DIA 2 - Universidad de Cuenca

UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
RESUMEN
VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN
DE PLOMO Y CADMIO POR ESPECTROFOTOMETRIA DE
ABSORCIÓN ATÓMICA PARA EL CENTRO DE SERVICIO
DE ANÁLISIS DE MINERALES “CESEMIN”.
Mediante este estudio se pretende realizar la validación del
método por absorción atómica para el plomo y cadmio ya
que el mismo es necesario para el Laboratorio de Análisis
“Cesemin” cuya
necesidad es contar con un método
validado para ofrecer un servicio de análisis confiables a sus
clientes actuales y potenciales los mismos que servirán para
que el laboratorio solicite su acreditación, obteniendo una
variación dentro de un rango aceptable durante la
determinación correspondiente.
Como parte de la validación es indispensable introducir
la incertidumbre en la medida para lo cual se desarrollará
todo el proceso de cálculo y determinación. También se
realizará una investigación sobre el método que el laboratorio
lo está desarrollando hasta llegar a determinar el mas
adecuado en función del equipamiento que se dispone. El
método a ser validado es para determinación de Plomo y
Cadmio.
Un factor importante en base a esta validación es
conseguir un tiempo óptimo de desarrollo en el análisis
beneficiándose de manera directa a la comunidad y a la
empresa como tal. Este desarrollo no conlleva
consecuencias éticas, morales sino se dará paso a una
validación que sea respetuosa con el medio ambiente.
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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Palabras Claves: Validación, Anova, Espectrofotometría
Absorción Atómica, Incertidumbre.
INDICE
RESUMEN………………………………………………………..1
INTRODUCCIÓN……………………………………………….14
CAPITULO 1. GENERALIDADES
1.1 CARACTERRISTICAS PRINCIPALES DEL CADMIO Y
PLOMO.
1.1.1 CADMIO……………………………………….………….16
1.1.1.1 Obtención.
1.1.1.2 Características.
1.1.1.3 Uso y fuentes de Exposición.
1.1.1.4 Toxicidad del cadmio.
1.1.2 PLOMO………………………………………….………..18
1.1.2.1 Obtención.
1.1.2.2 Características.
1.1.2.3 Toxicidad del plomo.
1.2 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA.
1.2.1 DESCRIPCION DE LA TÉCNICA DE ABSORCION
ATOMICA.………………………………………………………21
1.2.1.1 Instrumentación de absorción atómica.
1.2.1.2 Lámpara de Descarga sin electrodos.
1.2.1.3 Nebulizador.
1.2.2 ANALISIS DE LA CURVA DE CALIBRACION.........24
1.2.2.1 Sensividad.
1.2.2.2 Limite de Detección.
1.2.2.3 Rango de Trabajo.
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1.2.3 SELECCIÓN DEL NUMERO DE ESTANDARES PARA
LA CALIBRACION……………………………………………..26
1.2.4 INTERFERENCIAS EN ABSORCION ATOMICA…...28
1.2.4.1 Interferencia Química.
1.2.4.2 Interferencias por ionización.
1.2.4.3 Interferencias de la matriz.
1.2.4.4 Formación de compuestos poco volátiles.
CAPITULO 2. VALIDACION DE METODOS ANALITICOS
2.1 DEFINICIONES……………………………..……………..31
2.2 MÉTODO DE VALIDACIÓN……………………………..37
2.2.1 Normas Básicas para la Validación.
2.2.2 Principio de la validación.
2.2.3 Alcance de la validación.
2.2.4 Objetivo de la validación.
2.3 PROCESO DE VALIDACIÓN…………………………….39
2.4 DESCRIPCION……………………………………………..40
2.4.1 Necesidad Analítica. Método
2.4.2 Puesta a Punto.
2.4.3 Diseño Experimental y Estadístico
2.4.4 Ensayos. Tratamiento Estadístico de datos
obtenidos
2.4.5 Parámetros a determinar y Tratamiento Estadístico.
2.5 EVALUACIÓN DE LOS PARAMETROS………………47
2.5.1 Función de respuesta / linealidad / sensibilidad
2.5.2 Función de respuesta instrumental
2.5.3 Función de respuesta del método.
2.5.4 Selectividad / especificidad.
2.5.5 Precisión.
2.5.6 Análisis de la Varianza (ANOVA).
2.5.7 Exactitud.
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2.5.8 Límite de Cuantificación.
2.5.9 Límite de detección (del método).
2.5.10 Método de comparación Señal/Ruido.
2.5.11 Incertidumbre
2.5.11.1 Clasificación de la Incertidumbre.
2.5.11.2 Posibles Causas de Incertidumbre.
2.4.6.12 Robustez.
2.6 INTERVALO DE TRABAJO VALIDADO………………..62
2.7 DECLARACIÓN DEL MÉTODO VALIDADO…………...62
2.8 CONTROL DEL MÉTODO. REVALIDACIÓN….……...63
CAPITULO 3. PROCEDIMIENTO ESPECÍFICO
ENSAYO PARA ANÁLISIS DE MINERALES
DE
3.1 CADMIO.
1. OBJETO………………………………………………………65
2. ALCANCE…………………………………….………………65
2.1 Intervalo de Trabajo
2.2 Lavado de Cristalería
3. REFERENCIAS…………………..…………………………..65
3.1 Documento utilizados en la Elaboración
3.2 Documentos a utilizar conjuntamente
4. GENERAL……………………………….……………………66
5. DESCRIPCION…………………………………...………….66
5.1 Equipos y materiales
5.2 Reactivos
5.3 Preparación
5.4 Realización
5.5 Tratamiento de los resultados
5.5.1 Criterio de aceptación y rechazo
5.5.2 Cálculo de la incertidumbre
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5.6 Medidas de Seguridad
6. FIJACION DE OBJETIVOS. PARAMETROS DE
VALIDACIÓN...…………………………………………………69
7. ESQUEMA DEL DISEÑO EXPERIMENTAL……………..70
8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS………72
8.1 Condiciones Instrumentales para la lectura de Cadmio:
8.2 Curvas de Calibración para Cadmio:
8.3 Cálculo del ANOVA
8.3.1 ANOVA del Blanco
8.3.2 ANOVA del Patrón
3.2 PLOMO.
1. OBJETO……………………………………………………....80
2. ALCANCE…………………………………………………….80
2.1 Intervalo de trabajo
2.2 Lavado de cristalería
3. REFERENCIAS………………………………………………80
3.1. Documentos utilizados en la elaboración
3.2. Documentos a utilizar conjuntamente
4. GENERAL…………………………………………………….81
5. DESCRIPCION……………………………………………….81
5.1 Equipos y materiales
5.2 Reactivos
5.3Preparación
5.3.1 Preparación de la curva de calibración
5.4 Realización
5.5Tratamiento de los resultados
5.5.1Criterio de aceptación y rechazo
5.5.2Cálculo de la incertidumbre
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5.6 Medidas de Seguridad
6. FIJACION DE OBJETIVOS. PARAMETROS DE
VALIDACIÓN…………………………………………………...84
7. ESQUEMA DEL DISEÑO EXPERIMENTAL……………..85
8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS………87
8.1 Condiciones Instrumentales para la lectura de Cadmio:
8.2 Curvas de Calibración para Cadmio:
8.3 Cálculo del ANOVA
8.3.1 ANOVA del Blanco
8.3.2 ANOVA del Patrón
CAPITULO 4. PROCEDIMIENTO
ENSAYO PARA ANALISIS DE AGUA
ESPECÍFICO
DE
4.1 CADMIO.
1. OBJETO………………………………………………………96
2. ALCANCE…………………………………………………….96
2.1 Intervalo de Trabajo
2.2 Lavado de Cristalería
3. REFERENCIAS………………. ……………………..………96
3.1 Documento utilizados en la Elaboración
3.2 Documentos a utilizar conjuntamente
4. GENERAL…………………………………………………….97
5. DESCRIPCION…………………………………...................97
5.1 Equipos y materiales
5.2 Reactivos
5.3 Preparación
5.4 Realización
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5.5 Tratamiento de los resultados
5.5.1 Criterio de aceptación y rechazo
5.5.2 Cálculo de la incertidumbre
5.6 Medidas de Seguridad
6. FIJACION DE OBJETIVOS. PARAMETROS DE
VALIDACIÓN………………………………………………….101
7. ESQUEMA DEL DISEÑO EXPERIMENTAL……………102
8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS……..104
8.1 Condiciones Instrumentales para la lectura de Cadmio:
8.2 Curvas de Calibración para Cadmio:
8.3 Cálculo del ANOVA
8.3.1 ANOVA del Blanco
8.3.2 ANOVA del Patrón
4.2 PLOMO.
1. OBJETO……………………………………...……......……112
2. ALCANCE………………………………………………..….112
2.1 Intervalo de trabajo
2.2 Lavado de cristalería
3. REFERENCIAS……………………………………………..112
3.1. Documentos utilizados en la elaboración
3.2. Documentos a utilizar conjuntamente
4. GENERAL…………………………………………………...113
5. DESCRIPCION…………………...…………...……………113
5.1 Equipos y materiales
5.2 Reactivos
5.3Preparación
5.3.1 Preparación de la curva de calibración
5.4 Realización
5.5Tratamiento de los resultados
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5.5.1Criterio de aceptación y rechazo
5.5.2Cálculo de la incertidumbre
5.6 Medidas de Seguridad
6. FIJACION DE OBJETIVOS. PARAMETROS DE
VALIDACIÓN…….……………………………………………117
7. ESQUEMA DEL DISEÑO EXPERIMENTAL…….……...118
8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS……..120
8.1 Condiciones Instrumentales para la lectura de Cadmio:
8.2 Curvas de Calibración para Cadmio:
8.3 Cálculo del ANOVA
8.3.1 ANOVA del Blanco
8.3.2 ANOVA del Patrón
CAPITULO 5. CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES……………………………………....129
BIBLIOGRAFIA…………………………………….…….…..139
ANEXOS
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VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN
DE PLOMO Y CADMIO POR ESPECTROFOTOMETRIA DE
ABSORCIÓN ATÓMICA PARA EL CENTRO DE SERVICIO
DE ANÁLISIS DE MINERALES “CESEMIN”.
TESIS PREVIA A LA
OBTENCIÓN
DEL TÍTULO
DE INGENIERO QUÍMICO
Director: Ing. Rubén Auquilla
Asesora: Ing. Maritza Flores
Juana Monserrath Méndez Alvarez
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Cuenca - Ecuador
Noviembre de 2008
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DEDICATORIA
Con inmensa gratitud, este trabajo
va dedicado a nuestros PADRES;
por el apoyo incondicional
que
nos fue brindado día tras día, ya
que sin ellos no hubiéramos logrado
realizar nuestras metas.
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, queremos agradecer a nuestro director
de tesis Ing. Rubén Auquilla, por su dedicación y entrega en
cada momento en que lo hemos necesitado.
En segundo lugar, a la Ing. Maritza Flores por ser
nuestra guía incondicional en todo el trabajo realizado.
Un
especial
Laboratorio
reconocimiento
“Cesemin”,
Ing.
a
Catalina
la
directora
del
Peñaherrera
por
encaminarnos en nuestro objetivo principal.
Por último al personal docente de la Escuela de
Ingeniería Química, por los conocimientos compartidos para
con nosotros, y a todas aquellas personas que de una u otra
manera nos apoyaron y acompañaron todo el tiempo.
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OBJETIVO GENERAL
Validar el Métodos para la Determinación de Pb y Cd
en Agua y Minerales por Espectrofotometría
de Absorción Atómica.
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OBJETIVOS ESPECIFICOS
•
Determinar
la
sistemática
de
análisis
para
la
determinación de Plomo y Cadmio en agua y minerales
por absorción atómica.
•
Contar con un método validado para el laboratorio
“Cesemín” para la determinación de Plomo y Cadmio
por absorción atómica y establecer los parámetros
críticos.
•
Obtener la incertidumbre para cada uno de los métodos.
•
Determinación del Límite de Cuantificación (LC) y el
Límite de Detección (LD)
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INTRODUCCION
Mediante este estudio se pretende realizar la validación
del método por absorción atómica para el plomo y cadmio ya
que el mismo es necesario para el Laboratorio de Análisis
“Cesemin” cuya
necesidad es contar con un método
validado para ofrecer un servicio de análisis confiables a sus
clientes actuales y potenciales los mismos que servirán para
que el laboratorio solicite su acreditación, obteniendo una
variación dentro de un rango aceptable durante la
determinación correspondiente.
Como parte de la validación es indispensable introducir
la incertidumbre en la medida para lo cual se desarrollará
todo el proceso de cálculo y determinación. También se
realizará una investigación sobre el método que el laboratorio
lo está desarrollando hasta llegar a determinar el mas
adecuado en función del equipamiento que se dispone. El
método a ser validado es para determinación de Plomo y
Cadmio.
Un factor importante en base a esta validación es
conseguir un tiempo óptimo de desarrollo en el análisis
beneficiándose de manera directa a la comunidad y a la
empresa como tal. Este desarrollo no conlleva
consecuencias éticas, morales sino se dará paso a una
validación que sea respetuosa con el medio ambiente.
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CAPÍTULO 1
GENERALIDADES
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GENERALIDADES
1. Características principales del cadmio y plomo.
1.1 CADMIO.
Se encuentra en la naturaleza en pequeñas cantidades,
al estado de sulfuro. También se encuentra en casi todos l os
minerales de zinc. El principal uso del cadmio es en
galvanoplastia, el aire húmedo lo oxida superficialmente poco
a poco; reacciona fácilmente con los ácidos minerales y más
lentamente con los ácidos orgánicos es insoluble en los
hidróxidos alcalinos.
