V. DETERMINACIÓN DE 4-O-ß-D-GALACTOPIRANOSIL-DFRUCTOFURANOSA (LACTULOSA) Y 5-(HIDROXIMETIL)-2-FURALDEHÍDO (HMF) EN LECHES UHT COMERCIALES COLOMBIANAS POR ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE Maite Rada-Mendoza1*, Sandra P. Rojas2 y Marisol Salazar3 1 Departamento de Química, Grupo de Investigación BICAMSA, Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y de la Educación. Universidad del Cauca. Calle 5 No. 4-70. Sector Tulcán. Popayán, Colombia. 2-8209800 1* mrada@unicauca.edu.co RESUMEN En este estudio se implementó la técnica de espectrofotometría UV-Vis para determinar la concentración de Lactulosa y HMF en 21 diferentes tipos de leches UHT colombianas con diferentes contenidos de grasa y enriquecidas con vitaminas, minerales, fibra y deslactosadas, disponibles comercialmente; se encontraron niveles de HMF entre 4,3 y 27,8 mg/10mL y de Lactulosa entre 7 y 68 mg/10mL. Las leches deslactosadas mostraron los más bajos niveles de HMF y Lactulosa y las enriquecidas con minerales las mayores. Estas leches también fueron caracterizadas fisicoquímica y microbiológicamente; los valores obtenidos estuvieron de acuerdo con lo reportado por el Ministerio de Salud y por tanto, son aptas para el consumo humano. Palabras clave: control de calidad, hidroximetilfurfural, lactulosa, leches enriquecidas, parámetros fisicoquímicos y microbiológicos I. INTRODUCCIÓN La leche es el líquido segregado por la glándula mamaria, producto del ordeño ininterrumpido de animales sanos, que se realiza ocho días después del parto (Gaviria y Bernal 1993); contiene componentes únicos que la hacen imprescindible para una correcta nutrición, tales como agua, proteínas, carbohidratos, lípidos, vitaminas y minerales, en una proporción que varía de acuerdo a factores tales como raza, alimentación, época de lactancia ó del año, entre otros. El constituyente más característico y que la distingue de cualquier otro alimento es el azúcar lactosa (4-O-β-D-galactopiranosil-Dglucopiranosa) (Badui 1989). Dada su composición, la leche no sólo es un excelente alimento para el hombre sino también un caldo de cultivo ideal para bacterias y otros microorganismos; por ello, se hace necesario asegurar que la leche vendida para el consumo humano sea un producto íntegro que conserve bien su calidad. Para lograr esto, se deben desarrollar sistemas de manejo y procesado que destruyan todos los microorganismos patógenos y prolonguen la vida útil del producto; el método más eficaz es el tratamiento térmico (pasteurización, ultrapasteurización (UHT) y esterilización) (Garza 1998). A pesar de que los tratamientos térmicos son necesarios para garantizar una leche de óptima calidad, tienen como desventaja que pueden ocasionar una serie de modificaciones en los componentes de la misma; así, por ejemplo la lactosa, carbohidrato predominante en la leche de vaca (4-6%), es propensa a sufrir alteraciones como consecuencia del calentamiento, tales como: isomerización mediante la transformación Lobry de Bruyn-Alberda Van Ekenstein (Berg 1993), reacción con grupos aldehídicos ó aminados (reacción de Maillard) (Morales y col. 1997), descomposición con formación de ácidos orgánicos (fórmico, láctico, acético, pirúvico y propiónico) (Badui 1989), etc., que disminuyen el valor nutritivo de la leche. El HMF y la Lactulosa son reconocidos indicadores de tratamiento térmico y han sido determinados en una gran variedad de alimentos sometidos a procesos de calentamiento ó almacenamiento inapropiado y prolongado tales como leche y productos lácteos (Boekel 1998; Akalin y Gönç 1997; Rada-Mendoza y col. 2002), miel (Sanz y col. 