adaptado de Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol 2004;4:499-511. conformacional requerido para el reclutamiento corriente abajo de moléculas de señalización. Estas incluyen moléculas adaptadoras como MyD88, TIRAP/MAL, TRIF y TRAM, cinasas asociadas con el receptor de IL-1 (IRAK), cinasas activadas por el factor transformante de crecimiento beta/TGF-β (TAK1), proteínas de unión a TAK1 (TAB1), TAB 2 y el factor 6 asociado con el receptor de TNF (TRAF6). Cada molécula adaptadora induce vías de señalización intracelular distintas que promueven la transcripción de genes de citocinas pro-inflamatorias, quimiocinas y moléculas coestimuladoras(8). 118 EXPRESIÓN DE LOS TLR EN CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE El sistema inmune adaptativo ha evolucionado para desarrollar diferentes tipos de respuesta contra diferentes patógenos. Es así como los virus y las bacterias intracelulares estimulan la generación de células Th1 que secretan IFNγ; esta citocina activa los macrófagos incrementando su actividad fagocítica y citocida e induce a los LB hacia la secreción de inmunoglobulinas IgG3 e IgG1. En contraste, los helmintos casi siempre inducen respuestas de LTh2; estos linfocitos producen IL-4, IL-5 e IL-13 que activan INMUNOLOGÍA eosinófilos e inducen en los LB el cambio de isotipo hacia IgE e IgG4 (9-11). Cada una de estas respuestas es la más adecuada para eliminar el tipo de infección que lleva a su inducción; por ejemplo, las IgG3 e IgG1 median efectivamente la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (Acs) contra patógenos intracelulares, en tanto que el entrecruzamiento de la IgE unida a los receptores FceR resulta en la degranulación de los mastocitos, basófilos y eosinófilos cuyo contenido es crítico en la destrucción de los helmintos. Además, de los LTh1 y LTh2, la respuesta inmune muchas veces induce LT reguladores (LTreg) que controlan a los LTh, previenen la autoinmunidad y el daño tisular y aseguran el desarrollo de la memoria inmunológica(12). El mecanismo que determina la decisión LTh1, LTh2 ó LTreg en respuesta a un patógeno particular no es muy claro; sin embargo, la evidencia experimental sugiere que el resultado se debe a la interacción compleja de varios determinantes, incluyendo el tipo de APC involucrada, la naturaleza del estímulo microbiano, el microambiente y las citocinas(13, 14). Entre las poblaciones de APC que incluyen las células dendríticas (CD), LB y macrófagos, las CD son las únicas capaces de activar a los LT vírgenes específicos de un Ag durante las respuestas primarias, lo que demuestra su importancia como puente entre la inmunidad innata y la adaptativa. Existen varias subpoblaciones de CD que difieren en su fenotipo; entre ellas se encuentran las CD mieloides (CDm) y las CD plasmacitoides (CDpl). Las CDm CD11c+ residen como células inmaduras en los epitelios de piel y mucosas donde interceptan los patógenos invasores, sufren un proceso de maduración caracterizado por la expresión de CD80, CD86, CCR7 y la migración a los tejidos linfoides secundarios, donde presentan los Ags derivados de los patógenos a los LT vírgenes. Por su parte, las CDpl CD11cmigran directamente de la sangre a los órganos linfoides secundarios y son potentes productores de IFN-α(15, 16). La CD madura determina el destino del LT CD4+ virgen mediante tres señales: La señal 1 depende de la unión del complejo formado por la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II y el péptido derivado del patógeno (MHC II-péptido) con el TCR del LTh; la señal 2 se refiere a la interacción de moléculas coestimuladoras expresadas en la membrana de la CD y el LT mientras que la señal 3 depende de las citocinas producidas por la CD activada. En la CD, la expresión de MHCII, CD80 y CD86 y la producción de citocinas polarizantes se produce durante su maduración y depende a su vez de la forma en que la CD sea activada por señales derivadas de los PAMPs y de los tejidos lesionados(17). Es importante señalar que las CD expresan diferentes PRR dependiendo de su origen y estado de maduración, razón por la cual responden al reto con M. MESA-VILLANUEVA, P.J. PATIÑO antígenos microbianos de diferente origen(18-20). Por ejemplo, las CDm expresan todos los TLR, excepto TLR9 y su estimulación con LPS y peptidoglicano (PG) conduce a una potente producción de IL-12; por su parte, las CDpl que expresan TLR7 y TLR9 producen interferones tipo I en respuesta a ssRNA y a los oligodesoxinucleótidos (ODN) ricos en motivos CpG. Tanto la IL-12 como los IFN tipo I dirigen la polarización de los LT vírgenes hacia el fenotipo Th1(16, 21). En el caso de los helmintos y de los alergenos que inducen respuestas Th2, los datos de las investigaciones aún no son claros y se ha postulado que la generación de los LTh2 es una respuesta constitutiva ante la falta de IL-12. Sin embargo, como sólo unos pocos Ags de esta clase son reconocidos por TLR (fosfoglicanos de T. cruzi, Ags de los huevos de Schistosoma-SEA, ciertas formas de Candida o LPS de Porphyromona gingivalis)(22), algunos investigadores opinan que la respuesta Th2 es regulada mediante un sistema de reconocimiento diferente que es independiente de la familia de los TLR(23). Los TLR también participan en el modelamiento de la respuesta adaptativa al inducir en las CD la secreción de citocinas que actúan sobre los LTreg naturales o sobre los LTreg adaptativos. Se ha observado por ejemplo, que las hifas de Candida albicans, la hemaglutinina filamentosa de Bordetella o el factor de virulencia LcrV de Yersinia inducen CD maduras que secretan IL-10, citocina importante en la expansión de las poblaciones de LT reguladores naturales. Por otro lado, algunos patógenos como Plasmodium falciparum, especies de micobacterias, el virus de la