1.1.1 Obtención.
Es un elemento escaso en la corteza terrestre. Las
minas de cadmio son difíciles de encontrar, y suelen estar en
pequeñas cantidades. Se obtiene generalmente como
subproducto; el cadmio se separa del zinc precipitándolo con
sulfatos o mediante destilación. La greenockita (sulfuro de
cadmio), es el único mineral de cadmio y no es una fuente
comercial de metal. Casi todo el que se produce es obtenido
como subproducto de la fundición y refinamiento de los
minerales de zinc, los cuales por lo general contienen de 0.2
a 0.4%.
1.1.2 Características.
Es un metal electropositivo relativamente raro, símbolo
Cd, número atómico 48; el cadmio es miembro del grupo IIb
(zinc, cadmio y mercurio) en la tabla periódica.
Es un metal blando y dúctil, de color blanco argentino
con un ligero matiz azulado. Es más blando y maleable que
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el zinc, pero poco más duro que el estaño. Peso atómico de
112.40 y densidad relativa de 8.65 a 20ºC (68ºF). Su punto
de fusión de 320.9ºC (610ºF) y de ebullición de 765ºC
(1410ºF) son inferiores a los del zinc. Hay ocho isótopos
estables en la naturaleza y se han descrito once
radioisótopos inestables de tipo artificial. El cadmio es
divalente en todos sus compuestos estables y su ion es
incoloro.
1.1.3 Uso y fuentes de Exposición.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Industria del cinc y extracción del cadmio a partir de sus
residuos
Cadmiado de metales, realizado por templado o
procedimientos electrolíticos.
Aleaciones con acero, cinc y cobre; fabricación de la
aleación de Wood que sirve para válvulas de extintores
automáticos, cortocircuitos, etc.
Fabricación de electrodos de soldadura
Fabricación de acumuladores eléctricos de cadmioníquel
Uso en la industria atómica para captar el exceso de
electrones
Pigmentos para pinturas
Estabilizante en la industria de los plásticos
Fabricación de células solares
A menudo se halla cadmio como contaminante de los
abonos fosfatados y en las cenizas de incineradores
que se emplean como abono.
El cadmio se halla presente en la alimentación, el humo
de los cigarrillos, el aire atmosférico de las aglomeraciones
urbanas y alrededor de las fábricas.
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1.1.4 Toxicidad del cadmio.1
El cadmio es un metal pesado que produce efectos
tóxicos en los organismos vivos, aun en concentraciones
muy pequeñas. La exposición al cadmio en los humanos se
produce generalmente a través de dos fuentes principales: la
primera es la vía oral y la segunda vía es por inhalación.
Cuando la gente respira el Cadmio este puede dañar
severamente los pulmones. Algunos efectos sobre la salud
que pueden ser causados por el Cadmio son:
•
•
•
•
•
•
•
Diarreas, dolor de estómago y vómitos severos.
Fractura de huesos.
Fallos en la reproducción y posibilidad incluso de
infertilidad.
Daño al sistema nervioso central.
Daño al sistema inmune.
Desordenes psicológicos.
Posible daño en el ADN o desarrollo de cáncer.
1.2 PLOMO.
Es uno de los metales comunes más blandos y más
pesados, tiene poca resistencia mecánica, a lo que se une su
tendencia a fluir y su poca capacidad frente a la fatiga, el uso
más amplio del plomo, como tal, se encuentra en la
fabricación de acumuladores.
Es relativamente resistente al ataque de los ácidos
sulfúrico y clorhídrico. Pero se disuelve con lentitud en ácido
nítrico, en atmósfera húmeda se oxida rápidamente pero solo
de modo superficial.
1
www.wikipedia.org/wiki/cadmio
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1.2.1 Obtención.
Las principales menas de plomo son la galena (PbS)
que contiene 86.4% de plomo y la cerusita PbCO3 que
contiene 77.5% de plomo, una fuente importante de
obtención de plomo son los materiales de desechos
industriales, que se recuperan y funden. También se
encuentra plomo en varios minerales de uranio y de torio.
1.2.2 Características.
El plomo es un metal blanco azulado esta en el grupo
IV del sistema periódico y es miembro del subgrupo que
contiene el germanio y estaño. Tiene un punto de fusión de
328 °C, y un punto de ebullición de 1.740 °C. Su densidad
relativa es de 11,34, y 207,20 su masa atómica. Es flexible,
inelástico, se funde con facilidad a 327.4ºC (621.3ºF). Las
valencias químicas normales son 2 y 4. En presencia de aire,
reacciona lentamente con el agua formando hidróxido de
plomo.
Los compuestos solubles de plomo son venenosos. El
plomo se presenta en la naturaleza en ocho formas
isotópicas (Nombre que se da a cada átomo de un elemento
químico que posee el mismo número atómico, es decir, el
mismo número de electrones y protones, pero distinta masa
atómica, es decir, distinto número de neutrones): cuatro de
ellas son estables y las otras cuatro son radiactivas.
1.2.3 Toxicidad del plomo.2
El plomo es uno de los cuatro metales que tienen un
mayor efecto dañino sobre la salud humana. Este puede
entrar en el cuerpo humano a través de la comida (65%),
agua (20%) y aire (15%).
2
www.wikipedia.org/wiki/plomo
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El Plomo puede causar varios efectos no deseados,
como son:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Perturbación de la biosíntesis de hemoglobina y
anemia.
Incremento de la presión sanguínea.
Daño a los riñones.
Abortos y abortos sutiles.
Perturbación del sistema nervioso.
Daño al cerebro.
Disminución de la fertilidad del hombre a través del
daño en el esperma.
Disminución de las habilidades de aprendizaje de los
niños.
Perturbación en el comportamiento de los niños, como
es
agresión,
comportamiento
impulsivo
e
hipersensibilidad.
2. ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA.
La espectroscopia de absorción atómica (AAS) se basa
en el principio que los átomos libres en estado fundamental
pueden absorber la luz a una cierta longitud de onda. La
absorción es específica, por lo que cada elemento absorbe a
longitudes de onda únicas. AAS es una técnica analítica
aplicable al análisis de trazas de elementos metálicos en
minerales, muestras biológicas, metalúrgicas, farmacéuticas,
aguas, alimentos y de medio ambiente.
El proceso de absorción atómica se ilustra en la
siguiente figura:
FIGURA 1. Proceso de Absorción Atómica
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El estado básico absorbe energía lumínica de una
longitud de onda específica para alcanzar el estado excitado.
Con el número de átomos en la trayectoria lumínica se
incrementa la cantidad de luz absorbida también se
incrementa.
En base a la medición de la cantidad de luz absorbida,
puede realizarse la determinación de la cantidad de analito.
El uso de fuentes luminosas y selección cuidadosa de la
longitud de onda permite la determinación específica de cada
elemento.
2.1 Descripción de la Técnica de la Absorción Atómica.
La técnica de absorción atómica en flama en una forma
concisa consta de lo siguiente: la muestra en forma líquida
es aspirada a través de un tubo capilar y conducido a un
nebulizador donde ésta se desintegra y forma un rocío o
pequeñas gotas de líquido. Las gotas formadas son
conducidas a una flama, donde se produce una serie de
eventos que originan la formación de átomos. Estos átomos
absorben cualitativamente una radiación específica emitida
por la lámpara y la cantidad de radiación absorbida está en
función de su concentración.
La señal de la lámpara una vez que pasa por la flama
llega a un monocromador, que tiene como finalidad el
discriminar todas las señales que acompañan la línea de
interés. Esta señal de radiación electromagnética llega a un
detector o transductor y pasa a un amplificador y por último a
un sistema de lectura.
2.1.1 Instrumentación de absorción atómica.
Estos son cinco de los componentes básicos en
absorción atómica:
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1. La fuente de luz que emite el espectro del elemento de
interés.
2. Una "célula de absorción" en el que los átomos de la
muestra se producen.
3. Un monocromador de dispersión de luz.
4. Un detector que mide la intensidad de la luz y amplifica
la señal.
5. Una pantalla que muestra la lectura después de que
haya sido procesado por el instrumento electrónico.
FIGURA 2. Espectrofotómetro de Absorción Atómica.
La llama preferida para la determinación por absorción
atómica es la de aire-acetileno la cual es utilizada para
analizar aproximadamente 35 elementos. La temperatura de
llama del aire acetileno es aproximadamente 2300ºC. Para
la llama de aire–acetileno, el flujo del acetileno es
aproximadamente 4 litros/min, u 8.5 pies3/h usando un valor
de combustión de calor de 1450 BTU/pie3. El calor emitido
sería aproximadamente 12,300 BTU/h.
2.1.2 Lámpara de Descarga sin electrodos.
La lámpara de descarga sin electrodos se construyen
colocando una pequeña cantidad de una sal del elemento
metálico (generalmente un yoduro), o el elemento metálico
mismo si así es más conveniente, en un recipiente de
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cuarzo, el cual previamente se ha sometido al vacío antes de
sellarse. Posteriormente, esta ampolleta de cuarzo se coloca
dentro de un cilindro de cerámica el cual está acoplado a un
generador de radiofrecuencia.
Cuando la lámpara se enciende se forma un campo de
microondas el cual causa la volatilización y la excitación de
algunos átomos del elemento depositado en la cápsula de
cuarzo de la lámpara y así se forma el haz de radiación del
elemento específico a determinar. La Figura 3 es
esquemática de una lámpara de este tipo.
FIGURA 3. Lámpara de descarga sin electrodos.
2.1.3 Nebulizador.
Cuando una solución de una sal inorgánica se rocía
dentro de una flama de un mechero, una fracción de los
iones metálicos se reduce a su estado elemental y se forman
algunos iones monoatómicos en menor grado.
Consiste en un nebulizador neumático que transforma la
muestra en solución en un aerosol. El tipo de nebulizador
más común es el de tubo concéntrico, donde la muestra se
aspira a través de un tubo capilar mediante un flujo de gas a
alta presión alrededor de la punta del capilar (efecto Venturi).
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Los caudales del oxidante y del combustible constituyen
variables importantes.
El combustible y el oxidante, en general se combinan es
una proporción estequiométrica. Los metales que forman
óxidos estables emplean flamas con exceso de combustible.
FIGURA 4. Nebulizador
2.2 Análisis de la Curva de Calibración.
Se debe revisar tres parámetros que definen la curva de
calibración que nos ayudan a saber la forma adecuada de
utilizar este gráfico, estos son:
•
•
•
Sensividad (S)
Limite de Detección (LD)
Rango de Trabajo (RT)
2.2.1 Sensividad.
Se conoce también como concentración característica y
es la concentración en microgramos por mililitro o partes por
millón capaz de producir 0,0044 de absorbancia. Es una
concentración característica que viene dada para cada
elemento y se la encuentra en manuales.
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En la curva de calibración la sensividad nos va a
permitir determinar la parte alta de la curva de calibración
aceptando todos aquellos valores que estén por debajo al
punto correspondiente al 10% de desviación. Para
determinar el límite superior de la curva de calibración hay
que calcular la sensividad en cada punto.
S = CE× 0,0044/ lectura
El valor 0.0044 es la absorbancia que corresponde a la
mínima diferencia medible con precisión (D T = 1.0% T) en
instrumentos con escala de % T entre 0.0 y 100.0 ; una
absorción de 1% corresponde a 0.0044 unidades de
absorbancia, aplicando:
A = log [100 / (100-% absorción)] = log [100 / (100-1)] =
0.00436
2.2.2 Limite de Detección.
El límite de detección se define habitualmente como la
cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser
detectada con fiabilidad por un método analítico
determinado. Intuitivamente, el LD sería la concentración
mínima obtenida partir de la medida de una muestra (que
contiene al analito) que seríamos capaces de discriminar de
la concentración obtenida a partir de la medida de un blanco,
es decir, de una muestra sin analito presente.
Es la concentración de gramos por mililitro capaz de ser
detectado con 95% de certeza. En esta zona se puede
permitir ciertas desviaciones. Este 95% de certeza
corresponde también a la condición que cumple dos veces la
desviación estándar.
El límite de detección se obtiene preparando 12
muestras cercanas al blanco de las cuales se obtiene la
desviación estándar, y aquella muestra que corresponda al
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valor de dos veces la desviación estándar será el límite
inferior.
2.2.3 Rango de Trabajo.
Es el rango comprendido entre la sensividad y el límite
de detección. El ámbito de trabajo de un método analítico es
el intervalo entre los niveles más bajo y más alto de
concentraciones de una determinada matriz.
2.3 Selección del número de estándares para la
Calibración3.
Seleccionar el número y la concentración de los
patrones es muy importante. Si la concentración de analito
de todas las muestras para ser analizadas entra dentro del
rango lineal, se debería usar un estándar de calibración. El
límite del rango lineal de varios elementos está entre 0.20 y
0.30 unidades de absorbancia.
Por lo tanto, si la lectura del más alto estándar es dentro
de este rango o inferior, un estándar de calibración se puede
utilizar. De la discusión anterior, sabemos que el uso de un
punto de calibración, la curva es una línea recta (figura 5):
FIGURA 5. Un estándar de calibración (rango lineal)
3
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Si la concentración de analito en las muestras se espera
que supere el rango lineal, ya sea dos o tres estándares de
calibración debe utilizarseel rango lineal, dos estándares de
calibración son adecuados. La figura 3 indica la curva de
calibración con 2 estándares de calibración.
FIGURA 6. Curva de Calibración con dos estándares de
calibración.
Generalmente, dos estándares de calibración son
óptimos en casos de una curvatura moderada (10 a 15%).
Tres estándares de calibración se deberían usar para
una curvatura severa. En la figura 4 indica una curva de
calibración con 3 estándares de calibración.
FIGURA 7. Curva de Calibración con 3 estándares de
calibración.
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En general, el tercer estándar de calibración (S3)
debería ser 6 veces la concentración de S1. Es importante
señalar que no es una ventaja usar más estándares de
calibración sino una necesidad. El uso de demasiados
estándares de calibración puede dar lugar a resultados
erróneos. Por ejemplo, si tres estándares de calibración se
inscriben en el rango lineal, podría resultar una curva en
forma de “S” (figura 5) a causa de la variabilidad de las
lecturas del instrumento. En este caso, el instrumento
reconoce un intento no válido de calibración y mostrará un
código de error.