2003; Viñas y col. 1992), jugos de frutas (Blanco y col. 1991), alimentos infantiles (Chávez-Servín y col. 2006; Rada-Mendoza y col. 2002, 2004), cerveza (Bravo y col. 2002), entre otros; dentro de estos, los productos lácteos son muy susceptibles al pardeamiento no enzimático durante los tratamientos térmicos a los que se someten, debido a su alto contenido de lactosa y lisina; a pesar de que la lactosa es un reductor débil, puede interaccionar con la lisina presente en las proteínas de la leche durante el almacenamiento por varios días (Valero y col. 2001). Los métodos empleados para la determinación de HMF y Lactulosa, han incluido desde técnicas colorimétricas y espectrofotométricas como también polarográficas y cromatográficas (Bonvehi 2000; De Rafael y col. 1996). Para establecer si una leche es apta para el consumo humano y que su composición es genuina, es necesario verificar su calidad mediante una caracterización fisicoquímica y microbiológica; los valores obtenidos deberán estar de acuerdo con las normas y procedimientos reglamentarios de la industria de alimentos (Decreto 476 de 1998); cualquier discrepancia en los resultados, pondrá al descubierto posibles alteraciones, adulteraciones ó fraudes (Veisseyre 1980). El objetivo de este trabajo, es presentar los valores obtenidos de la caracterización fisicoquímica y microbiológica de las leches UHT comerciales colombianas analizadas, y las concentraciones de HMF y Lactulosa, con el fin de establecer si son aptas para el consumo humano y proporcionan el nivel de nutrientes necesarios. II. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1 Muestras. Fueron adquiridas en supermercados de la ciudad de Popayán de forma aleatoria y con fechas de vencimiento entre 5 y 6 meses. Se seleccionaron 21 tipos de leches en envases Tetrapak: Enteras, semi-descremadas y descremadas, enriquecidas con vitaminas y minerales, fibra, deslactosadas y deslactosadas enriquecidas con vitaminas y minerales. 2.4 Condiciones experimentales de la estandarización del método espectrofotométrico UV-Vis. Inicialmente se llevó a cabo la calibración del espectrofotómetro con una solución de dicromato de potasio, midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 373 nm. Para la elección de la longitud de onda, se prepararon soluciones patrón de HMF de 0,3, 0,9, 1,2 y 1,5 mg/mL y de Lactulosa de 3 y 15 mg/mL. 2.5 Método de cuantificación. 2.2 Preparación de las muestras. Ya adquiridas, se envasaron en frascos de vidrio y se refrigeraron en nevera a 5 ºC, para llevar a cabo las pruebas de caracterización, determinación y cuantificación de HMF y Lactulosa. 2.3 Caracterización microbiológica y fisicoquímicas. Se siguió la metodología descrita en los Métodos Oficiales de Análisis de la AOAC Internacional (AOAC 2003), la cual fue implementada y estandarizada en el departamento de Química de la Universidad del Cauca. Cada ensayo se realizó por triplicado. De los parámetros microbiológicos, se determinó la Reductasa y Fosfatasa; de los Parámetros fisicoquímicos se determinó la Acidez, Densidad, Grasa, Extracto seco (ES), Extracto seco desengrasado (ESD), pH, Cenizas y Proteína. Se realizó utilizando una curva de calibración por el método de los mínimos cuadrados, preparada con patrones de HMF de concentración entre 0,039 y 0,232 mg/mL y de Lactulosa entre 0,07 y 1 mg/mL. Se graficó la absorbancia versus la concentración de las soluciones patrón. La concentración del analito en las muestras de leche, se determinó a partir de su absorbancia. 2.6 Estandarización analítico. del método Se determinaron los parámetros que servirán como criterio de confianza del método analítico tales como: linealidad, precisión, sensibilidad y exactitud. 