hepatitis C, el herpes simple y el citomegalovirus pueden inducir una maduración incompleta de las CD y generar CD que polarizan los LT hacia un fenotipo regulador adaptativo(12). También se ha observado que la activación de las CD por algunos ligandos de TLR puede inducir la secreción de IL-6 y de otros factores que eliminan la supresión de los LT efectores ejercida por los LTreg naturales(24). Además de las CD, los TLR se expresan también en fagocitos, mastocitos y células NK. La estimulación de estas células mediante estos receptores activa vías de señalización que amplifican la inmunidad innata en calidad y duración. Fagocitos: Los polimorfonucleares neutrófilos (PMN) expresan todos los TLR excepto TLR3. La estimulación de los PMN mediante los TLR induce el desprendimiento de L-selectina (CD62L), inhibe la quimiotaxis frente a IL-8, incrementa la fagocitosis de perlas de látex opsonizadas y los sensibiliza al estímulo con el péptido bacteriano f-MLP para generar anión superóxido. Adicionalmente, los PMN producen quimiocinas como MIP-1α/CCL3 y MIP-1β/CCL4 responsables de reclutar monocitos y células NK, IL-8/CXCL8 119 RECEPTORES TIPO TOLL: ENTRE EL RECONOCIMIENTO DE LO NO PROPIO INFECCIOSO Y LAS SEÑALES ENDÓGENAS DE PELIGRO y GRO-a/CXCL1 que atraen otros neutrófilos y MIP-3α/CCL20 que recluta CD inmaduras. Por el contrario, no expresan genes de quimiocinas específicos de LT, LB, CD maduras ni de LTh2. Es interesante anotar que la activación de los neutrófilos con LPS y LTA altamente purificado inhibe su apoptosis e incrementa su vida media útil más allá de 610h(25). Estos resultados en conjunto sugieren que la activación de los neutrófilos vía TLR no se asocia con la inmunidad adaptativa, sino más bien con una expansión de la inmunidad innata tanto en magnitud como en duración con el fin de conceder el tiempo necesario para que el sistema inmune adaptativo genere inmunidad esterilizante y de memoria(26). Por otro lado, los macrófagos también expresan TLR y su activación es responsable no sólo de la producción de citocinas pro-inflamatorias sino también de los procesos de formación del fagolisosoma. Los macrófagos de ratones knock out para TLR2 y TLR4 (TLR2 x 4–/–) internalizan menos bacterias, generan menos fagolisosomas y tienen menor actividad bactericida que los de tipo silvestre(27). Otra función importante de los macrófagos que se modula vía TLR es la síntesis de moléculas involucradas en la reparación tisular. Este efecto está mediado por redes más complejas en las que participa la adenosina. La adenosina es una molécula protectora durante estados de estrés celular que estimula en los macrófagos la secreción de citocinas anti-inflamatorias y reduce la de citocinas pro-inflamatorias; sin embargo en presencia de algunos PAMP como LPS, el perfil de citocinas del macrófago no sólo deja de ser pro-inflamatorio sino que cambia a angiogénico mediante la inducción del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)(28) y la disminución simultánea de TNF-α(29). No es claro aún el mecanismo responsable de la expresión incrementada de VEGF pero teniendo en cuenta que ni el receptor de adenosina (A2AAR) ni los TLR inducen niveles elevados de VEGF, este sinergismo para la inducción del factor angiogénico sugiere la existencia de un puente entre inflamación post-infecciosa y reparación tisular (Fig. 2)(30). En este aspecto, es importante mencionar que el LPS puede estimular la producción de endotelio tanto in vitro como in vivo. En un estudio con líneas de células endoteliales humanas cultivadas sobre perlas inertes recubiertas de gelatina y embebidas en fibrina, se observó que el LPS podía inducir la germinación de la capa celular y que este efecto dependía de la vía de señalización TLR4-TRAF6- NFκB y JNK. Además es de resaltar que este hallazgo se corroboró in vivo mediante la evidencia de neovascularización de la membrana corioalantoidea de embriones de pollo tratados con LPS(31). Mastocitos: Dependiendo de su origen tisular, los mastocitos expresan diferentes TLR. Por ejemplo, los mastocitos humanos derivados de sangre de cordón umbilical expresan 120 VOL. 25 NUM. 2/ 2006 Figure 2. Los TLR sinergizan con el A2AAR en la inducción de VGEF (Adaptado de Olah, M. Mol Inter. 2003:370-374)(30). TLR1, TLR2, TLR6, MD-2 y MyD88 y en presencia de PG de S. aureus y de zymosan, sintetizan GM-CSF, IL-1β, RANTES y leucotrienos aunque no se degranulan; por el contrario el estímulo con Pam3Cys induce degranulación pero bajos niveles de mediadores proinflamatorios(32). Curiosamente también se ha observado que los mastocitos humanos estimulados con PG pueden secretar histamina y sintetizar un perfil de citocinas pro-Th2 (TNF-α, IL-5, IL-10 e IL-13)(33). Por su parte, los mastocitos derivados de sangre periférica expresan TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7 y TLR9 y sintetizan TNF-α, IL-1β, IL-5 y GM-CSF en respuesta al estímulo con PG, LPS, flagelina y CpG-A. Por su parte, algunos virus dsRNA y el poli I:C inducen producción de IFN-α/β, señalando que los TLR de los mastocitos también pueden alertar sobre la presencia de infecciones virales(34). Es probable que la estimulación de los mastocitos vía TLR sea importante en la polarización de las CD presentes en el tejido afectado y/o que amplifique la respuesta del hospedero a la infección por patógenos; sin embargo, también podría ser responsables de la inflamación crónica en sitios ricos en mastocitos tales como la piel y los pulmones(32). Células NK: Aunque las células NK participan en la respuesta inmune contra los microorganismos, su capacidad de reconocer y ser activadas directamente por los patógenos no es clara. Como es de esperarse por su participación en la defensa antiviral, las células NK expresan TLR3 y responden a la