FIGURA 8. Tres puntos de calibración en el rango lineal.
(Curva en forma de “S”)
2.4 Interferencias en Absorción Atómica.4
En absorción atómica las interferencias que más se
presentan son las interferencias químicas, interferencias por
ionización e interferencias de la matriz.
2.4.1 Interferencia Química.
La interferencia química puede ser normalmente
superada o controlada de dos formas: la utilización de una
mayor temperatura de llama o de una adición de un agente
4
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para la liberación de la muestra (o estándar) solución. Una
temperatura más alta de llama proporciona más energía para
romper un compuesto que es estable a una temperatura más
baja de llama eliminando así las interferencias del analito.
2.4.2 Interferencias por ionización.
Las interferencias por ionización se producen cuando la
temperatura de la llama tiene suficiente energía para
provocar el desplazamiento de un electrón del átomo
creando un ión. Como esta reordenación electrónica agota el
número de átomos en estado normal la absorción atómica
se reduce.
Las interferencias de ionización pueden controlarse
mediante la adición de un exceso de un elemento fácilmente
ionizado en el blanco.
2.4.3 Interferencias de la matriz.
Las interferencias de la matriz pueden causar tanto una
supresión o mejora de la señal analizada. Las interferencias
de la Matriz se producen cuando las características físicas
(viscosidad, las características de quema, tensión superficial)
de la muestra y del patrón, difieren considerablemente. Esto
puede ocurrir cuando la muestra contiene una solución de
alta concentración de sales disueltas o ácidos, disolventes
diferentes.
2.4.4 Formación de compuestos poco volátiles.
El tipo más común de interferencia es el producido por
aniones que forman compuestos de baja volatilidad con el
analito y reducen así su velocidad de atomización lo que
origina resultados menores a los esperados.
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CAPÍTULO 2
VALIDACION DE METODOS ANALITICOS
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2.1 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS
La validación se refiere a la evaluación estadística de
los resultados obtenidos en la aplicación de técnicas
analíticas,
mediante
pruebas
convenientemente
documentadas y demostrativas de que un método es lo
suficientemente fiable a fin de producir el resultado previsto
bajo condiciones definidas, como son: sistema analítico,
intervalo de concentración, infraestructura y talento humano.
2.1.1 DEFINICIONES.
Las definiciones más relevantes de los términos
utilizados extraídos de otros documentos se indican a
continuación:
VARIANZA.
Es la que mide la distancia que existe entre los valores
de una serie y la media. Se calcula como la sumatoria de las
diferencias y elevando al cuadrado entre la variable y la
media. La varianza es un número positivo. La raíz cuadrada
positiva de la varianza se llama desviación estándar.
INCERTIDUMBRE.
La guía ISO 3534-1 (ISO 1993), define incertidumbre
como una estimación unida al resultado de un ensayo que
caracteriza el intervalo de valores dentro de los cuales se
afirma que está el valor verdadero.
PRECISIÓN.
La norma ISO 3354 (ISO 1993), define la precisión
como
“el grado de concordancia entre ensayos
independientes
obtenidos
bajo
unas
condiciones
estipuladas”. Estas condiciones dependen de los factores
que se varíen entre cada uno de los ensayos. Por ejemplo,
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algunos de los factores que se pueden variar son: el
laboratorio, el analista, el equipo, la calibración del equipo,
los reactivos y el día en que se hace el ensayo.
REPETIBILIDAD.
La repetibilidad indica el grado de acuerdo entre
resultados mutuamente independientes de un ensayo,
obtenidos utilizando el mismo método, en idénticos
materiales, en el mismo laboratorio, por el mismo operador,
utilizando el mismo equipo y en un corto intervalo de tiempo.
Las condiciones de repetibilidad incluyen:
•
•
•
•
•
El mismo procedimiento de medición.
El mismo observador.
El mismo instrumento de medición utilizado en las
mismas condiciones.
El mismo lugar.
Repetición dentro de un corto período.
Desviación estándar de repetibilidad.
Es la desviación estándar de los resultados de un
ensayo obtenido en las condiciones mencionadas (equipo,
método, operador, laboratorio iguales). Es un parámetro de
la dispersión de los resultados de un ensayo en condiciones
de repetibilidad.
REPRODUCIBILIDAD.
Indica el grado de acuerdo entre los resultados
mutuamente independientes de un ensayo obtenidos con el
mismo método, en idénticos materiales, en diferentes
laboratorios, con diferentes operadores y utilizando distintos
equipos.
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Para que una expresión de reproducibilidad sea válida,
es necesario especificar las condiciones que cambian. Las
condiciones que cambian pueden ser entre otras:
•
•
•
•
•
•
•
•
El principio de medición.
El método de medición.
El observador.
El instrumento de medición.
El patrón de referencia.
El lugar.
Las condiciones de uso.
El tiempo.
Los resultados considerados aquí son generalmente los
resultados corregidos.
Desviación estándar de reproducibilidad.
Es la desviación estándar de resultados de ensayos
obtenidos en condiciones de reproducibilidad. Es un
parámetro de la dispersión de distribución de resultados de
un ensayo en condiciones de reproducibilidad.
Valor de Reproducibilidad y Repetibilidad.
Es el valor por debajo del cual se espera que se
encuentre, con una probabilidad del 95%, la diferencia
absoluta entre dos valores individuales del resultado de un
ensayo, obtenidos en condiciones de reproducibilidad y
repetibilidad.
EXACTITUD.
La guía ISO 3534-1 (ISO 1993), define exactitud
como la “proximidad en la concordancia entre un resultado y
el valor de referencia aceptado”.
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SESGO.
Es la diferencia en el valor esperado (teóricamente igual
al promedio de un número infinito de valores individuales
independientes) del valor verdadero, correcto o asumido.
ANOVA.
Es una colección de modelos estadísticos y sus
procedimientos asociados. El análisis de varianza sirve para
comparar si los valores de un conjunto de datos numéricos
son significativamente distintos a los valores de otro o más
conjuntos de datos. El procedimiento para comparar estos
valores está basado en la varianza global observada en los
grupos de datos numéricos a comparar. Típicamente, el
análisis de varianza se utiliza para asociar una probabilidad a
la conclusión de que la media de un grupo de puntuaciones
es distinta de la media de otro grupo de puntuaciones.
El ANOVA parte de algunos supuestos que han de
cumplirse:
•
•
•
•
La variable dependiente debe medirse al menos a nivel
de intervalo.
Independencia de las observaciones.
La distribución de la variable dependiente debe ser
normal.
Homocedasticidad: homogeneidad de las varianzas.
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC).
Es la cantidad o concentración mínima que puede
determinarse con un nivel aceptable de exactitud y precisión.
RECUPERACIÓN.
El porcentaje de recuperación es el cociente entre la
cantidad de analito medida y el contenido en la muestra. En
el caso ideal, se obtiene un 100%. En mediciones
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experimentales puede perderse analito especialmente en el
caso de tratamientos complejos de muestras con analito en
cantidades traza, dando lugar a porcentajes de recuperación
menores.
NIVEL DE CONFIANZA.
El nivel de confianza es la probabilidad de que el
parámetro a estimar se encuentre en el intervalo de
confianza. Los valores que se suelen utilizar para el nivel de
confianza son el 90 %, 95%, 99% y 99,9%.
Nivel de confianza es la "probabilidad" de que el
intervalo calculado contenga al verdadero valor del
parámetro. Hablamos de nivel de confianza y no de
probabilidad ya que una vez extraída la muestra, el intervalo
de confianza contendrá al verdadero valor del parámetro o
no, lo que sabemos es que si repitiésemos el proceso con
muchas muestras podríamos afirmar que los intervalos así
construidos contendría al verdadero valor del parámetro.
Función respuesta / linealidad.
Es la relación entre la concentración de analito y la
respuesta del método. Esta relación, denominada
comúnmente curva patrón o curva de calibración, no tiene por
qué ser lineal para que el método sea eficaz. Cuando no sea
posible la linealidad para un método, se deberá encontrar un
algoritmo adecuado.
Patrones y materiales de referencia.
Un material de referencia, según la definición dada en la
ISO guide 30, es una sustancia o material en que una o
varias propiedades han sido suficientemente bien
establecidas de tal forma que permiten su uso para calibrar
un instrumento, validar un método analítico, o asignar un
valor a un material o sistema.
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Material de referencia certificado.
Es aquel material de referencia que tiene certificados,
mediante procedimientos técnicamente válidos llevados a
cabo por un organismo competente, uno o varios valores de
una o de más de sus propiedades.
Patrón.
Instrumento de medida, material de referencia o sistema
de medida destinado a definir, realizar, conservar o
reproducir una unidad o uno o varios valores de una
magnitud para que sirvan de referencia.
Patrón primario.
Patrón que es designado o ampliamente reconocido
como poseedor de las más altas cualidades metrológicas y
cuyo valor se acepta sin referirse a otros patrones de la
misma magnitud.
Patrón secundario.
Patrón cuyo valor se establece por comparación con un
patrón primario de la misma magnitud.
Patrón de referencia.
Un patrón, acompañado de un certificado, en el que una
o más de sus propiedades está certificada por un
procedimiento que establece trazabilidad a una realización
exacta de la unidad en la que se expresa dicha propiedad, y
para el que cada valor certificado está asociado a una
incertidumbre con un nivel de confianza determinado.
Material de referencia interno.
Es aquél preparado por un laboratorio para su propio
uso.
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Trazabilidad.
Propiedad del resultado de una medición o de un patrón
tal que pueda relacionarse con referencias determinadas,
generalmente a patrones nacionales o internacionales, por
medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones
teniendo todas las incertidumbre determinadas.
2.2 MÉTODO DE VALIDACIÓN.
Validar un método de análisis consiste en verificar y
documentar su validez, esto es, su adecuación a unos
determinados requisitos previamente establecidos. La
definición proporcionada por la norma ISO 8402 (ISO, 1994)
indica a la validación como la “confirmación mediante
examen y provisión de evidenciad objetivas que se cumplen
los requisitos particulares para un uso específico
determinado”.5
Como parte de la validación es indispensable introducir
la incertidumbre en la medida para lo cual se desarrollará
todo el proceso de cálculo y determinación.
La validación interna de un método es el proceso de
verificar dentro de un laboratorio, que un método
previamente validado en otro ámbito conduce a resultados
fiables. Los ensayos de adecuación se aplican cuando se
quieren transferir un método desde un laboratorio a otro que
quiera adoptarlo. El laboratorio debe estimar sus propios
valores de precisión para poder asignar la incertidumbre
correspondiente al resultado.
Otros ensayos de verificación se realizan para
comprobar que todo el procedimiento analítico funciona
5
Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2000
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correctamente antes de empezar una nueva determinación.
Comprobar la sensibilidad del método (pendiente de la recta
de calibrado), o la selectividad en algunos ensayos
cromatográficos.
La validación de métodos proporciona una idea de las
capacidades y limitaciones que posee un método analítico
cuando se utiliza para el análisis rutinario.
2.2.1 Normas Básicas para la Validación.
Hay tres normas básicas que deben cumplirse cuando se
ha de validar un método:
1. Debe validarse el procedimiento completo. Esta etapa
suele introducir menos error. Por el contrario las etapas
previas que requieren frecuentemente una intervención
humana más elevada son susceptibles de incorporar
mayor sesgo.
2. Debe validarse todo el intervalo de concentraciones, ya
que la precisión del método varía con la concentración
del analito.
3. Debe validarse teniendo en cuenta la variedad de
matrices.
2.2.2 Principio de la validación.
Cada validación de un procedimiento consiste en tres
pasos:
1. Establecimientos de las condiciones por cumplir.
2. Determinación de los parámetros estadísticos del
procedimiento.
3. Valoración de los resultados de la validación por
comparación de los parámetros estadísticos obtenidos
con las condiciones y decisión sobre la validez del
procedimiento para el propósito establecido.
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2.2.3 Alcance de la validación.
Se trata de un método de ensayo interno, elaborado en
el laboratorio y que no se encuentra en normas u otras
colecciones de métodos.
2.2.4 Objetivo de la validación.
Comprobar que el método tiene la repetibilidad, la
reproducibilidad, la precisión y la exactitud suficiente para el
objetivo de aplicación y que el laboratorio domina el ensayo y
lo realiza correctamente.
2.3 PROCESO DE VALIDACIÓN.
El esquema que resume un proceso de validación es el
siguiente:
1. Necesidad analítica.
Se establece, por la autoridad del laboratorio, la necesidad
de satisfacción de una demanda analítica.
2. Método.
Revisión de métodos disponibles y elección del más
apropiado.
3. Borrador del procedimiento.
Teniendo en cuenta los aspectos formales de contenido.
4. “Puesta a punto”.
Se ajustan y afinan las distintas variables del método. En
este apartado “se prueba” teniendo en cuenta los diversos
parámetros de validación.
5. Elección de los parámetros de validación.
Teniendo en cuenta las guías aplicables y la experiencia
obtenida en la puesta a punto.
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6. Fijación de
validación.
objetivos
para
los
parámetros
de
Teniendo en cuenta la bibliografía aplicable y la
experiencia obtenida en la puesta a punto).
7. Diseño experimental y estadístico.
Para la obtención de los parámetros elegidos, siguiendo el
procedimiento.
8. Realización de los ensayos diseñados.
De acuerdo con el procedimiento (borrador). Evidencias
registrables completas.
9. Tratamiento estadístico de los datos obtenidos.
Se obtienen los valores propios del laboratorio para los
parámetros de validación).
10. Hacer declaración de método validado
11. Guardar
registros
ordenadamente,
aprobar
procedimiento (hasta ahora en borrador) y difundir /
distribuir
Un procedimiento se considerará validado mientras no se
produzcan cambios que impidan asegurar que se
mantiene bajo control.