2.7 Extracción y análisis espectro fotométrico de HMF. Se midieron 2 mL de leche y aforaron a 25 mL con agua destilada. En un tubo para centrifugar, se adicionaron 5 mL de la solución anterior y 0,5 mL de la solución de Carrez I (ferrocianuro de potasio trihidratado al 15%) y 0,5 mL de la solución de Carrez II (sulfato de zinc heptahidratado al 14,4%). La mezcla se agitó en un vortex durante 5 minutos y fue centrifugada a 4000 rpm durante 20 minutos. Transcurrido este tiempo, se tomó 1 mL del sobrenadante y se aforó a 10 mL con agua destilada. Finalmente, se midió la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro UV-Vis. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado y utilizando un blanco de reactivos. 2.8 Extracción y análisis espectrofotométrico de Lactulosa. Se tomó 1 mL de la muestra con pipeta volumétrica y se aforó a 10 mL con metanol. A continuación, la disolución se transvasó rápidamente a un tubo de ensayo, se agitó en un vortex durante 1 minuto y se dejó en reposo en la nevera hasta el día siguiente para evitar la volatilización del metanol y precipitar la proteína. De esta muestra se tomó una alícuota de 0,2mL, la cual se colocó a ebullición y una vez fría se le adicionó ácido acético glacial. Finalmente, se midió la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro UV-Vis. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado y utilizando un blanco de reactivos. 2.9 Prueba de estabilidad. Se prepararon soluciones patrón de HMF de concentración 0,039, 0,051 y 0,065 mg/mL y una muestra de leche (PEFeV) y patrones de Lactulosa de concentración 0,07, 0,1 y 0,3 mg/mL y una muestra de leche (ApSCaV). Se guardaron en la nevera durante 10 días y cada día se realizó la lectura de la absorbancia. 2.10 Tratamiento estadístico. Se utilizó el programa SPSS versión 10. Se calcularon además las desviaciones estándar y coeficientes de variación para cada análisis. III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 Caracterización microbiológica. En la tabla 1 se muestran los parámetros microbiológicos analizados para las leches. Como se observa, los resultados no mostraron diferencias estadísticas significativas (p0,01). Las pruebas de reductasa y fosfatasa demostraron que las leches analizadas están exentas de microorganismos contaminantes, es decir, fueron calentadas mediante adecuados procesos de ultra-pasteurización, y por tanto, son leches de primera calidad, aptas para consumo humano ó para ser empleadas como materia prima de derivados lácteos; adicionalmente, cumplen con la normativa del Ministerio de Salud (Ministerio de Salud 1998). Tabla 1. Fosfatasa y reductasa en leches UHT comerciales. Determinaciones por triplicado. Muestra ALE CEV PEFeV PSOV PS CSV APSV APSMV APSCaV SFS CDV ALDF APD APDF SFSD PSD ALSDF APSD CSDV PDD APDD Reductasa (Horas) Leche entera 7 7 7 Leche semi-descremada 7 7 7 7 7 7 7 Leche descremada 7 7 7 7 Leche deslactosada 7 7 7 7 7 7 7 3.2 Caracterización fisicoquímica. En la tabla 2 se detallan los resultados de los parámetros de densidad, acidez y pH. Todas las leches analizadas, presentaron valores de densidad y acidez acordes a la norma (Ministerio de Salud 1998). Los valores de densidad, mostraron diferencias significativas (p0,01). El pH y la acidez (Lozano 1988) determinada, constituyen la acidez Fosfatasa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa natural, debida a la presencia de fosfatos ácidos, caseína, CO2 disuelto y citratos ácidos. Esto demuestra que las leches están libres de la acción de microorganismos (ej. Streptococcus lácticos) y que no ha habido falsificación ó adulteración. Como se esperaba, a medida que el contenido graso disminuyó, la densidad de las muestras de leche, aumentó. Tabla 2. Densidad (g/mL), acidez (%) y pH en leches UHT comerciales. Datos promedio (± desviación estándar) de determinaciones por triplicado. Muestra ALE CEV PEFeV PSOV PS CSV APSV APSMV APSCaV SFS CDV ALDF APD APDF SFSD PSD ALSDF APSD CSDV PDD APDD Densidad Acidez (g/mL) (%) Leches enteras 1,030a ± 0,000 0,15a ± 0,00 a 1,033 ± 0,000 0,14a ± 0,00 1,032a ± 0,000 0,15a ± 0,00 Leches semi-descremadas 1,032a ± 0,000 0,15a ± 0,00 1,032a ± 0,000 0,15a ± 0,00 a 1,033 ± 0,000 0,14a ± 0,00 1,034a ± 0,001 0,15a ± 0,00 a 1,034 ± 0,000 0,15a ± 0,00 a 1,033 ± 0,000 0,15a ± 0,00 1,032a ± 0,001 0,14a ± 0,00 Leches descremadas 1,034a ± 0,000 0,14a ± 0,00 1,034a ± 0,000 0,15a ± 0,00 b 1,035 ± 0,000 0,15a ± 0,00 b 1,036 ± 0,000 0,14a ± 0,00 Leches deslactosadas 1,032a ± 0,000 0,15a ± 0,00 a 1,034 ± 0,000 0,14a ± 0,00 1,034a ± 0,000 0,15a ± 0,00 a 1,034 ± 0,000 0,15a ± 0,00 a 1,034 ± 0,000 0,14a ± 0,00 1,034a ± 0,001 0,15a ± 0,00 b 1,035 ± 0,000 0,15a ± 0,00 En la tabla 3, se resumen los valores obtenidos para ceniza, proteína, grasa, extracto seco y extracto seco desengrasado. Teniendo en cuenta que los minerales representan alrededor del 0,6-0,8% del peso de la leche (Lozano 1988), se encontró un contenido dentro de éste rango, siendo significativos los pH 6,5a ± 0,0 6,7a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,6a ± 0,1 6,6a ± 0,0 6,7a ± 0,1 6,5a ± 0,0 6,5a ± 0,0 6,5a ± 0,0 6,5a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,5a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,6a ± 0,0 6,5a ± 0,0 6,5a ± 0,0 hallados en las leches enriquecidas con Fe, Ca y Zn (APSMV y APSCaV), que se encuentran en forma de cloruros, fosfatos y citratos tanto en estado coloidal como en solución (Veisseyre 1980). La proteína calculada estuvo muy por debajo (2,4-2,7%) de los valores referenciados por otros autores (Cheftel 2000); esto puede deberse a que al ser las proteínas sensibles a la acción del calor, se desnaturalizan a temperaturas de ultra-pasteurización. Los contenidos de grasa presentaron valores dentro de lo reglamentado (Ministerio de Salud 1998). Al aplicar la fórmula de Richmond, se encontró que las leches contienen los valores mínimos exigidos de ES y ESD (Ministerio de Salud 1998). Tabla 3. Ceniza, proteína, grasa, extracto seco (ES) y extracto seco desengrasado (ESD) (%) en leches UHT comerciales. Datos promedio (± desviación estándar) de determinaciones por triplicado. Muestra Ceniza Proteína Grasa ES ESD (%) (%) (%) (%) (%) 11,8c ± 0,1 12,1c ± 0,1 11,7c ± 0,5 8,3a ± 0,0 9,0a ± 0,0 8,7a ± 0,0 10,3b ± 0,0 10,1b ± 0,0 10,3b ± 0,1 10,7b ± 0,1 10,8b ± 0,0 10,7b ± 0,1 10,2b ± 0,1 8,5a ± 0,0 8,5a ± 0,0 8,7a ± 0,0 8,9a ± 0,1 9,0a ± 0,0 8,8a ± 0,0 8,6a ± 0,1 8,6a ± 0,0 8,9a ± 0,0 9,0a ± 0,0 9,3a ± 0,0 8,6a ± 0,0 8,7a ± 0,0 8,9a ± 0,0 9,2b ± 0,0 10,7b ± 0,1 10,6b ± 0,1 10,8b ± 0,1 10,8b ± 0,1 10,8b ± 0,1 8,8a ± 0,1 8,9a ± 0,0 8,7a ± 0,0 9,0a ± 0,0 9,0a ± 0,0 9,0a ± 0,0 9,0a ± 0,0 8,7a ± 0,1 8,9a ± 0,0 c ALE CEV PEFeV 0,73 ± 0,01 0,75c ± 0,01 0,71c ± 0,01 PSOV PS CSV APSV APSMV APSCaV SFS 0,75c ± 0,02 0,76c ± 0,04 0,75c ± 0,01 0,76c ± 0,01 0,79b ± 0,00 0,81b ± 0,01 0,72c ± 0,00 CDV ALDF APD APDF 0,71c ± 0,01 0,78c ± 0,02 0,77c ± 0,01 0,75c ± 0,01 SFSD PSD ALSDF APSD CSDV PDD APDD 0,64a ± 0,01 0,73c ± 0,02 0,72c ± 0,02 0,74c ± 0,01 0,72c ± 0,01 0,76c ± 0,02 0,74c ± 0,00 Leche entera 2,4 ± 0,1 3,5c ± 0,1 2,6a ± 0,1 3,1c ± 0,1 a 2,6 ± 0,0 3,0c ± 0,1 Leche semi-descremada 2,6a ± 0,1 1,8b ± 0,0 