estimulación con poli I:C incrementando la expresión INMUNOLOGÍA de TLR3 y CD69 y la secreción de IL-6, IL-8 e IFN-γ (35). También se ha observado activación de las células NK humanas cultivadas con IL-12 en respuesta al estímulo con dsRNA y CpG vía TLR3 y TLR9 respectivamente. En respuesta a estos PAMP, las células NK expresan CD69 y CD25, liberan TNF-α e IFN-γ e incrementan su actividad citolítica sobre células tumorales(36). Las NK también responden directamente al estímulo con PAMP derivados de protozoarios y bacterias; por ejemplo responden vía TLR2 a lipofosfoglicanos (LPG) de Leishmania, induciendo la producción de IFN-γ y TNFα(37). También son activadas por la proteína A de la membrana externa de Klebsiella pneumoniae (ligando de TLR2) y la flagelina (ligando de TLR5) que inducen la producción de IFN-γ y la liberación rápida de α-defensinas, amplificando así la respuesta innata(38). Aparte de su amplia distribución en las células del sistema inmune innato, también se ha observado expresión de TLR en los LTreg y en los LB. En ratones por ejemplo, se detectó la expresión de TLR4, TLR5, TLR7 y TLR8 en LTreg CD4+ CD25+. La estimulación de estas células con LPS indujo un incremento en la expresión de marcadores de activación, su proliferación y aumento de su actividad supresora sobre los LT efectores CD4+CD25– (39). De acuerdo con estas observaciones se ha postulado que después de la activación inicial de los LTh, este mecanismo podría contribuir al control de la respuesta inmune evitando el desarrollo de reacciones de autoinmunidad. Linfocitos B: Además de su participación en la respuesta inmune adaptativa, los LB tienen características de APC porque se activan cuando detectan moléculas mediante los TLR. A diferencia de los LB murinos que expresan TLR4 y TLR9 constitutivamente, la expresión de los TLR en LB humanos es regulada durante su desarrollo y maduración. Los LB vírgenes (CD19+CD27-) expresan la mayoría de TLR en bajos niveles y la expresión de TLR9 y TLR10 se induce rápidamente luego de activación vía BCR. Por el contrario, las células de memoria (CD19+CD27+) expresan TLR6, 7, 9 y 10 en niveles constitutivamente elevados, especialmente TLR7 y TLR9 y proliferan en respuesta a su agonista, el CpG. Con base en estos experimentos, se concluyó que los LB de memoria proliferan y se diferencian a células secretoras de Ig en respuesta a CpG en tanto que los LB vírgenes sólo lo hacen si simultáneamente son activados por el BCR. De acuerdo con estas observaciones, los TLR regulan la respuesta de Acs en una forma independiente de LT y de manera diferente durante la respuesta primaria y la secundaria. Por eso se ha propuesto el siguiente orden de eventos: En la respuesta primaria, el Ag primero se une al BCR y activa la expresión de TLR9, luego el Ag y el ligando de TLR9 se internalizan en el endosoma y se activa la transcripción de M. MESA-VILLANUEVA, P.J. PATIÑO los genes involucrados en la respuesta de los LB; De esta forma se previene la activación policlonal y se asegura la inducción de genes en respuesta a un Ag determinado. En contraste, la expresión constitutiva de los TLR en los LB de memoria permite la activación policlonal de la población completa de memoria facilitando la generación de una respuesta rápida40. El TLR9 también puede modular la respuesta de los LB dependiente del LT. Específicamente se evidenció que la producción de IL-6, TNF-α e IL-10 por los LB vírgenes y de memoria estimulados con CD40L se incrementaba en presencia de CpG. Además, la combinación de los dos estímulos indujo la síntesis de IL-12p70 y la secreción de IgM sin necesidad de entrecruzamiento del BCR. Curiosamente, estos LB fueron capaces de inducir la síntesis de IFN-γ en LTCD4+ en una forma dependiente de IL-12 aunque no pudieron inducir su proliferación. Estos resultados son particularmente interesantes, porque demuestran que los LB podrían regular la polarización de los LTh en la respuesta primaria. En este aspecto, es interesante señalar que el reconocimiento del Ag específico por el BCR induce respuestas Th2; sin embargo, varios estudios indican que luego de estimulación mediada por CD40L, el LB adquiere características de CD con capacidad de captar y presentar Ags exógenos a los LT independientemente del BCR. De esta forma, se puede suponer que el estímulo adicional mediante el TLR9 que induce secreción de IL-12 puede polarizar la respuesta hacia Th1(41). EXPRESIÓN DE TLR EN CÉLULAS DE SISTEMAS DIFERENTES AL SISTEMA INMUNE La evidencia creciente de la expresión de los TLR en células no pertenecientes al sistema inmune (Tabla II), sugiere un papel más amplio para estos receptores en la respuesta de los tejidos infectados o lesionados y dan soporte al modelo del peligro para explicar no sólo el inicio de la respuesta inmune sino también del desarrollo de una serie de respuestas metabólicas y de comportamiento que son importantes en la resolución de los estados anormales que amenazan la integridad del hospedero. Fibroblastos: Los productos bacterianos que penetran en el compartimiento subepitelial pueden activar la inmunidad innata al interactuar con células como los miofibroblastos intestinales. Estas células así como las líneas celulares derivadas de ellas, presentan expresión constitutiva de TLR19; además la estimulación con LPS y LTA produce un incremento de TLR2, 3, 4, 6, 7 y de MyD88. En las líneas celulares se observa adicionalmente traslocación de p65 al núcleo, activación de la vía de las MAPK e incremento en la secreción de IL-8(42). De modo similar, los fibroblastos 121 RECEPTORES TIPO TOLL: ENTRE EL RECONOCIMIENTO DE LO NO PROPIO INFECCIOSO Y LAS SEÑALES ENDÓGENAS DE PELIGRO TABLA II. Expresión de TLR en células no inmunes Célula TLR Miofibroblastos intestinales TLR1-9 Fibroblastos