2.4 DESCRIPCION
2.4.1 NECESIDAD ANALÍTICA. MÉTODO
Una vez establecida, la necesidad de tener a disposición
del laboratorio un procedimiento analítico que satisfaga una
determinada demanda, deberá procederse a la elección del
método más adecuado, para lo que se puede acudir a la
bibliografía especializada.
Se detallará una relación de todos los documentos que
han sido necesarios para llevar a cabo la validación del
método analítico y de los documentos que deben utilizarse
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para llevar a cabo la validación (manejo de equipos, hojas de
toma de datos, etc.).
2.4.2 PUESTA A PUNTO
La “Puesta a punto” de un método es una actividad
previa a la validación que debe realizar el laboratorio para
llegar a tener un conocimiento general del mismo. Con esta
actividad se consigue que el método “funcione” produciendo
unas respuestas razonablemente aceptables y consistentes.
Para ello, es necesario “afinar” el proceso del método en
todos sus apartados, prestando una especial consideración a
los diversos parámetros instrumentales de aplicación (pe,
longitudes de onda, paso de celda, velocidad de aporte de
muestra, temperaturas de horno,....).
2.4.3 DISEÑO EXPERIMENTAL Y ESTADÍSTICO
Los parámetros no se determinan en forma secuencial, se
obtienen como resultado de un diseño experimental
adecuado que contempla los objetivos que se quieren
conseguir.
Algunos de los elementos servirán para la
determinación de uno o más parámetros. El siguiente
proceso pretende ser representativo de un método analítico
típico y se compone de las siguientes fases:
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Blanco o muestra
Submuestra 1
Submuestra i
Submuestra n
Procesamiento en condiciones de repetibilidad
(pesada, preparación, digestión, disolución,)
Procesado 1
Procesado i
Procesado n
Lectura Instrumental e interpolación contra la recta de calibrado
Resultado 1
Resultado i
Resultado n
Cálculos para obtener el resultado final de la muestra
RESULTADO FINAL DE LA MUESTRA
CUADRO 1. Esquema del Diseño Experimental y
Estadístico.
Para la realización de este proceso es importante tener
en cuenta:
•
•
•
Selección de los tipos de muestras a ensayar.
Determinación del número de submuestras por
muestra a procesar.
Procesamiento
de
todas
las
submuestras
simultáneamente (en condiciones de repetibilidad)
siguiendo el método analítico, junto con el blanco (es
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•
•
•
una muestra que tiene todos los componentes de la
muestra problema excepto el analito problema, y que
ante las dificultades que normalmente se tienen para
conseguir una matriz "limpia" del analito problema,
suele aproximarse con un "blanco de reactivos").
Lectura (normalmente instrumental) de una señal que
produce cada una de las submuestras y el blanco (el
número de lecturas que se debe obtener de cada
submuestra y del blanco depende normalmente del
instrumento o sistema de medida).
Interpolación, contra una "recta de calibrado" del
instrumento o sistema de medida, de la lectura obtenida
para convertirla en resultado (la recta de calibrado
mencionada, que más adelante definiremos como
función de respuesta instrumental, se obtiene
generalmente por la lectura de la señal que producen
una serie de "patrones de trabajo limpios" (no tienen en
cuenta la matriz de la muestra problema) que se
preparan en el laboratorio a partir de patrones trazables
o productos químicos normalizados o que se han
adquirido como tales), tras la realización de diversos
cálculos en los que se tienen en cuenta la sustracción
de la aportación debida al blanco.
Cálculos a partir del resultado anterior para obtener el
resultado final atribuible a la muestra y su incertidumbre
asociada,
incluyendo
todas
las
etapas
del
procesamiento.
Obtención de la función de respuesta instrumental con
seis niveles de concentración, (cinco patrones mas el blanco)
5 veces, en condiciones de repetibilidad.
Determinación de la exactitud
(recuperación) de
materiales de referencia a tres niveles, 5 veces. Repetición
del diseño anterior en 5 días distintos en condiciones de
reproducibilidad interna.
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Obtención de la función de respuesta
instrumental con seis niveles de concentración
(cinco patrones mas blanco), por quintuplicado
en cada nivel, en condiciones de repetibilidad.
DISEÑO
EXPERIMENTAL
Muestras para la
validación
Submuestras
Procesamiento
Lectura
Determinación de la exactitud (recuperación)
de materiales de referencia a cinco niveles, por
quintuplicado.
Repetición del diseño anterior en cinco días
distintos en condiciones de reproducibilidad.
Patrones de trabajo
A cinco niveles de concentración obtenidos a
partir de una sustancia pura.
Blanco de los reactivos
Materiales de Referencia
a un nivel de concentración
Cinco de cada una, preparadas cada día en
condiciones de repetibilidad.
Total: 55 por día * 5 días = 275 unidades
1. 1 x 5 = 5 blancos
2. 5 x 5 = 25 patrones
3. 5 x 5 = 25 materiales de referencia
Simultáneo de las 55 unidades cada día en
condiciones de repetibilidad
A las submuestras deberán aplicarse el
método completo
Que produce cada submuestra en el sistema
de medida (por ejemplo en miliabsorbancias)
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Función de
respuesta
Obtenida, cada día, por regresión lineal con
las 50 parejas de x: valores asignados / y:
lecturas obtenidas, de patrones y blancos.
Determinación, cada día, del grado de ajuste y
de los intervalos de confianza de los
coeficientes de regresión y de la función de
respuesta.
Determinación de la función de respuesta
media de los cinco días y sus intervalos de
confianza.
Interpolación
y cálculos
Cada día, de las lecturas obtenidas de los
materiales de referencia.
Determinación de la exactitud en cada nivel.
Tratamiento
estadístico
Análisis de varianza simple de los resultados
obtenidos para obtención de la precisión por
niveles.
Obtención de los límites de detección y
cuantificación, del intervalo de trabajo y de la
incertidumbre asociada a cada nivel.
TABLA 1. Diseño Experimental6
2.4.4 ENSAYOS. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE
DATOS OBTENIDOS
El procesamiento de todas las submuestras previstas
cada día, de acuerdo con el diseño experimental, se realizará
en condiciones de repetibilidad y siguiendo el método
completo.
Los patrones (y blancos) se prepararán cada día
para recoger la variabilidad que proviene de dicha
preparación. Si se parte de una solución “madre”, no es
necesario preparar dicha solución cada día, siempre y
6
• G-CSQ-02 Rev. 1-Julio 96: Guía para los laboratorios que realizan validaciones de métodos
de análisis químicos.
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cuando esté controlada su deriva (e incluida en su
incertidumbre).
2.4.5 PARAMETROS A DETERMINAR Y TRATAMIENTO
ESTADÍSTICO.
Para demostrar que un método es adecuado para la
aplicación que se pretende es preciso determinar mediante
estudios de laboratorio sus características de funcionamiento
(parámetros), que difieren según el alcance del método de
ensayo a validar. Los tipos de ensayo a considerar serán los
siguientes:
a) Métodos de identificación
b) Determinación cuantitativa de un componente
c) Determinación cualitativa de un componente
En la tabla 2 se definen los parámetros a considerar
para cada tipo de ensayo:
TIPO DE ENSAYO
PARAMETRO
Identificación
Selectividad / ESPECIFICIDAD
Determinación cuantitativa de Intervalo de trabajo
un componente
Linealidad / Función respuesta
Selectividad / Especificidad
Precisión
Exactitud
Límite de cuantificación
Incertidumbre
Robustez
Determinación cualitativa
Selectividad / Especificidad
Límite de detección
TABLA 2. Parámetros de Validación.
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2.4.6 EVALUACIÓN DE LOS PARAMETROS
2.4.6.1 Función de respuesta / linealidad / sensibilidad
En realidad existen dos funciones de respuesta en el proceso
típico que hemos definido:
2.4.6.2 Función de respuesta instrumental (del sistema de
lectura) que es la que normalmente se conoce como recta de
calibrado.
Cada día se establece la función de respuesta [L = f (P)]
con los treinta pares de valores formados por las cinco
réplicas del Blanco (Bp) y de los 5 "patrones de trabajo
limpios" (P1, ..., P5) de valor teórico conocido, que cubran el
intervalo de trabajo para el que se quiera desarrollar el método
analítico.
Si los datos se ajustan a una recta (respuesta lineal), la
ecuación de la función será del tipo:
L = mP + L 0
Calculamos el coeficiente de regresión (m) de la misma y
el coeficiente L0 (valor de la ordenada en el origen), por el
método de los mínimos cuadrados.
Debemos estimar también el grado de ajuste de la recta
estimada a los valores de L observados, calculando el grado
de determinación, r2 , que no deberá superar unos valores
prefijados, (por ejemplo deberá ser superior a 0.99), para
considerar que la función es lineal en el intervalo de
concentraciones de estudio además del error tipo en la
estimación de P, sL,P /m, la desviación tipo de m (sm) y la
desviación tipo de L0 (sL0), que necesitamos para determinar
los respectivos intervalos de confianza.
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NOTA 1: Los coeficientes m y L0 son fácilmente obtenibles a
través de calculadoras con funciones estadísticas. Las
ecuaciones que calculan sus desviaciones tipo son:
sm =
s L,P
∑(Pi - P )
s L0 = s m
2
∑P
2
i
n
Donde:
2
s L ,P =
s P ,L =
Lobs
Lest
n
Pi
∑ ( Lobs - Lest )
n-2
s L ,P
m
son las lecturas observadas,
las estimadas con la recta de regresión L = mP +L0,
el número de pares de valores (=30 en el ejemplo) y
los valores asignados a los patrones.
Por otro lado, el error tipo en la estimación de P es
NOTA 2: Si la función de respuesta no posee el grado de
linealidad definido (por ejemplo un r2 > 0.99), entonces se
aumentará el número de Pi para descomponer la función de
respuesta en tramos del intervalo de trabajo, o se investigará
otra función matemática con el fin de establecer la curva que
mejor se ajuste a los valores obtenidos y los niveles concretos
en los que se pueden cuantificar las muestras en las
condiciones de estudio.
2.4.6.3 Función de respuesta del método.
Es la que se determina cuando se calcula la
recuperación del método y puede coincidir exactamente con la
instrumental cuando la recuperación es del 100%.
NOTA 3: Si la función de respuesta del método no coincide
con la instrumental (recuperación distinta del 100%), los datos
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pueden presentarse corregidos con el factor de recuperación
encontrado o sin corregir. En ambos casos se deberá tener en
cuenta la contribución a la incertidumbre del resultado final de
la opción elegida.
2.4.6.4 Selectividad / especificidad
Normalmente, salvo en el caso de que estemos
validando un método completamente desarrollado de nuevo
por el laboratorio, este parámetro de validación se resuelve
bibliográficamente, ya que los métodos seleccionados, de
reconocida aplicación, cuentan con información sobre su
selectividad y especificidad y las interferencias que se
conocen.
Para poder asegurar la selectividad y especificidad de un
método, cuando se conoce la existencia de interferencias, por
experiencia previa o por información bibliográfica, habrá que
diseñar un estudio experimental del efecto de las
mencionadas interferencias, mediante la adición de
cantidades conocidas de componente interferente.
Las pruebas a realizar para asegurar la selectividad o
especificidad del método podrán ser diferentes en función del
tipo de muestra a analizar, la técnica utilizada, la información
bibliográfica disponible, etc. Entre las pruebas más utilizadas
se encuentran las siguientes:
•
•
•
Método de adiciones, comparando los resultados (o la
respuesta) de la muestra que contiene las posibles
interferencias con el resultado de otra muestra sin
dichas interferencias.
Comparación de los resultados obtenidos por un
método, con los resultados obtenidos por otro método
(método de confirmación).
Etc.
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2.4.6.5 Precisión
El estudio de la precisión se puede realizar calculando, a
través del análisis simple de varianza (ANOVA de dos factores
totalmente anidados homogéneos), las desviaciones estándar
de repetibilidad (sr ) y de reproducibilidad (sR ) para cada uno
de los niveles de ensayo.
La precisión de reproducibilidad que mide la siguiente sR
es la del método en el laboratorio (es por tanto una medida
de precisión intermedia según el esquema de la norma ISO
5725, que define la sR como desviación estándar de
reproducibilidad del método en el “mercado”, incluyendo la
variabilidad que proviene de los distintos laboratorios de un
ensayo interlaboratorios adecuado).
2.4.6.6 ANALISIS DE LA VARIANZA (ANOVA)
El análisis de la varianza es un método estadístico para
determinar si diversos conjuntos de muestras aleatorias de
una determinada variable proceden de una misma población
o bien de poblaciones distintas.
El objetivo principal del Anova es contrastar si existen
diferencias entre las diferentes medias de los niveles de las
variables (factores). Cuando sólo hay dos medias, el Anova
es equivalente a la prueba t- Student para el contraste de
dos medias.
Para aceptar que los grupos estudiados no son
diferentes debe aplicarse la prueba F:
Fc =
DCM B
DCMw
Comparar el valor de Fc con Ftabulado para un valor de
significación establecido α, (ν1= k-1; ν2 = n-k)
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Si FC < FT entonces no existen diferencias significativas
entre los distintos grupos muestrales.
En el caso contrario si existieran diferencias significativas
entre los grupos al nivel α preestablecido, se deberá
considerar que al menos dos de las medias de grupos son
diferentes entre sí.
TABLA PARA EL ANÁLISIS DE VARIANZA
Cada nivel
DIA
Observaciones 1
1
L11
2
L12
3
L13
4
L14
5
L15
DIA DIA DIA DIA
2
3
4
5
L21 L31 L41 L51
L22 L32 L42 L52
L23 L33 L43 L53
L24 L34 L44 L54
L25 L35 L45 L55
TABLA 3. Tabla para el Análisis de la Varianza
5
Medias de cada día:
Li =
5
Media general:
L=
∑L
5
5
∑∑ Lij
i =1 j =1
25
ij
j =1
5
=
∑ 5L i
i =1
25
5
=
∑L
i
i =1
5
ANÁLISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Suma de
Diferencias
Origen
Grados de
Diferencias
Cuad. Medias
de la
Libertad
Cuadráticas
(DCM=SDC/v)
Varianza
(v)
(SDC)
5
SDC B
Entre
SDC
=
5(Li − L)2
DCM B =
∑
ν1 = k -1
B
4
grupos
i =1
5
5
SDC W
Dentro
ν2 = n-k
SDCW = ∑∑ (Lij − Li )2
DCM W =
20
i =1 j=1
de
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grupos
5
Total
ν = n-1
(v = ν1 + ν2)
Repetibilidad:
Reproducibilidad:
5
SDCT = ∑∑ (Lij − L) 2
i =1 j=1
(= SDCB + SDCW )
DCM T =
SDC T
24
Sr =
DCMW / v2
SR = Sr2 + SL2
El denominador 5 son las observaciones diarias en cada
nivel.