a 2,5 ± 0,1 1,6b ± 0,0 a 2,6 ± 0,1 1,6b ± 0,1 2,6a ± 0,1 1,8b ± 0,1 a 2,7 ± 0,0 1,8b ± 0,0 2,6a ± 0,0 1,9b ± 0,1 a 2,4 ± 0,0 1,6b ± 0,1 Leche descremads 2,6a ± 0,1 0,0a ± 0,0 a 2,6 ± 0,1 0,2a ± 0,0 a 2,7 ± 0,1 0,1a ± 0,0 2,6a ± 0,0 0,1a ± 0,0 Leche deslactosada 2,7a ± 0,1 2,0b ± 0,1 2,5a ± 0,1 1,6b ± 0,1 a 2,6 ± 0,1 1,8b ± 0,1 a 2,6 ± 0,0 1,8b ± 0,1 2,6a ± 0,1 1,8b ± 0,1 a 2,5 ± 0,1 0,1a ± 0,0 a 0,0a ± 0,0 2,7 ± 0,0 a 3.3 Estandarización del método espectrofotométrico UV-Vis para determinar HMF y Lactulosa. Se obtuvo un máximo pico de absorción a 285 nm para el HMF y de 425 nm para Lactulosa. Las curvas de calibración construidas se usaron para determinar las concentraciones de HMF y Lactulosa en las muestras de leche y las ecuaciones obtenidas fueron: Y=3,916X-0,0105 (r de 0,9965) Y=0,0483X-0,0023 (r de 0,9992) respectivamente, demostrando así, la linealidad de los métodos. La repetitividad del método y del sistema completo mostró valores inferiores a: 5,10 y 0,38% para patrones de HMF y de 8,3 y 9% para patrones de Lactulosa; para la muestra PEFeV, mostró valores inferiores a 4,17 y 0,08% y para APSCaV fue de 0,0%. El límite de detección para HMF fue de 0,011 mg/mL y para Lactulosa de 0,015mg/mL; el límite de cuantificación fue 0,036 mg/mL para HMF y de 0,049 mg/mL para Lactulosa. En el cálculo de la exactitud, los porcentajes de recuperación estuvieron alrededor del 91% para HMF y de 93% para Lactulosa. 3.4 Cuantificación Lactulosa. de HMF y En la tabla 4 se muestran los valores correspondientes a la determinación de HMF y Lactulosa. La variación encontrada en los valores, puede deberse a las diferentes condiciones de higienización (UHT, 132ºC, 5 s), a los cuales se someten las leches en las diferentes industrias lácteas colombianas, y a su posterior período y condiciones de almacenamiento. De acuerdo a los resultados mostrados en la tabla 4, el contenido de HMF y Lactulosa no está influenciado por la composición en cuanto a materia grasa se refiere; esta conclusión es similar a la propuesta por Berg en 1993 quien concluyó que los valores de grasa entre 0,01 y 4,5%, no tienen un efecto significativo sobre las reacciones de degradación de la lactosa. Las leches deslactosadas mostraron los más bajos niveles de HMF y Lactulosa, posiblemente debido a su contenido de lactosa hidrolizada y en mínima cantidad, que limita las reacciones de degradación. Las leches PEFeV y APSMV, presentaron contenidos altos de HMF y Lactulosa, debido a que generalmente la fortificación con Fe se realiza con sales férricas que requieren un aumento alrededor de 10 ºC más (142 ºC) en la temperatura de ultra-pasteurización y es precisamente este aumento, el que ocasiona una mayor producción de ambos indicadores, en comparación con las que no han sido adicionadas con este mineral. La leche APSCaV, también presentó un alto contenido, ya que la fortificación de los alimentos con Ca se realiza con fosfatos de Ca di y tribásico y carbonatos; sin embargo, el uso de estos cationes divalentes en alimentos, puede crear problemas de estabilidad en las proteínas (Chávez-Servín y col. 2006), principalmente en las caseínas, y por tanto, los residuos de aminoácidos como la lisina, podrían fácilmente reaccionar con la lactosa para formar HMF en mayor proporción. La adición de vitaminas no presentó influencia en el contenido de HMF ni de Lactulosa, debido a que éstas constan de estructuras químicas terpénicas y anillos heterocíclicos, piridoxínicos y piridínicos, que no están involucradas en las reacciones degradación de la lactosa. de Tabla 4. Hidroximetilfurfural (mg/10mL) en leches UHT comerciales. Datos