gingivales TLR2, TLR4 Adipocitos TLR2 Epitelio respiratorio TLR1-10 Epitelio Intestinal TLR 2, TLR3, TLR4 variable Osteoblastos TLR2, TLR4, TLR6 Osteoclastos TLR4 Astrocitos y oligodendrocitos TLR2, TLR3 Microglia de CVO y del parénquima TLR2, TLR4 Placenta TLR7 gingivales que son los principales constituyentes de la gingiva responden al estímulo de LPS de bacterias patógenas de cavidad oral mediante la producción de IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α y expresión de CD14, TLR2 y TLR4(43). Adipocitos: Los pre-adipocitos y adipocitos pueden jugar un papel importante en la regulación de la inmunidad innata y la adaptativa. Los adipocitos murinos 3T3-L1 expresan TLR4 constitutivamente y cuando se estimulan con LPS incrementan la expresión de TLR2, TNF-α, IL-6 y de leptina. Respecto a la leptina, es importante la observación de que esta molécula puede ser un vínculo entre el sistema inmune y la regulación del balance energético en estados de peligro; en efecto la leptina incrementa la fagocitosis y la secreción de citocinas pro-inflamatorias pero disminuye el apetito; observación que podría asociarse con la anorexia característica de los estados infecciosos(44). Epitelio: Los mecanismos de defensa de las superficies epiteliales son muy importantes por varias razones: (i) Todas las infecciones invasivas se inician al atravesar la barrera epitelial (ii) Muchas superficies corporales están densamente colonizadas por una microflora normal de modo que la diferenciación entre microorganismos comensales y patógenos supone un problema para el epitelio. (iii) La gran mayoría de retos microbianos del hospedero son rupturas menores de las superficies epiteliales por lesiones traumáticas y sin embargo, los microorganismos son rápidamente atacados por los mecanismos de defensa local sin activación de respuesta sistémica. Para poder responder ante el reto de la flora comensal y la patógena, el epitelio requiere receptores como los TLR. Sin embargo, es importante tener en cuenta que un lugar anatómico como el tracto respiratorio inferior mantiene estériles sus superficies epiteliales de modo que la presencia de PAMP es indicativa de infección y por tanto debe activar los mecanismos de defensa para eliminarla y mantener la función del órgano. Por el contrario la mayoría de superficies corporales tales como piel, tracto respiratorio 122 VOL. 25 NUM. 2/ 2006 superior y tracto gastrointestinal están permanentemente colonizadas por una variedad de microbios. Aunque algunas bacterias comensales no producen señales estimuladoras, otras sí lo hacen y en ese caso es necesario que las células epiteliales sean refractarias a los PAMP ó que sean capaces de diferenciar los microbios comensales de los patógenos mediante mecanismos aun desconocidos. Actualmente no es claro el mecanismo que regula la tolerancia del epitelio a la flora normal y que permite la respuesta a los patógenos invasores. Sin embargo, con base en algunos estudios se propone que la tolerancia puede deberse a la expresión compartimentalizada de los TLR en el epitelio, a una baja expresión de TLR y de coreceptores como MD2, a la expresión de moléculas inhibidoras como la forma truncada de MyD88 ó a la activación de la cinasa inhibidora IRAK-M. Por otro lado, en el caso de una infección, las citocinas pro-inflamatorias regularían positivamente la expresión de los TLR y sus coreceptores en el epitelio para que pueda responder adecuadamente. A pesar de su importancia en los epitelios, solo existen unos pocos trabajos sobre la expresión y función de los TLR en este tipo de tejido y los datos son diversos debido en parte a los diferentes sistemas experimentales empleados, al origen, dosis y tiempo de incubación con los PAMP. El mRNA de varios TLR se ha detectado en diferentes epitelios; sin embargo es importante tener en cuenta que la presencia del transcrito no indica necesariamente la expresión de la proteína. El TLR4 ha sido el receptor mas analizado ya que se ha detectado en varias líneas celulares derivadas de epitelio de piel, córnea, gingiva, tracto respiratorio, estómago, intestino, túbulos renales, vejiga, cervix y ovario (45). A continuación se describen algunos de los hallazgos en epitelio respiratorio e intestinal. Epitelio respiratorio: El epitelio del tracto respiratorio es el primer punto de contacto para las sustancias inhaladas tales como los contaminantes ambientales, el humo de cigarrillo, los aeroalergenos y los microorganismos. El epitelio respiratorio no es solamente una barrera pasiva sino que además contribuye activamente al sistema inmune innato. La respuesta inmune en el epitelio respiratorio es muy importante en una variedad de enfermedades humanas; los defectos en el sistema de defensa pueden producir colonización microbiana y posterior infección del parénquima pulmonar o desencadenar procesos inflamatorios crónicos que son la base fisiopatológica de enfermedades como el asma. El epitelio respiratorio detecta la presencia de microorganismos mediante PRR como TLR y lectina unidora de manosa (MBL) y responde mediante la liberación de péptidos antimicrobianos hacia el lumen de la vías aéreas y de quimiocinas y citocinas hacia la submucosa iniciando INMUNOLOGÍA así una reacción inflamatoria. Esta respuesta inflamatoria incluye el reclutamiento de fagocitos que sirven para remover microorganismos y de CD y linfocitos que pueden ayudar a montar una respuesta inmune adaptativa(46). La expresión del mRNA de todos los TLR (TLR1-TLR10) se ha detectado tanto en células de epitelio respiratorio normal como en la línea celular BEAS-2B mediante RT-PCR y PCR en tiempo real(47). En cuanto a compartimentalización, se ha observado que TLR2 se expresa específicamente en la porción apical de las células junto con el gangliósido