Normalmente debería ocurrir que DCMB > DCMW caso
contrario deben existir razones que justifiquen.
Si el intervalo de trabajo es muy amplio, se espera que
las desviaciones estándar sean significativamente diferentes
para cada punto de la función de respuesta del método, lo que
obligaría a usar el método por rangos.
2.4.6.7 Exactitud
La exactitud del método puede establecerse por la
comparación de los resultados, obtenidos en el diseño
experimental, de los Materiales de Referencia (MRi) con los
valores teóricos de los mismos, observando el grado de
concordia entre el valor obtenido y el valor esperado.
La recuperación en cada punto se calcula mediante la
siguiente expresión:
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% Re = X obtenido × 100
X esperado
Donde:
Xobtenido es el resultado obtenido del análisis del material de
referencia utilizado, y
Xesperado es el valor teórico del mismo.
La recuperación global del método se calcula a partir de
la media de las individuales en cada punto (indicaremos el
intervalo de recuperaciones obtenidas), cuando las
recuperaciones en los diversos niveles son similares.
Si la recuperación no es similar en las distintas
concentraciones del intervalo de trabajo y se observa que
existe una posible relación entre la concentración y la
recuperación (positiva o negativa), para la cuantificación de las
muestras reales deberíamos recurrir al método de adiciones.
La presentación de los resultados finales sobre muestra
(incluye su incertidumbre asociada) siempre deberán tener en
cuenta el factor de recuperación. Este factor puede o no
aplicarse. Si se aplica, la incertidumbre del resultado final
deberá tener en cuenta la contribución de dicho factor.
Si no se aplica, la incertidumbre del resultado final deberá
tener en cuenta la contribución de no corregir.
Otras formas con las puede determinarse la exactitud de
un método, son:
• por comparación con resultados obtenidos por otro
método ya validado
• mediante estudios de intercomparación.
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2.4.6.8 Límite de Cuantificación
Se emplea cuando se realizan determinaciones de
analitos a nivel de trazas. En esencia se encuentran dos
formas para determinarla:
•
•
•
El principio de medición.
De manera análoga al límite de detección, en el cual el
límite de cuantificación es como mínimo tres veces el
límite de detección, según cada caso.
Por determinación de una incertidumbre de los
resultados máxima permisible (dada como dispersión
relativa del 30%, por ejemplo) por medio de la
determinación de la concentración más pequeña que se
puede medir con este valor máximo. Este límite de
cuantificación es, por lo tanto, dependiente de las
exigencias de la incertidumbre.
2.4.6.9 Límite de detección (del método)
El límite de detección puede ser establecido de
diferentes maneras dependiendo del tipo de método:
a.
Métodos no instrumentales
•
b.
Por comparación de blanco y blanco enriquecido a
una sola concentración.
Métodos instrumentales
Por comparación de blanco y blanco enriquecido a
una sola concentración.
• Blanco enriquecido a una sola concentración
• Comparación del comportamiento de blanco con
blanco enriquecido a diferentes concentraciones
• Determinación del corredor de error
• Método de comparación Señal / Ruido
•
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En el caso de procedimientos analíticos instrumentales
que están sujetos a ruido de fondo, los documentos de la
International Conference Harmonization describen una
aproximación común que consiste en comparar las señales
de muestras con concentraciones bajas (conocidas) del
analito, contra las señales del blanco.
2.4.6.10 Método de comparación Señal/Ruido
El límite de detección se define como la concentración
del elemento el cual produce una señal/ruido en una
proporción de 3. Así, el límite de detección considera tanto la
señal de amplitud como el ruido de referencia es la
concentración más baja que puede ser fácilmente
diferenciable desde cero.
El procedimiento estándar para establecer el límite de
detección por absorción atómica de llama es como sigue:
Dos concentraciones del elemento son preparadas,
utilizando por separado material volumétrico de vidrio para
reducir la posible contaminación al mínimo. El promedio de
las dos absorbancias se establece como se explica más
adelante. La concentración más baja del estándar es
aproximadamente 5 veces el límite de detección esperado. Y
el segundo estándar será dos veces esta concentración.
Después se establece el que se considera que está en
condiciones óptimas realizando una lectura de cada estándar
alternativamente, 10 ó más veces. Se realiza la lectura de un
blanco (solamente solvente) entre cada lectura del estándar.
La secuencia es: blanco, estándar de baja concentración,
blanco, estándar de alta concentración; repitiendo la
secuencia.
Habiendo obtenido los datos, se realiza el siguiente
cálculo:
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1. Promedio de las dos lecturas de los blancos realizados
inmediatamente antes y después de cada estándar y
restando del valor de la lectura del estándar.
2. Calcular el promedio y la desviación estándar y
determinar la lectura más alta del estándar. Haciendo lo
mismo para determinar la lectura más baja del estándar.
3. Si el rango del promedio no corresponde el rango de la
concentración preparada se está dentro de un error
estadístico, entonces se rechaza el dato.
4. Si los datos entran en el rango del promedio, se calcula el
límite de detección como se indica a continuación:
El cálculo se realiza independientemente para cada
concentración, y para el límite de detección se promedia el
valor de los dos resultados.
Habitualmente la medición analítica del límite de
detección es difícil, ya que, por definición, el ruido realza
considerablemente en un porcentaje el total de la señal
medida.
2.4.6.11 INCERTIDUMBRE
Parámetro asociado al resultado de una medición, que
caracteriza la dispersión de los valores que podrían
razonablemente ser atribuidos al mesurado. El parámetro
puede ser, por ejemplo, una desviación estándar o la semiamplitud de un intervalo de nivel de confianza determinado.
La incertidumbre de medida comprende, en general,
varios componentes, algunos pueden ser evaluados a partir
de la distribución estadística de los resultados de series de
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mediciones y pueden caracterizarse por sus desviaciones
estándar experimentales.
Los otros componentes, que también pueden ser
caracterizados por desviaciones estándar, se evalúan
asumiendo distribuciones de probabilidad, basadas en la
experiencia adquirida o entras informaciones.
2.4.6.11.1 CLASIFICACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE.
A la incertidumbre se la puede clasificar según la forma
de cálculo, obteniendo dos tipos:
•
•
INCERTIDUMBRE TIPO A: método de evaluación de la
incertidumbre mediante análisis estadístico de
observaciones (generalmente utilizando la desviación
estándar) obtenida en el curso de la actual medición.
INCERTIDUMBRE TIPO B: método de evaluación de la
incertidumbre por
medios distintos al análisis
estadístico de observaciones u obtenidas a partir de
valores “históricos”. Estos otros medios pueden ser:
• Datos de mediciones anteriores;
• Experiencia con el conocimiento general de las
características y el comportamiento y las propiedades
de los instrumentos;
• Especificaciones de los fabricantes;
• Datos obtenidos de los certificados de calibración o de
otro tipo de certificados;
• Incertidumbres asociadas a datos de referencia
tomados de manuales;
• etc.
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Evaluar la contribución de cada componente de la
incertidumbre:
Cada componente de la incertidumbre se representan
con la letra u minúscula y un subíndice que hace referencia a
la fuente de incertidumbre, uZ
a) Las componentes de tipo A son estimadas aplicando
métodos estadísticos.
y Se realizan una serie de n medidas de la magnitud de
entrada que estamos analizando, identificada como Q bajo
las mismas condiciones, obteniéndose qk valores.
y Se calcula la media aritmética, q como mejor estimador del
valor verdadero de la magnitud Q:
n
q=
∑q
k
k =1
n
y Se calcula la desviación estándar experimental (s) que
viene dada por la siguiente expresión:
n
s( q ) =
∑ (q
k =1
2
k
−q)
n−1
y La incertidumbre asociada a esta estimación es:
uA ( q ) =
s(q )
n
NOTA: Si el número de mediciones n es pequeño (n< 10), la
evaluación de tipo A expresada por la ecuación anterior puede
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no ser fiable. Si no se puede aumentar el número de
observaciones deberían calcularse los grados efectivos de
libertad.
b) Las componentes de tipo B son estimadas basándose
en el certificado de calibración, la experiencia,
recomendaciones de fabricante, etc. Lo que hay que
conocer es la distribución estadística que siguen estas
distribuciones y para ello se pueden plantear el siguientes
caso:
•
La estimación xi se toma de una especificación del
fabricante, de un certificado de calibración, de un manual
de instrucciones, etc. y su incertidumbre asignada se
establece como un múltiplo particular de una desviación
estándar.
En este caso, la incertidumbre asociada u (xi) es
simplemente el valor asignado dividido por el factor de
cobertura, el cual se determina a partir de sus grados de
libertad eficaces:
Donde:
•
•
•
UXi (i = 1, 2, 3,…, n): contribución de la incertidumbre
típica asociada a la estimación de salida.
Y: resultante de la incertidumbre típica asociada a la
estimación de entrada
Xi, Vi: grados efectivos de libertad de la contribución a
la incertidumbre típica.
NOTA: Para u Tipo A: Vi = n – 1
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Para u Tipo B: Vi = ∞
Otras contribuciones
La incertidumbre típica, u(y), así calculada puede no
haber tenido en cuenta otro tipo de contribuciones que habría
que añadir en este momento, con lo que la expresión de la
u(y)TOTAL
u 2 ( y )TOTAL = u 2 ( y ) + ∑ ( otras contribuciones ) 2
Estas otras contribuciones están asociadas directamente
a la estimación de la magnitud de salida. Una de ellas puede
ser:
•
Contribuciones de tipo A cuando se realizan una serie
de n medidas de la magnitud de salida (p.e. el resultado
final de la calibración se expresa como el valor medio
de n determinaciones realizados sobre equipos
distintos).
En este caso, se deben revisar las contribuciones
asociadas con las estimaciones de las magnitudes de entrada
para no considerar dos veces la misma contribución.
Estas otras contribuciones deben tener las mismas
unidades que la estimación de la magnitud de salida.
2.4.6.11.2 Posibles Causas de Incertidumbre.
•
•
•
•
•
Certificado de calibración
Deriva
Temperatura
Inestabilidad de la Medida
Método de Medida
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•
•
•
•
•
•
•
Estabilidad a Corto Plazo o
Instrumento de Medida
Criterio de Medida
Operador
Resolución
Redondeo
Representatividad de una Muestra
Reproducibilidad
Repetibilidad
del
2.4.6.12 Robustez
El objetivo de la prueba de robustez es optimizar el
método analítico y describir que bajo las condiciones
establecidas (incluidas sus tolerancias) se pueden obtener
resultados suficientemente exactos con una alta seguridad,
de manera que el procedimiento funcione confiablemente si
se utiliza en otros laboratorios o después de intervalos largos
de tiempo.
Un método es más robusto entre menos dependan los
resultados del ensayo de una modificación en las
condiciones de éste. Al desarrollar un nuevo método analítico
debe determinarse la modificación de los resultados por el
cambio en las condiciones del ensayo. Las condiciones que
afectan el método de medición son por ejemplo, para el caso
de cromatografía:
•
•
•
•
•
•
•
Laboratorio, lugar de la medición.
Personal.
Aparatos.
Reactivos, disolventes, estándares, etc.
Caudal de la fase móvil.
pH de la fase móvil
Gradiente de temperatura
Modificaciones pequeñas a estas condiciones deben
afectar muy poco o nada al resultado del análisis.
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Un aspecto importante de la robustez es la estabilidad
de todas las muestras, estándares y reactivos, tanto en el
almacenamiento como durante las condiciones de ensayo.
En este caso pueden ser parámetros a probar:
•
•
•
•
•
•
Sensibilidad a la temperatura.
Sensibilidad a la luz.
Hidrólisis por ejemplo por la humedad del aire.
Facilidad de oxidación.
Descomposición química.
Efectos catalíticos, por ejemplo por las paredes del
contenedor.
• Adsorción, por ejemplo durante la filtración de
disoluciones con trazas.
• Precipitación, por ejemplo al dejar mucho tiempo una
disolución.
2.6 INTERVALO DE TRABAJO VALIDADO
Puede ser el mismo descrito en la definición de los
objetivos de los parámetros de estudio o también puede variar
como resultado del proceso de validación.
Está comprendido entre el límite de cuantificación y el
valor del mayor patrón usado. El intervalo de trabajo se
expresa en resultados finales en muestra por lo tanto se
considerará todos los pasos del método completo validado.
2.7 DECLARACIÓN DEL MÉTODO VALIDADO
INFORME DE VALIDACIÓN
Si los objetivos predefinidos se han cumplido, podemos
proceder a declarar el método validado.
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• Descripción completa con todo detalle del procedimiento
de medición y formas de determinar el mensurando.
• Alcance de medición, exactitud alcanzada y aplicaciones
• Los requisitos de todas las mediciones que están
incluidos en el método (Temperaturas, volúmenes,
masas, etc.)
• Resultado de la investigación del efecto de cualquier
variable de influencia.
2.8 CONTROL DEL MÉTODO. REVALIDACIÓN
Todo procedimiento declarado como validado se
considerará como tal mientras no se produzcan cambios que
impidan asegurar que se mantiene bajo control.
Dado que la validación es una actividad continua que
se alimenta, fundamentalmente, de los datos que se obtienen
de las actividades que se realizan en el terreno de la
calibración y del control de calidad, puede llegar el caso de
que, como resultado de esta actividad continuada, sea
necesario cambiar los límites de aplicación del método.