promedio (± desviación estándar) de determinaciones por triplicado. Muestra ALE CEV PEFeV PSOV PS CSV APSV APSMV APSCaV SFS CDV ALDF APD APDF SFSD PSD ALSDF APSD CSDV PDD APDD HMF Lactulosa (mg/10mL) (mg/10mL) Leche entera 13,6c ± 0,2 13,6c ± 0,2 27,8g ± 0,0 Leche semi-descremada 10,4b ± 0,1 10,3b ± 0,1 13,5c ± 0,1 20,1d ± 0,1 25,0f ± 0,1 21,0e ± 0,2 13,7c ± 0,1 Leche descremada 13,6c ± 0,1 13,6c ± 0,0 20,1d ± 0,1 10,4b ± 0,1 Leche deslactosada 4,4a ± 0,1 4,5a ± 0,1 4,3a ± 0,1 4,4a ± 0,1 4,3a ± 0,1 4,5a ± 0,2 4,4a ± 0,2 17e ± 0,0 13d ± 0,0 17e ± 0,0 11c ± 0,0 7a ± 0,0 16e ± 0,1 15e ± 0,0 32g ± 0,0 19f ± 0,0 11c ± 0,0 11c ± 0,0 19f ± 0,1 9b ± 0,0 68h ± 0,4 11c ± 0,0 9b ± 0,0 9b ± 0,0 9b ± 0,0 7a ± 0,0 9b ± 0,0 9b ± 0,0 Letras diferentes en una misma columna, indican diferencias significativas (p0,01) 3.5 Estabilidad. Las pruebas de estabilidad demostraron que la determinación de HMF y Lactulosa es estable hasta 3 días. IV. CONCLUSIONES Los valores tan elevados obtenidos de HMF libre y de Lactulosa de las leches UHT colombianas comparadas con las de otros países (Berg 1993), nos llevan a pensar que los tratamientos térmicos a los que se someten las leches son muy severos, para contrarrestar la menor calidad microbiológica de la leche cruda adquirida como materia prima para procesamiento; los procedimientos en Colombia, podrían estar careciendo de un estricto control de calidad y a que el almacenamiento es prolongado y a temperaturas y condiciones inadecuadas; todo lo anterior ocasiona la pérdida de proteínas, de vitaminas y otros componentes y afecta gravemente la calidad nutricional de la leche, a través de la destrucción de aminoácidos esenciales, producción de compuestos anti-nutritivos y tóxicos, y cambios organolépticos y funcionales, lo que obliga a la industria láctea, a realizar grandes inversiones para elaborar constantemente leches fortificadas. Uno de los efectos más negativos del HMF, es la alteración de la calidad proteica de la leche, en especial si este producto se emplea para elaborar fórmulas infantiles para la alimentación de lactantes, pues a menudo constituye la única fuente de proteínas, en una época en que el requerimiento de aminoácidos esenciales como la lisina es muy alto. Finalmente, es importante tener en cuenta que durante la fortificación de los alimentos, se requiere conocer muy bien los efectos físicos y químicos que el nutrimento puede tener sobre ellos; por eso, antes de efectuar cualquier adición, se deben determinar perfectamente las condiciones de procesamiento y almacenamiento al que va a ser sometido el producto, las necesidades del consumidor y el tipo de alimento. De esta manera se evita en mayor proporción, que ocurran reacciones secundarias (como las de pardeamiento no enzimático) en un alimento tan susceptible como la leche, con la posterior formación de productos indeseables (como en éste caso el HMF), que reducen drásticamente el valor nutritivo de dicho alimento. V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Akalin AS, Gönç S. (1997). Lactulose and 5HMF contents in market milks. Milchwissenschaft. 52 (7), 377-380 AOAC. (2003), Association of Official Analytical Chemists, Official Methods of Analysis of AOAC Internacional (AOAC), 17th Ed. Maryland Badui S. (1989), Química de los alimentos, 1 ed. México, Editorial Alambra, p. 41-64, 376, 380-386, 392-396. Berg H. (1993), Reactions of lactose during heat treatment of milk: A quantitative study, Ph.D. Thesis, Agricultural University, Wageningen, p.105-106, 112. Blanco, D., Gutiérrez, M.D., Sopeña, L., Mangas, J.J. (1991). 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