asialoGM1, lo cual permite que después de la estimulación, las moléculas se agreguen en microdominios lipídicos de la membrana celular (raft) para desencadenar señales que son capaces de iniciar la defensa del hospedero en las vías aéreas(48). Diferentes bacterias y PAMP se han utilizado para estimular células del epitelio respiratorio. La bacteria Haemophilus influenza y la lipoproteína de su membrana, P6 son reconocidas por TLR2, lo cual desencadena la traslocación de NF-κB, la activación de las MAPK y el incremento en la producción de IL-8, IL-1β y TNF-α(49). El LPS y el LTA también inducen traslocación de NF-κB vía TLR4 y TLR2 respectivamente e inducen no sólo la síntesis de citocinas pro-inflamatorias sino también de β-defensinas que reclutan CD(50). Respuestas similares son desencadenadas por el rinovirus, su dsRNA y el poli I:C que interactúan con TLR3(51). El estímulo con PG, zymosan, dsRNA, LPS, flagelina y CpG de la línea BEAS2B induce la expresión de IL-8, SAA, TLR3, MIP-3α y GMCSF, aunque el efecto es mayor con dsRNA. La inducción de las citocinas MIP-3α y GM-CSF es crítica porque facilita la migración de las CD inmaduras y su posterior maduración(47). Epitelio intestinal: De modo similar al epitelio respiratorio, el epitelio intestinal no es una simple barrera física sino que contribuye activamente en la respuesta inmune; sin embargo a diferencia del epitelio respiratorio inferior que es estéril, el epitelio intestinal está expuesto al mayor reservorio de microorganismos del cuerpo humano. Existen relativamente pocas bacterias en los dos primeros tercios del intestino delgado, pero la densidad se incrementa a 108 bacterias/ml en el íleon y a 1011-1012 organismos/g en el colon; además muchos compuestos microbianos llegan a la mucosa intestinal por la ingestión de alimento contaminado. Ante este reto microbiano, las células del epitelio intestinal deben tener mecanismos de tolerancia y a la vez conservar latente la capacidad de respuesta al reto por patógenos. El reconocimiento de las bacterias comensales y de los patógenos en el epitelio intestinal también involucra la participación de los TLR. El TLR3 y el TLR4 se han detectado en líneas celulares derivadas de epitelio intestinal humano como CaCO2, T84 y HT29; sin embargo cuando se estimulan con LPS no responden, al parecer por la ausencia de CD14. M. MESA-VILLANUEVA, P.J. PATIÑO Cuando se adiciona suero como fuente de LBP y de CD14, la respuesta es variable; en el caso de CaCO2 se observa activación de NF-κB y de las cinasas MAPK, p38 y JNK aunque la magnitud de la respuesta de MAPK p42/p44 es menor a la observada con PMA. Esto sugiere que las células de este epitelio pueden estar parcialmente desensibilizadas o ser tolerantes al LPS para limitar la activación de las células inmunes adyacentes ante la exposición constante de LPS en la superficie apical del epitelio(52). En otro trabajo se detectó expresión muy baja de TLR4, y ausencia de MD2 así como falta de respuesta a LPS evaluada mediante traslocación de NF-κB y producción de IL-8 en las líneas utilizadas(53); de acuerdo con esto, se postuló que la falta de respuesta de las células intestinales a LPS se debía a la ausencia de MD-2. Posteriormente se observó que las citocinas IFN-α e IFN-γ incrementan la expresión de TLR4 y de MD-2 respectivamente, lo cual sugiere que aunque la expresión de los TLR puede ser baja en estado basal y en presencia de LPS, ante un estímulo inflamatorio o infeccioso que genere respuestas adaptativas Th1, su nivel y el de otros co-receptores puede incrementarse para poder responder adecuadamente. De acuerdo con esta hipótesis, el epitelio intestinal que es tolerante a los comensales, puede integrarse a la respuesta inflamatoria sólo tardíamente cuando el sistema inmune adaptativo requiere su ayuda para eliminar a los patógenos(54). Otro mecanismo potencial para establecer tolerancia a la flora comensal en el intestino, es la ubicación de los TLR en las células epiteliales. Aunque los TLR se han detectado en la superficie apical y basolateral, en un estudio reciente en ratones se demostró su expresión preferencial en las criptas primarias que contienen células de Paneth productoras de péptidos antimicrobianos. Estos péptidos antimicrobianos pueden proteger el sitio de la invasión por microorganismos comensales y además pueden unirse al LPS e inhibir su actividad pro-estimuladora. Sin embargo, en el curso de una infección por patógenos entéricos invasivos con destrucción tisular subsecuente se facilita la aproximación entre TLR4 y LPS de modo que se podría estimular la respuesta del hospedero(55). Además, la compartimentalización de los TLR en el epitelio gastrointestinal también se presenta a nivel celular; por ejemplo, se ha observado que TLR4 se concentra en el aparato de Golgi y que el TLR5 se ubica preferencialmente en la cara basolateral de la célula(56); esta ubicación puede ser otra estrategia para ocultar los TLR a la flora comensal y evitar la activación de la respuesta inflamatoria. La importancia de la regulación de TLR4 en el epitelio intestinal se hace evidente en condiciones como la enfermedad inflamatoria del intestino en la que se observa inflamación crónica en ausencia de patógenos acompañada de una elevada expresión de TLR4(45). 