Si se produce esta situación, deberemos proceder a una
nueva declaración de validación, apoyada en todos los
registros que la soportan.
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CAPÍTULO 3
PROCEDIMIENTO ESPECÍFICO DE ENSAYO PARA
ANÁLISIS DE MINERALES
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CADMIO
1. OBJETO
La finalidad de este registro es la obtención de los datos
necesarios para la validación del método para análisis de
Cadmio (Cd) en minerales por digestión ácida mediante el
método de Espectrofotometría de Absorción Atómica.
2. ALCANCE
Este procedimiento de ensayo es aplicable en muestras
de minerales polimetálicos.
2.1 Intervalo de trabajo
El método es aplicable en el rango de 0.0003 mg/L a 2.5
mg/L mediante diluciones.
2.2 Lavado de cristalería
Lavar la vidriería con HCl 1:1 caliente y enjuagar con
agua destilada, se recomienda reservar la vidriería
solamente para esta determinación y luego de utilizarla se
lava y se mantiene con agua destilada hasta necesitarla, así
el tratamiento con ácido será ocasional.
3. REFERENCIAS
3.1. Documentos utilizados en la elaboración
•
Manual de Procedimientos Generales del Laboratorio
“Cesemin”
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3.2. Documentos a utilizar conjuntamente
•
Instructivo de uso del espectrofotómetro.
4. GENERAL
El Cadmio total corresponde a la concentración de éste
en la muestra original, tras un previo proceso de tamizado
por malla 100 y sometida a digestión ácida incluye todo el
cadmio que se encuentra en la forma orgánica e inorgánica.
5. DESCRIPCION
5.1 Equipos y materiales
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Plancha calentadora
Espectrofotómetro de Absorción Atómica
Vasos de precipitación
Lunas de Reloj
Pipetas Volumétricas
Balones de Aforo
Embudos
Soportes
Termómetro
Papel Filtro
Frasco lavador
Fuelles
Espátula
Balanza
Mortero
Molino de Martillos
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5.2 Reactivos
•
•
•
•
Agua destilada
Acido Clorhídrico concentrado
Acido Nítrico concentrado
Acido Perclórico concentrado
5.3 Preparación
5.3.1Preparación de la curva de calibración.
Medir de la solución estándar de cadmio en medio
nítrico al 2% como se indica en la tabla:
Identificación de la
muestra
Blanco
Estándar 1
Estándar 2
Concentración
(mg/L)
0.0
0.5
1.5
TABLA 1. Estándares de Calibración
Con las absorbancias y concentraciones de los patrones
se graficara la concentración en las abscisas
y al
absorbancia en las ordenadas, de este grafico se obtendrá la
ecuación de la curva y el coeficiente de correlación aplicando
el método de regresión lineal.
5.4 Realización
DISGREGACIÓN ÁCIDA EN VASOS DE PRECIPITACIÓN.
• Pesar 200 mg. de muestra y transferir a un vaso de
vidrio.
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• Añadir 5 ml. de agua + 5 ml. de HCl y dejar hervir
durante 10 minutos (350ºC)
• Añadir 5 ml. de HNO3 + 1 ml. de HClO4 y llevar a casi
sequedad total (250ºC)
• Enfriar y colocar 5 ml. de agua + 5 ml. de HCl y disolver
la muestra en caliente.
• Enfriar nuevamente y aforar a 100 ml. (el volumen de
aforo depende de la concentración de los elementos a
determinar)
• Determinar la concentración de elementos por AA.
NOTA: Recordar hacer un blanco con los ácidos empleados
(sin muestra) (200-250ºC)
5.5 Tratamiento de los resultados
Las concentraciones de cadmio se determinaran en
función de la curva de calibración. Los resultados de las
determinaciones se documentaran con tres decimales.
5.5.1
Criterio de aceptación y rechazo
Este método aceptara un r2 >
calibración efectuada para el análisis.
5.5.2
0.99 de la curva de
Cálculo de la incertidumbre
Se calculara según la siguiente expresión:
µ CCd = µ CM
U = µCCd k
µ (cal I) =
k=2
µ2(pp) + µ2(FR) + µ2(resol I) + µ2 (rl)
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
µ(CM) =
µ2 (cal I) + µ2 (dcal l) + µ2 (A1)
5.6 Medidas de Seguridad
•
Se recomienda utilizar guantes y mandiles.
6. FIJACION
DE
VALIDACIÓN
OBJETIVOS.
PARAMETROS
DE
PARAMETRO
Selectividad / Especificidad
Linealidad
Respuesta
/
Limite
de
/Cuantificación
Precisión
OBJETIVO ESTABLECIDO
El
método
es
selectivo/especifico
para
Cadmio
Función Ecuación
Lineal
con
coeficiente de correlación r >
0.99
detección
Cadmio: < 10 µg/L
Exactitud
Incertidumbre
Intervalo de Trabajo
SR < 10% CV en todos los
niveles
> 95% recuperación < 105%
< 5% (P = 95.45%), en todos
los niveles
0.0003 a 2.05 mg/L
TABLA 2. Objetivos de Validación.
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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7. DEL DISEÑO EXPERIMENTAL
Obtención de la función de respuesta
instrumental con seis niveles de concentración
(cinco patrones mas blanco), por quintuplicado
en cada nivel, en condiciones de repetibilidad.
DISEÑO
EXPERIMENTAL
Muestras para la
validación
Submuestras
Procesamiento
Lectura
Determinación de la exactitud (recuperación)
de materiales de referencia a cinco niveles, por
quintuplicado.
Repetición del diseño anterior en cinco días
distintos en condiciones de reproducibilidad.
Patrones de trabajo
A cinco niveles de concentración obtenidos a
partir de una sustancia pura.
Blanco de los reactivos
Materiales de Referencia
a un nivel de concentración
Cinco de cada una, preparadas cada día en
condiciones de repetibilidad.
Total: 55 por día * 5 días = 275 unidades
1. 1 x 5 = 5 blancos
2. 5 x 5 = 25 patrones
3. 5 x 5 = 25 materiales de referencia
Simultáneo de las 55 unidades cada día en
condiciones de repetibilidad
A las submuestras deberán aplicarse el
método completo
Que produce cada submuestra en el sistema
de medida (por ejemplo en miliabsorbancias)
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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Función de
respuesta
Obtenida, cada día, por regresión lineal con
las 50 parejas de x: valores asignados / y:
lecturas obtenidas, de patrones y blancos.
Determinación, cada día, del grado de ajuste y
de los intervalos de confianza de los
coeficientes de regresión y de la función de
respuesta.
Determinación de la función de respuesta
media de los cinco días y sus intervalos de
confianza.
Interpolación
y cálculos
Cada día, de las lecturas obtenidas de los
materiales de referencia.
Determinación de la exactitud en cada nivel.
Tratamiento
estadístico
Análisis de varianza simple de los resultados
obtenidos para obtención de la precisión por
niveles.
Obtención de los límites de detección y
cuantificación, del intervalo de trabajo y de la
incertidumbre asociada a cada nivel.
TABLA 3. Diseño Experimental
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8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS
8.1 Condiciones Instrumentales para la lectura de
Cadmio:
•
•
•
•
•
•
Corriente de lámpara: 210 mAmperios
Longitud de onda: 228.80 nm
Paso de la luz: 2.7 – 1.35 mm
Flujo de Aire: 10 L/min.
Flama utilizada: Aire/Acetileno
Flujo de Acetileno: 2.5 L/min.
8.2 Curvas de Calibración para Cadmio:
Día 1:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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Cd
(ppm)
0.00
0.50
Absorbancia
1.50
0.4279
/2008
0.00
0.1631
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Y = 0.282x+0.008
r2 = 0.993
Día 2:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Cd
(ppm)
0.00
0.50
Absorbancia
1.50
0.5656
Y = 0.372x + 0.012
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
0.00
0.2182
r2 = 0.996
73
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Día 3:
Cd
(ppm)
Blanco
0.00
Estándar
0.50
1
Estándar
1.50
2
Y = 0.291x + 0.010
Absorbancia
0.00
0.1713
0.4429
r2 = 0.996
Día 4:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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Cd
(ppm)
0.00
0.50
Absorbancia
1.50
0.4854
/2008
0.00
0.1872
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Y = 0.32X + 0.010
r2 = 0.996
Día 5:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Cd
(ppm)
0.00
0.50
Absorbancia
1.50
0.5575
Y = 0.367x + 0.012
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
0.00
0.2149
r2 = 0.996
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8.3 CALCULO DEL ANOVA
8.3.1 ANOVA DEL BLANCO
TABLA PARA ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Día 1
0,000
0,000
0,003
0,001
0,001
1
2
3
4
5
MEDIA
(Li)
0,001
DESVEST 0,001
Li
0,001
0,005
0,001
0,004
0,004
Día 2
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
BLANCO
Día 3
0,002
0,003
-0,001
0,000
0,002
Día 4
0,005
0,002
0,004
0,004
0,003
Día 5
0,002
0,004
0,005
0,004
0,005
0,005
0,000
0,001
0,002
0,004
0,001
0,004
0,001
(Li -L)2 5(Li -L)2
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
SDCB
0,000
=
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
(Lij - Li)2
0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
SDCW =
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
MEDIA GENERAL (L) = 0,001
DESVEST. GEN. = 0,003
ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA (BLANCO)
Grados
Origen
de
de la
libertad
varianza
(v)
(SDC)
DCM =
Repetibilidad Reproducibil
(SDC/v)
(Sr)
(SR)
(varianzas)
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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Factor de
corrección
SL2
F
F
calculado tabulado
76
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V1
Entre
=5–1
grupos
=4
V2
Dentro
= 25 –
del
5
grupo
= 20
V
Total = 25-1
= 24
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,001
0,002
0,000002868
11,243
CV = RSD = 0.658
% CV = % RSD = 65.770
Límite de Detección:
LD = B + 3s
LD = 0.01 µg Cd
Límite de Cuantificación
LC = B + 10s
LC = 0.02µ g Cd
Hipótesis Nula:
Ho = Xm1 = Xm2 = Xm3 = Xm4 = Xm5
Hipótesis Alternativa: H1 = Las medias son diferentes
α= 0.05
Toma de decisión
F calculado < F tabulado
ื Se acepta la hipótesis
nula
FALSO
las medias no son iguales
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
77
2,87
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8.3.2 ANOVA DEL PATRON
TABLA PARA ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Día 1
358,729
368,550
370,191
371,008
363,638
PATRON
Día 2
Día 3
Día 4
344,742 305,281 342,854
348,121 320,014 352,74
349,197 326,552 356,052
332,553 324,897 350,822
360,728 315,114 351,602
Día 5
348,671
351,178
352,014
354,923
350,686
1
2
3
4
5
MEDIA
(Li)
366,423 347,068 318,372 350,814 351,494
DESVEST 5,165 10,104 8,576
4,877
2,278
Li
366,423
347,068
318,372
350,814
351,494
(Li -L)2
383,726
0,055
810,124
15,838
21,717
SDCB
=
5(Li -L)2
1918,629
0,274
4050,621
79,191
108,584
59,201
4,523
14,196
21,020
7,757
(Lij - Li)2
5,411 171,364 63,362
7,972
1,108
2,697 3,709
0,100
4,532 66,919 27,437
0,270
210,691 42,581 0,000 11,755
186,590 10,612 0,621
0,654
6157,298
SDCW =
925,083
MEDIA GENERAL (L) = 346,834
DESVEST. GEN. = 17,178
ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA (PATRON)
Grados
DCM =
Factor de
Origen
Repetibilidad Reproducibil
F
F
de
(SDC)
(SDC/v)
corrección
de la
(Sr)
(SR)
calculado
tabulado
libertad
(varianzas)
SL2
varianza
(v)
V1
Entre
6,801
18,571
298,6140586 33,280
2,87
= 5 – 1 6157,298 1539,324
grupos
=4
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Dentro
del
grupo
Total
V2
= 25 –
925,083
5
= 20
V
= 25-1 7082,381
= 24
46,254
295,099
CV = RSD = 0.050
% CV = % RSD = 4.953
Hipótesis Nula:
Ho = Xm1 = Xm2 = Xm3 = Xm4 = Xm5
Hipótesis Alternativa: H1 = Las medias son diferentes
α= 0.05
Toma de decisión
F calculado < F tabulado
ื Se acepta la hipótesis
nula
FALSO
las medias no son iguales
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PLOMO
1. OBJETO
La finalidad de este registro es la obtención de los datos
necesarios para la validación del método para análisis de
Plomo (Pb) en minerales por digestión ácida mediante el
método de Espectrofotometría de Absorción Atómica.
2. ALCANCE
Este procedimiento de ensayo es aplicable en muestras
de minerales polimetálicos.
2.1 Intervalo de trabajo
El método es aplicable en el rango de 0.001 mg/L a 20
mg/L mediante diluciones.
2.2 Lavado de cristalería
Lavar la vidriería con HCl 1:1 caliente y enjuagar con
agua destilada, se recomienda reservar la vidriería
solamente para esta determinación y luego de utilizarla se
lava y se mantiene con agua destilada hasta necesitarla, así
el tratamiento con ácido será ocasional.
3. REFERENCIAS
3.1. Documentos utilizados en la elaboración
•
Manual de Procedimientos Generales del Laboratorio
“Cesemin”
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3.2. Documentos a utilizar conjuntamente
•
Instructivo de uso del espectrofotómetro.
4. GENERAL
El Plomo total corresponde a la concentración de éste
en la muestra original, tras un previo proceso de tamizado
por malla 100 y sometida a digestión ácida incluye todo el
plomo que se encuentra en la forma orgánica e inorgánica.