123 RECEPTORES TIPO TOLL: ENTRE EL RECONOCIMIENTO DE LO NO PROPIO INFECCIOSO Y LAS SEÑALES ENDÓGENAS DE PELIGRO Tejido óseo: La formación y destrucción de hueso es un proceso dinámico a cargo de macrófagos, osteoblastos (células del estroma de la médula ósea), osteoclastos (células derivadas de monocitos) y citocinas. Entre estas se encuentran el factor estimulante de macrófagos (M-CSF) secretado por los osteoblastos y el ligando del receptor activador de NF-κB (RANKL) que se expresa en los osteoblastos como una citocina asociada a la membrana celular. Los precursores de osteoclastos expresan el receptor de RANKL (RANK) que les permite interactuar con el RANKL de los osteoblastos y mediante interacciones célula-célula se diferencian en osteoclastos en presencia de M-CSF; adicionalmente, la interacción RANK del osteoclasto maduro con el RANKL del osteoblasto genera señales de supervivencia de los osteoclastos y aumenta su capacidad de resorción ósea(57, 58). Se ha observado que LPS es un potente estimulante de la resorción ósea durante las enfermedades inflamatorias(59) aunque el mecanismo responsable hasta ahora empieza a conocerse y parece implicar una relación compleja entre osteoblasto y osteoclasto. Se sabe por ejemplo que los osteoblastos expresan TLR4, MD-2, CD14 y MyD88 y que cuando se estimulan con LPS producen IL-1β, IL-6 y TNFα en una vía dependiente de las MAPK p38 y ERK. Además de las citocinas pro-inflamatorias, la estimulación de los osteoblastos con LPS induce un incremento en la expresión de CXCL10, ligando de CXCR3 que se encuentra presente en la membrana de LT; es decir que ante un reto infeccioso por Gram negativos, los osteoblastos pueden reclutar LT al sitio de la infección(60-63). Estudios posteriores han mostrado que las vías de señalización de los TLR en las células que participan en la formación y resorción ósea son mucho más complejas y están reguladas en parte por la expresión diferencial de TLR y de moléculas adaptadoras. Por ejemplo, utilizando ratones MyD88–/– y TRIF–/–, se observó que el LPS y el diacil-lipopéptido activan al osteoblasto en una vía dependiente de MyD88 que estimula la expresión del RANKL; además, sólo el LPS promovió la secreción de IL-6. Por su parte, los osteoclastos no fueron susceptibles de activación por diacil-lipopéptido debido a la ausencia de TLR6 y la activación con LPS indujo señales de sobreviva mediante una vía dependiente de MyD88. Estas observaciones de la regulación ósea mediadas por PAMP ponen en evidencia la existencia de vías normales en la regulación de este proceso por ligandos fisiológicos aún desconocidos cuya importancia es obvia ante la evidencia de osteopenia en ratones deficientes en MyD88(64). Sistema Nervioso Central (SNC): El SNC, que por mucho tiempo se consideró un sitio inmunológicamente privilegiado, es capaz de generar una respuesta innata en parte gracias a la expresión de algunos TLR. Se ha observado expresión 124 VOL. 25 NUM. 2/ 2006 de TLR en células del SNC como células de microglia, astrocitos y oligodendrocitos. En ratones, los receptores TLR4 y CD14 se expresan constitutivamente en macrófagos y células de microglia de los órganos circunventriculares del cerebro (organum vasculosum de la lamina terminalis, el órgano subfornical, la eminencia media, el área postrerna), los plejos coroideos y las leptomeninges y en otras estructuras que carecen de barrera hematoencefálica(65, 66). Además, en respuesta a una dosis única de LPS, estas regiones muestran expresión inducible de TLR2 que se inicia en estas zonas y que al cabo de unas horas se extiende a zonas mas profundas del cerebro(67). Las células de microglia humanas expresan mRNA de TLR1-9 en tanto que los astrocitos y oligodendrocitos expresan primariamente TLR2 y TLR3. La expresión de las proteínas en células de microglia cultivadas está restringida a vesículas intracelulares en tanto que en astrocitos están localizadas en la superficie celular(68). También, se ha observado que los TLR expresados en células del parénquima cerebral pueden interactuar directamente con ligandos que acceden al SNC en sitios que carecen de barrera hematoencefálica; se postula por ejemplo que el LPS puede inducir localmente la síntesis de prostaglandinas inductoras de fiebre, de citocinas y neurotrasmisores asociados con el comportamiento propio de la enfermedad(69). Por otro lado, las citocinas secretadas por células de microglia activadas vía TLR pueden desencadenar indirectamente muchas respuestas cerebrales. El LPS circulante puede unirse a sus receptores sobre macrófagos y células de microglia estimulando la señalización de NF-κB y activando la transcripción de TNF-α; esta citocina a su vez activaría la señalización de NF-κB y la transcripción de genes que codifican citocinas y quimiocinas primero en la misma célula de microglia y más tarde en otras adyacentes(70). Se desconoce el papel de CD14, TLR2 y TLR4 en el cerebro. Se ha postulado que la estimulación directa tenga función protectora aunque paradójicamente también podrían participar en la producción de daños degenerativos. La evidencia experimental y clínica en pacientes con enfermedades neurodegenerativas señala que es poco probable que la respuesta innata que se presenta en el cerebro en respuesta a infecciones sistémicas o daños cerebrales sea deletérea para el SNC porque ocurre rápidamente e induce la liberación de factores neurotróficos y otras moléculas importantes en la homoeostasia cerebral, la neuroprotección y la reparación tisular. Por ejemplo, el TNF-α induce la proliferación de oligodendrocitos y estimula el proceso de remielinización y la IL-1β actúa sobre los astrocitos induciendo la síntesis del factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrófico ciliar (CNTF) y el factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF1) que promueven la reparación del tejido nervioso; sin embargo, si esta respuesta es elevada o sostenida y se acompaña de INMUNOLOGÍA M. MESA-VILLANUEVA, P.J. PATIÑO TABLA III. Ligandos endógenos de TLR Estímulo endógeno TLR involucrado Respuesta celular activada HSP TLR4 (HSP60) TLR2/4 (HSP70, GP96) Activación de NF-κB, maduración de CD, síntesis de citoquinas Hialuronano TLR4 Activación de NF-κB, maduración de CD, síntesis de citoquinas Proteína surfactante A