5. DESCRIPCION
5.1 Equipos y materiales
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Plancha calentadora
Espectrofotómetro de Absorción Atómica
Vasos de precipitación
Lunas de Reloj
Pipetas Volumétricas
Balones de Aforo
Embudos
Soportes
Termómetro
Papel Filtro
Frasco lavador
Fuelles
Espátula
Balanza
Mortero
Molino de Martillos
5.2 Reactivos
• Agua destilada
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• Acido Clorhídrico concentrado
• Acido Nítrico concentrado
• Acido Perclórico concentrado
5.3 Preparación
5.3.1 Preparación de la curva de calibración.
Medir de la solución estándar de plomo en medio nítrico
al 2% como se indica en la tabla:
Identificación de la
muestra
Blanco
Estándar 1
Estándar 2
Concentración
(mg/L)
0.0
5.0
10.0
TABLA 4. Estándares de Calibración.
Con las absorbancias y concentraciones de los patrones
se graficara la concentración en las abscisas
y al
absorbancia en las ordenadas, de este gráfico se obtendrá la
ecuación de la curva y el coeficiente de correlación aplicando
el método de regresión lineal.
5.4
Realización
DISGREGACIÓN ÁCIDA EN VASOS DE PRECIPITACIÓN.
• Pesar 200 mg. de muestra y transferir a un vaso de
vidrio.
• Añadir 5 ml. de agua + 5 ml. de HCl y dejar hervir
durante 10 minutos (350ºC)
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• Añadir 5 ml. de HNO3 + 1 ml. de HClO4 y llevar a casi
sequedad total (250ºC)
• Enfriar y colocar 5 ml. de agua + 5 ml. de HCl y disolver
la muestra en caliente.
• Enfriar nuevamente y aforar a 100 ml. (el volumen de
aforo depende de la concentración de los elementos a
determinar)
• Determinar la concentración de elementos por AA.
NOTA: Recordar hacer un blanco con los ácidos empleados
(sin muestra) (200-250ºC)
5.5 Tratamiento de los resultados
Las concentraciones de plomo se determinaran en
función de la curva de calibración. Los resultados de las
determinaciones se documentaran con tres decimales.
5.5.1
Criterio de aceptación y rechazo
Este método aceptara un r2 >
calibración efectuada para el análisis.
5.5.2
0.99 de la curva de
Cálculo de la incertidumbre
Se calculara según la siguiente expresión:
µ CCd = µ CM
U = µCCd k
µ (cal I) =
µ(CM) =
k=2
µ2(pp) + µ2(FR) + µ2(resol I) + µ2 (rl)
µ2 (cal I) + µ2 (dcal l) + µ2 (A1)
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5.6 Medidas de Seguridad
•
Se recomienda utilizar guantes y mandiles.
6. FIJACION
DE
VALIDACIÓN
OBJETIVOS.
PARAMETROS
DE
PARAMETRO
Selectividad / Especificidad
Linealidad
Respuesta
/
Limite
de
/Cuantificación
Precisión
OBJETIVO ESTABLECIDO
El
método
es
selectivo/especifico
para
Plomo
Función Ecuación
Lineal
con
coeficiente de correlación r >
0.99
detección
Plomo: < 20 µg/L
Exactitud
Incertidumbre
Intervalo de Trabajo
SR < 10% CV en todos los
niveles
> 95% recuperación < 105%
< 5% (P = 95.45%), en todos
los niveles
0.001 mg/l a 20 mg/l
TABLA 5. Objetivos de Validación
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7. ESQUEMA DEL DISEÑO EXPERIMENTAL
Obtención de la función de respuesta
instrumental con seis niveles de
concentración (cinco patrones mas
blanco), por quintuplicado en cada nivel,
en condiciones de repetibilidad.
DISEÑO
Determinación
de
la
exactitud
EXPERIMENTAL (recuperación)
de
materiales
de
referencia
a
cinco
niveles,
por
quintuplicado.
Repetición del diseño anterior en cinco
días distintos en condiciones de
reproducibilidad.
Muestras para la
validación
Patrones de trabajo
A cinco niveles de concentración
obtenidos a partir de una sustancia pura.
Blanco de los reactivos
Materiales de Referencia
a un nivel de concentración
Submuestras
Cinco de cada una, preparadas cada
día en condiciones de repetibilidad.
Total: 55 por día * 5 días = 275 unidades
1. 1 x 5 = 5 blancos
2. 5 x 5 = 25 patrones
3. 5 x 5 = 25 materiales de referencia
Procesamiento
Simultáneo de las 55 unidades cada día
en condiciones de repetibilidad
A las submuestras deberán aplicarse el
método completo
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Que produce cada submuestra en el
sistema de medida (por ejemplo en
miliabsorbancias)
Lectura
Función de
respuesta
Obtenida, cada día, por regresión lineal
con las 50 parejas de x: valores
asignados / y: lecturas obtenidas, de
patrones y blancos.
Determinación, cada día, del grado de
ajuste y de los intervalos de confianza de
los coeficientes de regresión y de la
función de respuesta.
Determinación de la función de
respuesta media de los cinco días y sus
intervalos de confianza.
Interpolación
y cálculos
Cada día, de las lecturas obtenidas de
los materiales de referencia.
Determinación de la exactitud en cada
nivel.
Tratamiento
estadístico
Análisis de varianza simple de los
resultados obtenidos para obtención de
la precisión por niveles.
Obtención de los límites de detección y
cuantificación, del intervalo de trabajo y
de la incertidumbre asociada a cada
nivel.
TABLA 6. Diseño Experimental
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8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS
8.1 Condiciones Instrumentales para la lectura de Plomo:
•
•
•
•
•
•
Corriente de lámpara: 450 mAmperios
Longitud de onda: 283.31 nm
Paso de la luz: 2.7 – 1.05 mm
Flujo de Aire: 10 L/min
Flama utilizada: Aire/Acetileno
Flujo de Acetileno: 2.50 L/min
8.2 Curvas de Calibración para Plomo:
Día 1:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Pb
(ppm)
0.00
5.00
Absorbancia
10.0
0.2008
Y = 0.020x + 0.001
0.00
0.1039
r2 = 0.999
Día 2:
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Pb
(ppm)
Blanco
0.00
Estándar 5.00
1
Estándar 10.0
2
Y = 0.019x + 0.001
Absorbancia
0.00
0.1039
0.1989
r2 = 0.999
Día 3:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
Pb
(ppm)
0.00
5.00
Absorbancia
10.0
0.2336
/2008
0.00
0.1232
88
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Y = 0.023x + 0.002
r2 = 0.999
Día 4:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Pb
(ppm)
0.00
5.00
Absorbancia
10.0
0.2422
Y = 0.024x + 0.001
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
0.00
0.1243
r2 = 0.999
89
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Día 5:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Pb
(ppm)
0.00
5.00
Absorbancia
10.0
0.2506
Y = 0.025x + 0.001
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
0.00
0.1308
r2 = 0.999
90
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ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
8.3 CALCULO DEL ANOVA
8.3.1 ANOVA DEL BLANCO
TABLA PARA ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Día 1
0,005
0,039
0,030
0,012
0,024
1
2
3
4
5
MEDIA
(Li)
0,022
DESVEST 0,014
Li
0,022
0,038
0,026
0,054
0,066
Día 2
0,042
0,028
0,029
0,037
0,054
BLANCO
Día 3
0,025
0,039
0,018
0,031
0,015
Día 4
0,054
0,062
0,052
0,054
0,046
Día 5
0,072
0,061
0,044
0,068
0,087
0,038
0,011
0,026
0,010
0,054
0,006
0,066
0,016
(Li -L)2 5(Li -L)2
0,000
0,002
0,000
0,000
0,000
0,001
0,000
0,001
0,001
0,003
SDCB
0,007
=
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
(Lij - Li)2
0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
SDCW =
0,000
0,000
0,001
0,000
0,000
0,003
MEDIA GENERAL (L) = 0,041
DESVEST. GEN. = 0,020
ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA (BLANCO)
Grados
Origen
de
de la
libertad
varianza
(v)
(SDC)
DCM =
Repetibilidad Reproducibil
(SDC/v)
(Sr)
(SR)
(varianzas)
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
Factor de
corrección
SL2
F
F
calculado tabulado
91
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ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
V1
Entre
=5–1
grupos
=4
V2
Dentro
= 25 –
del
5
grupo
= 20
V
Total = 25-1
= 24
0,007
0,002
0,003
0,000
0,010
0,000
0,012
0,021
0,000325756
13,067
CV = RSD = 0.490
% CV = % RSD = 49.028
Límite de Detección:
LD = B + 3s
LD = 0.10 µg Pb
Límite de Cuantificación
LC = B + 10s
LC = 0.24 µ g Pb
Hipótesis Nula:
Ho = Xm1 = Xm2 = Xm3 = Xm4 =
Xm5
Hipótesis Alternativa:
H1 = Las medias son
diferentes
α= 0.05
Toma de decisión
F calculado < F tabulado
nula
FALSO
Se acepta la hipótesis
las medias no son iguales
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
/2008
92
2,87
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8.3.2 ANOVA DEL PATRON
TABLA PARA ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Día 1
13788,773
13769,076
13598,743
13540,581
13319,923
Día 2
13679,740
13797,139
13626,430
13477,408
13291,994
PATRON
Día 3
14196,638
14050,624
13699,565
13699,338
13310,229
Día 4
12788,039
12635,521
12487,466
12484,286
12271,455
Día 5
14355,968
14052,162
13823,724
13796,846
13572,914
1
2
3
4
5
MEDIA
(Li)
13603,419 13574,542 13791,279 12533,353 13920,323
DESVEST 191,141
195,305
346,356
192,618
296,833
Li
(Li -L)2
5(Li -L)2
(Lij - Li)2
70609,879 34356,031 11066,577 164316,081 64864,755
13603,419 14121,976
8092,607
40463,036 27442,175 49549,335 67259,933 10438,218
13574,542
21,867 2692,344
8411,421 2105,653
13791,279 94062,142 470310,710
8453,111 2407,610
12533,353 904838,285 4524191,423 3948,639 9435,053
13920,323 189868,929 949344,646 80370,095 79833,485 231408,910 68590,772
SDCB =
6054919,695
SDCW =
189786,740
17381,575
9331,328
15246,520
120692,874
1279411,104
MEDIA GENERAL (L) = 13484.583
DESVEST. GEN. = 552.808
ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA (PATRON)
Grados
Origen
DCM =
Factor de
Repetibilidad Reproducibil
F
F
de
de la
(SDC)
(SDC/v)
corrección
(Sr)
(SR)
calculado tabulado
libertad
2
varianza
(varianzas)
SL
(v)
V1
Entre
252,924
594,914
289951,874
23,663
2,87
= 5 – 1 6054919,695 1513729,924
grupos
=4
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
93
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Dentro
del
grupo
Total
V2
= 25 –
1279411,104 63970,555
5
= 20
V
= 25-1 7334330,800 305597,117
= 24
CV = RSD = 0.041
% CV = % RSD = 4.100
Hipótesis Nula:
Ho = Xm1 = Xm2 = Xm3 = Xm4 =
Xm5
Hipótesis Alternativa: H1 = Las medias son diferentes
α= 0.05
Toma de decisión
F calculado < F tabulado
nula
FALSO
Se acepta la hipótesis
las medias no son iguales
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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CAPÍTULO 4
PROCEDIMIENTO ESPECÍFICO DE ENSAYO PARA
ANÁLISIS DE AGUA
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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CADMIO
1. OBJETO
La finalidad de este registro es la obtención de los datos
necesarios para la validación del método para análisis de
Cadmio (Cd) en agua por digestión ácida mediante el método
de Espectrofotometría de Absorción Atómica.
2. ALCANCE
Este procedimiento de ensayo es aplicable en muestras
de agua en general (Ríos, lagos en sospecha de
contaminación).
2.1 Intervalo de trabajo
El método es aplicable en el rango de 0.0003 mg/L a
2.5 mg/L mediante diluciones.
2.2 Lavado de cristalería
Lavar la vidriería con HCl 1:1 caliente y enjuagar con
agua destilada, se recomienda reservar la vidriería
solamente para esta determinación y luego de utilizarla se
lava y se mantiene con agua destilada hasta necesitarla, así
el tratamiento con ácido será ocasional.
3. REFERENCIAS
3.1 Documentos utilizados en la elaboración
Manual de procedimientos del laboratorio “Cesemin”
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
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3.2 Documentos a utilizar conjuntamente
Instructivo de uso del espectrofotómetro.
4. GENERAL
El Cadmio total corresponde a la concentración de éste
en la muestra original, tras un previo proceso de digestión
ácida incluye todo el cadmio que se encuentra en la forma
orgánica e inorgánica.
5. DESCRIPCION
5.1 Equipos y materiales
•
•
•
•
•
•
•
Plancha calentadora
Espectrofotómetro de Absorción Atómica
Vasos de precipitación
Lunas de Reloj
Pipetas Volumétricas
Balones de Aforo
Embudos
5.2 Reactivos
• Agua destilada
• Acido Clorhídrico concentrado
• Acido Nítrico concentrado
5.3 Preparación
5.3.1 Preparación de la curva de calibración.
Medir de la solución estándar de cadmio en medio
nítrico al 2% como se indica en la tabla:
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Identificación de la
muestra
Blanco
Estándar 1
Estándar 2
Concentración
(mg/L)
0.00
1.50
2.50
TABLA 7. Estándares de Calibración
Con las absorbancias y concentraciones de los patrones
se graficara la concentración en las abscisas
y al
absorbancia en las ordenadas, de este gráfico se obtendrá la
ecuación de la curva y el coeficiente de correlación aplicando
el método de regresión lineal.
5.4 Preparación de las muestras
• Del patrón de 1000 ppm de Cd tomar 2.5 ml y aforar a
250 ml.
• De esta solución tomamos 100 ml tanto para la muestra
A y B la cuales serán sometidas a la digestión ácida.
• Luego de la digestión ácida tomamos de las soluciones
anteriores alícuotas de 5; 10; 15; 20; 25 ml y aforamos a
100 ml para tener concentraciones de 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 y
2.5 ppm respectivamente.