TLR4 Activación de NF-κB, síntesis de citoquinas Células necróticas TLR2 Activación de NF-κB, maduración de CD, inducción de genes de reparación tisular HMGB1 ¿? Inflamación Complejos de cromatina-IgG TLR9 Activación del LB Fibronectina, fibrinógeno, heparan TLR4 Inducción de genes inflamatorios, maduración de CD Revisado por Beg,AA.. Endogenous ligands of Toll-like receptors: implications for regulating inflammatory and immune responses. Trends Immunol 2002;23:509-512. una respuesta adaptativa especialmente mediada por LTh1 puede ser nociva(71). Por otro lado, se postula que la respuesta inmune innata que se desarrolla en el cerebro es un espejo de la respuesta que ocurre en periferia y que es indispensable para organizar los componentes centrales de respuesta del hospedero a la infección que comprende desde la fiebre y la activación neuroendocrina hasta el comportamiento asociado con enfermedad(72). TLR Y SEÑALES DE PELIGRO ENDÓGENAS: LO PROPIO ALTERADO Cuando se presenta un daño tisular, las células del organismo deben reconocer rápidamente la injuria para poder activar la inmunidad innata, reclutar células inflamatorias e iniciar el proceso de reparación. En el caso de las infecciones, las señales de alerta son aportadas en gran parte por los mismos microorganismos mediante los PAMP que son reconocidos por los TLR. En el caso de daño tisular en ambientes estériles, las señales provienen de componentes intracelulares de las células necróticas, de la matriz extracelular (ECM) y señales de estrés tales como las proteínas de choque térmico (HSP). En los últimos años se ha observado que algunas de estas moléculas endógenas que actúan como señales de peligro son reconocidas por los TLR. En el 2000, se publicó el primer artículo sobre una señal endógena de peligro que inducía una respuesta pro-inflamatoria mediada por un TLR; la señal de peligro era la HSP60 y el receptor implicado, el TLR4. Las HSP son proteínas evolutivamente conservadas presentes en todos los organismos procarióticos y eucarióticos, cuya expresión aumenta en respuesta a diferentes formas de estrés. En dicho trabajo se observó que los macrófagos de ratones C3H/HeN pero no los de ratones C3H/HeJ (que presentan una mutación en TLR4) estimulados con HSP60 producían TNF-α y NO y por tanto se concluyó que su actividad estaba mediada por TLR473. Aunque más adelante se encontró que la respuesta también dependía de TLR2 y que se acompañaba de activación de p38, JNK1/2 y ERK1/2 y NF-κB(74), estudios posteriores identificaron un receptor específico de HSP60 que interactuaba con TLR2 y TLR4 para transmitir señales(75). Más adelante se observó que otra HSP, la HSP70 también inducía en macrófagos la secreción de IL-12 y de la molécula de adhesión del leucocito al endotelio (ELAM-1) mediante una vía dependiente de TLR2, TLR4, MyD88 y TRAF6(76). Desde entonces se han descrito otras moléculas endógenas que interactúan directa o indirectamente con los TLR para transmitir señales de alerta al organismo (Tabla III). El hialuronano: (HA) es un componente estructural importante de la ECM que también hace parte de la superficie bacteriana. El HA se sintetiza en la superficie celular y es un polímero de alto peso molecular (mayor de 1x106 Da) compuesto de unidades repetidas de N-acetilglucosamina y ácido glucurónico. Cuando se producen lesiones tisulares, el HA se degrada a componentes de bajo peso molecular (sHA) que están involucrados en procesos de angiogénesis, proliferación celular, maduración, migración, activación de cascadas de señalización y expresión de genes inflamatorios. En un trabajo reciente se observó que las células endoteliales humanas aisladas de dermis de neonatos en cultivo reconocen estos sHA mediante TLR4 y activan la secreción de IL-8; además en ratones Balb/c inyectados intraperitonealmente 125 RECEPTORES TIPO TOLL: ENTRE EL RECONOCIMIENTO DE LO NO PROPIO INFECCIOSO Y LAS SEÑALES ENDÓGENAS DE PELIGRO con sHA, los niveles séricos de los homólogos de IL-8 humana, MIP-2 y KC aumentaron significativamente; por el contrario, este efecto no se observó en los ratones C3H/HeJ(77). Es importante recordar que aunque IL-8 es una citocina clave en el proceso de daño tisular porque recluta neutrófilos al sitio de la lesión, también induce la proliferación y migración de queratinocitos, incrementa la adherencia de monocitos y la quimiotaxis de linfocitos, eventos importantes en todas las fases de reparación tisular. Teniendo en cuenta que el HA también se encuentra en la superficie de bacterias como Streptococcus del grupo A, que es degradado por hialuronidasas de la bacteria y que los sHA bacterianos son igualmente reconocidos por TLR4, se puede considerar que HA no es una molécula que discrimina lo propio de lo no propio sino que es simplemente una señal de peligro. Por lo tanto, la habilidad de algunas bacterias para degradar el HA en componentes inactivos no reconocidos por los TLR puede ser un mecanismo de evasión de los sistemas de reconocimiento. Por otro lado, el organismo controla la activación del sistema innato por niveles elevados de sHA aclarando rápidamente el exceso producido diariamente; en efecto, aunque cerca del 50% del HA se recambia diariamente y aunque alrededor de 10-100 mg de HA entran a la sangre cada 24 horas, el nivel sérico sólo alcanza el 0,1% de esta cantidad y esta pequeña cantidad no activa la respuesta inmune(77). La proteína surfactante A (SP-A): Es una colectina involucrada en la defensa innata del hospedero y en la regulación del proceso inflamatorio en el pulmón. Puede transmitir señales vía TLR4 a los macrófagos que a su vez activan NF-kB y de esta manera induce la secreción de citocinas como TNF-α e IL-10(78). Las células necróticas: A diferencia de las células apoptóticas, las células que sufren necrosis liberan su contenido intracelular, lo cual contribuye a la inflamación secundaria al daño tisular. Las células necróticas son reconocidas vía TLR2 y activan la traslocación nuclear de NF-κB en fibroblastos viables, macrófagos y CD. Esta activación induce la transcripción de genes inflamatorios y de reparación tisular incluyendo quimiocinas específicas para los neutrófilos, la metaloproteinasa 3 y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)(79). Adicionalmente, las células necróticas pero no las apoptóticas pueden inducir maduración de las CD, colaborando así indirectamente en la activación del LT(80). La proteína de alta movilidad del grupo 1 (HMGP1): Este ligando potencial de los TLR, es una proteína clave en la arquitectura del núcleo que se libera pasivamente de células necróticas y que actúa como una citocina al ser reconocida por receptores específicos de productos terminales glicosilados. La respuesta inflamatoria mediada por HMGP1 incluye la producción de múltiples citocinas, la quimioatracción 126 VOL. 25 NUM. 2/ 2006 de algunas células pluripotenciales, la inducción de moléculas de adhesión vascular y la función alterada de células intestinales; su importancia es evidente cuando se observa que los antagonistas de HMGP pueden rescatar a los ratones de la sepsis letal(81). Acidos nucleicos: Teniendo en cuenta que el DNA y el RNA de los patógenos son reconocidos por TLR9, TLR3, TLR7 y TLR8, se supone que los productos derivados de los ácidos nucleicos del hospedero podrían también ser reconocidos por los TLR presentes en CD y macrófagos que participan como células removedoras de detritus celulares en los lugares de lesión tisular. Se ha observado por ejemplo, que TLR9 se une al DNA del hospedero ligado a histonas o a autoanticuerpos anti-histona(82) y que el RNA heterólogo liberado de ó asociado con células necróticas y el RNA generado por transcripción in vitro inducen la secreción de IL-8 en células embrionarias de riñón 293 transfectadas con TLR3(83). Estas observaciones tienen importantes implicaciones fisiológicas por su potencial de inducir respuestas autoinmunes(84). Finalmente, es importante señalar que no es claro si los ligandos endógenos de los TLR además de inducir inflamación y reparación tisular pueden activar una respuesta adaptativa aunque la evidencia sugiere que es maás probable que se induzcan fenómenos de tolerancia(85, 86). TLR Y RECONOCIMIENTO DE XENOANTÍGENOS? Existen algunas evidencias incipientes que sugieren que el sistema inmune innato reconoce antígenos de los tejidos de mamíferos y que promueve el rechazo de tejidos transplantados particularmente cuando provienen de otras especies. En uno de estos trabajos se utilizaron micromatrices para comparar la expresión de PRR en páncreas fetal fresco de cerdo con páncreas fetal recuperado dos días después de trasplante en ratones y se encontraron varios mRNA relevantes incluyendo los de algunos TLR, la proteína unidora de lípido A, el CD14, las galectinas, KIR, receptores scavenger de macrófagos y lectinas tipo C de macrófagos. Teniendo en cuenta que las células xenogénicas de los mamíferos no encajan dentro de lo no propio infeccioso ni en lo propio alterado, se podría pensar que los PRR reconocen algunos xenoantígenos porque existe cierto grado de sobrelapamiento entre ellos y los PAMP o porque existe reactividad cruzada para células xenogénicas de mamíferos, particularmente aquellas de especies filogenéticamente distantes(87). CONCLUSIONES Las evidencias presentadas sobre la amplia distribución tisular de los TLR así como el hecho de que reconocen y INMUNOLOGÍA trasmiten señales en respuesta a ligandos endógenos permiten considerar estas moléculas como receptores de reconocimiento de señales de peligro sin importar cual sea su origen; pero además, pone de manifiesto el hecho de que la maquinaria de moléculas adaptadoras y de las vías de señalización de los TLR está exquisitamente diseñada para responder ante esas señales de peligro de acuerdo con el patógeno o el ligando endógeno reconocido. Por esta razón los TLR y probablemente otros PRR se comporten como un puente que reconcilia las teorías de reconocimiento de lo propio no infeccioso y el modelo del peligro. Por otro lado, las observaciones aún incipientes sobre las respuestas generadas mediante los TLR en células diferentes a las del sistema inmune, plantea la posibilidad de empezar a considerar que cada una de las células del hospedero hace parte de ese sistema inmune innato que aunque está en reposo en condiciones normales, mantiene una capacidad de respuesta inmediata para defenderse de las agresiones no solo del medio externo, sino también del interno. Incluso, se ha propuesto que tal vez los PRR no evolucionaron para unirse a patógenos, sino que por el contrario los patógenos evolucionaron para unirse a ellos. Según este planteamiento, es posible que los TLR se hayan generado como receptores de señales de tejidos lesionados y que a través de la evolución los microorganismos hayan desarrollado mecanismos para utilizarlos como vehículos de invasión para aumentar su propia sobreviva. CORRESPONDENCE TO: Martha Mesa-Villanueva, MSc, Departamento de Microbiología, Universidad Javeriana. Carrera 7 No. 43-82. Bogotá, Colombia. Phone: 57 1 3208320, Ext 4153. Fax: 57 1 3208320, Ext 4022. email: mmesa@javeriana.edu.co REFERENCES 1. Janeway CA, Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1989; 54 Pt 1: 1-13. 2. Matzinger P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu Rev Immunol 1994; 12: 991-1045. 3. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self. Science 2002; 296: 301-305. 4. Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immunol 2001; 2: 675-680. 5. 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