5.5 Realización
DIGESTIÓN EN MEDIO ÁCIDO - AA
• Agitar la muestra perfectamente y transferir un volumen
exactamente medido de la misma (100 ml a 500 ml) a un
vaso de vidrio o a un frasco Erlenmeyer.
• Adicionar 5 ml de HNO3 concentrado.
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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• Llevar a evaporación sobre una plancha de
calentamiento hasta reducir el volumen a 15 ó 20 ml
evitando la ebullición.
• Enfriar, adicionar 5 ml de HNO3 concentrado, cubrir con
una luna de reloj y calentar para obtener un reflujo leve.
• Continuar el calentamiento con reflujo hasta completar la
digestión, y la obtención de un líquido incoloro o
ligeramente amarillo, si es necesario, agregar más ácido
durante este proceso.
• Enfriar, añadir 10 ml de HCL 1+1 y 15 ml de agua
destilada, calentar levemente para disolver cualquier
residuo.
• Enfriar la muestra lavar las paredes del vaso con agua
destilada y filtrar si es necesario.
• Transferir cuidadosamente el filtrado a un vaso
volumétrico y completar el volumen inicial de muestra
tomado para el análisis.
• Determinar los elementos de interés empleando los
patrones de cada elemento en un medio similar al de la
muestra.
NOTA: La determinación debe realizarse por duplicado y
además deberá prepararse un blanco apropiado con agua
destilada.
5.6 Tratamiento de los resultados
Las concentraciones de cadmio se determinaran en
función de la curva de calibración. Los resultados de las
determinaciones se documentaran con tres decimales.
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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5.6.1
Criterio de aceptación y rechazo
Este método aceptara un r2 >
calibración efectuada para el análisis.
5.6.2
0.99 de la curva de
Cálculo de la incertidumbre
Se calculara según la siguiente expresión:
µ CCd = µ CM
U = µCCd k
µ (cal I) =
k=2
µ2(pp) + µ2(FR) + µ2(resol I) + µ2 (rl)
µ(CM) =
µ2 (cal I) + µ2 (dcal l) + µ2 (A1)
5.7 Medidas de Seguridad
•
Se recomienda utilizar guantes y mandiles.
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6. FIJACION
DE
VALIDACIÓN
OBJETIVOS.
PARAMETROS
DE
PARAMETRO
Selectividad / Especificidad
Linealidad
Respuesta
/
Limite
de
/Cuantificación
Precisión
OBJETIVO ESTABLECIDO
El
método
es
selectivo/especifico
para
Cadmio
Función Ecuación
Lineal
con
coeficiente de correlación r >
0.99
detección
Cadmio: < 10 µg/L
Exactitud
Incertidumbre
Intervalo de Trabajo
SR < 10% CV en todos los
niveles
> 95% recuperación < 105%
< 5% (P = 95.45%), en todos
los niveles
0.0003 mg/l a 2.5 mg/l
TABLA 8. Objetivos de Validación
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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7. ESQUEMA DEL DISEÑO EXPERIMENTAL
Obtención de la función de respuesta
instrumental con seis niveles de concentración
(cinco patrones mas blanco), por quintuplicado
en cada nivel, en condiciones de repetibilidad.
DISEÑO
EXPERIMENTAL
Muestras para la
validación
Submuestras
Procesamiento
Lectura
Determinación de la exactitud (recuperación)
de materiales de referencia a cinco niveles, por
quintuplicado.
Repetición del diseño anterior en cinco días
distintos en condiciones de reproducibilidad.
Patrones de trabajo
A cinco niveles de concentración obtenidos a
partir de una sustancia pura.
Blanco de los reactivos
Materiales de Referencia
a un nivel de concentración
Cinco de cada una, preparadas cada día en
condiciones de repetibilidad.
Total: 55 por día * 5 días = 275 unidades
1. 1 x 5 = 5 blancos
2. 5 x 5 = 25 patrones
3. 5 x 5 = 25 materiales de referencia
Simultáneo de las 55 unidades cada día en
condiciones de repetibilidad
A las submuestras deberán aplicarse el
método completo
Que produce cada submuestra en el sistema
de medida (por ejemplo en miliabsorbancias)
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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Función de
respuesta
Obtenida, cada día, por regresión lineal con
las 50 parejas de x: valores asignados / y:
lecturas obtenidas, de patrones y blancos.
Determinación, cada día, del grado de ajuste y
de los intervalos de confianza de los
coeficientes de regresión y de la función de
respuesta.
Determinación de la función de respuesta
media de los cinco días y sus intervalos de
confianza.
Interpolación
y cálculos
Cada día, de las lecturas obtenidas de los
materiales de referencia.
Determinación de la exactitud en cada nivel.
Tratamiento
estadístico
Análisis de varianza simple de los resultados
obtenidos para obtención de la precisión por
niveles.
Obtención de los límites de detección y
cuantificación, del intervalo de trabajo y de la
incertidumbre asociada a cada nivel.
TABLA 9. Diseño Experimental
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS
8.1 Condiciones Instrumentales para la lectura de
Cadmio:
•
•
•
•
•
•
Corriente de lámpara: 210 mAmperios
Longitud de onda: 228.80 nm
Paso de la luz: 2.7 – 1.35 mm
Flujo de Aire: 10 L/min
Flama utilizada: Aire/Acetileno
Flujo de Acetileno: 2.5 L/min
8.2 Curvas de Calibración para Cadmio:
Día 1:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
Cd
(ppm)
0.00
1.50
Absorbancia
2.50
0.3464
/2008
0.00
0.2067
104
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ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Y = 0.138x + 0.000
r2 = 1
Día 2:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Cd
(ppm)
0.00
1.50
Absorbancia
2.50
0.3460
Y = 0.138x + 0.000
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
/2008
0.00
0.2058
r2 = 1
105
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Día 3:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Cd
(ppm)
0.00
1.50
Absorbancia
2.50
0.4480
Y = 0.179x + 0.001
0.00
0.2743
r2 = 0.999
Día 4:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
Cd
(ppm)
0.00
1.50
Absorbancia
2.50
0.4387
/2008
0.00
0.2664
106
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ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Y = 0.175x + 0.000
r2 = 0.999
Día 5:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Cd
(ppm)
0.00
1.50
Absorbancia
2.50
0.5914
Y = 0.237x + 0.003
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
/2008
0.00
0.3677
r2 = 0.999
107
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8.3 CALCULO DEL ANOVA
8.3.1 ANOVA DEL BLANCO
TABLA PARA ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Día 1 Día 2
0,015 -0,003
0,007 -0,003
0,002 -0,002
0,009 0,011
0,012 0,011
1
2
3
4
5
MEDIA
(Li)
0,009
DESVEST 0,005
BLANCO
Día 3
-0,020
-0,004
-0,018
-0,019
-0,020
0,003
0,007
Li (Li -L)2 5(Li -L)2
0,009 0,000
0,001
0,003 0,000
0,000
0,016 0,000
0,001
0,008 0,000
0,000
0,000 0,000
0,000
SDCB
0,002
=
-0,016
0,007
Día 4
-0,005
-0,005
-0,004
-0,015
-0,010
Día 5
-0,003
0,006
-0,002
-0,002
0,000
-0,008 0,000
0,005 0,004
(Lij - Li)2
0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000 0,000
0,000
0,000 0,000
0,000 0,000
0,000 0,000
0,000
0,000
0,000 0,000
0,000 0,000
SDCW =
0,001
MEDIA GENERAL (L) = -0.002
DESVEST. GEN. = 0,010
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ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA (BLANCO)
Grados
Origen
de
de la
libertad
varianza
(v)
V1
Entre
=5–1
grupos
=4
V2
Dentro
= 25 –
del
5
grupo
= 20
V
Total = 25-1
= 24
(SDC)
Factor de
DCM =
Repetibilidad Reproducibil
F
F
corrección
(SDC/v)
(Sr)
(SR)
calculado tabulado
SL2
(varianzas)
0,002
0,000
0,001
0,000
0,003
0,000
0,006
0,011
0,00008884
14,643
CV = RSD = -4.163
% CV = % RSD = -416.307
Límite de Detección:
LD = B + 3s
LD = 0.03 µg Cd
Límite de Cuantificación
LC = B + 10s
LC = 0.10 µ g Cd
Hipótesis Nula:
Ho = Xm1 = Xm2 = Xm3 = Xm4 =
Xm5
Hipótesis Alternativa:
H1 = Las medias son
diferentes
α= 0.05
Toma de decisión
F calculado < F tabulado
nula
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
Se acepta la hipótesis
/2008
109
2,87
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ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
FALSO
las medias no son iguales
8.3.2 ANOVA DEL PATRON
TABLA PARA ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Día 1
9,610
9,440
9,263
9,170
9,060
1
2
3
4
5
MEDIA
(Li)
9,309
DESVEST 0,219
Li
(Li -L)2 5(Li -L)2
9,309
0,019
0,095
9,867
0,177
0,883
9,410
0,001
0,006
9,077
0,137
0,684
9,570
0,015
0,076
SDCB
1,744
=
PATRON
Día 2 Día 3
10,040 8,890
10,145 9,150
9,850 9,166
9,912 10,060
9,386 9,786
Día 4
9,150
9,180
9,106
9,087
8,860
Día 5
9,740
9,785
9,646
9,417
9,260
9,867
0,292
9,077
0,126
9,570
0,224
0,091
0,017
0,002
0,019
0,062
9,410
0,490
0,030
0,078
0,000
0,002
0,231
(Lij - Li)2
0,271
0,068
0,060
0,422
0,141
SDCW =
0,005
0,011
0,001
0,000
0,047
0,029
0,046
0,006
0,023
0,096
1,758
MEDIA GENERAL (L) = 9.446
DESVEST. GEN. = 0.381
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/2008
110
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ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA (PATRON)
Grados
Origen
de
de la
libertad
varianza
(v)
V1
Entre
=5–1
grupos
=4
V2
Dentro
= 25 –
del
5
grupo
= 20
V
Total = 25-1
= 24
(SDC)
DCM =
Repetibilidad Reproducibil
(SDC/v)
(Sr)
(SR)
(varianzas)
1,744
0,436
1,758
0,088
3,502
0,146
0,296
0,397
Factor de
corrección
SL2
0,069617048
F
F
calculado tabulado
4,960
CV = RSD = 0.040
% CV = % RSD = 4.044
Hipótesis Nula:
Ho = Xm1 = Xm2 = Xm3 = Xm4 =
Xm5
Hipótesis Alternativa: H1 = Las medias son diferentes
α= 0.05
Toma de decisión
F calculado < F tabulado
nula
FALSO
Se acepta la hipótesis
las medias no son iguales
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
111
2,87
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PLOMO
1. OBJETO
La finalidad de este registro es la obtención de los datos
necesarios para la validación del método para análisis de
Plomo (Pb) en agua por digestión ácida mediante el método
de Espectrofotometría de Absorción Atómica.
2. ALCANCE
Este procedimiento de ensayo es aplicable en muestras
de agua en general (Ríos, lagos en sospecha de
contaminación).
2.1 Intervalo de trabajo
El método es aplicable en el rango de 0.001 mg/L a 20
mg/L mediante diluciones.
2.2 Lavado de cristalería
Lavar la vidriería con HCl 1:1 caliente y enjuagar con
agua destilada, se recomienda reservar la vidriería
solamente para esta determinación y luego de utilizarla se
lava y se mantiene con agua destilada hasta necesitarla, así
el tratamiento con ácido será ocasional.
3. REFERENCIAS
3.1 Documentos utilizados en la elaboración
Manual de procedimientos del laboratorio “Cesemin”
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112
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3.2 Documentos a utilizar conjuntamente
Instructivo de uso del espectrofotómetro.
4. GENERAL
El Plomo total corresponde a la concentración de éste
en la muestra original, tras un previo proceso de digestión
ácida incluye todo el plomo que se encuentra en la forma
orgánica e inorgánica.
5. DESCRIPCION
5.1 Equipos y materiales
•
•
•
•
•
•
•
Plancha calentadora
Espectrofotómetro de Absorción Atómica
Vasos de precipitación
Lunas de Reloj
Pipetas Volumétricas
Balones de Aforo
Embudos
5.2 Reactivos
• Agua destilada
• Acido Clorhídrico concentrado
• Acido Nítrico concentrado
5.3
Preparación
5.3.1 Preparación de la curva de calibración.
Medir de la solución estándar de plomo en medio nítrico
al 2% como se indica en la tabla:
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113
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Identificación de la
muestra
Blanco
Estándar 1
Estándar 2
Concentración
(mg/l)
0.0
5.0
10.0
TABLA 10. Estándares de Calibración
Con las absorbancias y concentraciones de los patrones
se graficara la concentración en las abscisas
y al
absorbancia en las ordenadas, de este gráfico se obtendrá la
ecuación de la curva y el coeficiente de correlación aplicando
el método de regresión lineal.
5.4 Preparación de las muestras
• Del patrón de 1000 ppm de Pb tomar 2.5 ml y aforar a
250 ml.
• De esta solución tomamos 100 ml tanto para la muestra
A y B la cuales serán sometidas a la digestión ácida.
• Luego de la digestión ácida tomamos de las soluciones
anteriores alícuotas de 5; 10; 15; 20; 25 ml y aforamos a
100 ml para tener concentraciones de 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 y
2.5 respectivamente.
5.5 Realización
DIGESTIÓN EN MEDIO ÁCIDO - AA
• Agitar la muestra perfectamente y transferir un volumen
exactamente medido de la misma (100 ml a 500 ml) a un
vaso de vidrio o a un frasco Erlenmeyer.
• Adicionar 5 ml de HNO3 concentrado.
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• Llevar a evaporación sobre una plancha de
calentamiento hasta reducir el volumen a 15 ó 20 ml
evitando la ebullición.
• Enfriar, adicionar 5 ml de HNO3 concentrado, cubrir con
una luna de reloj y calentar para obtener un reflujo leve.
• Continuar el calentamiento con reflujo hasta completar la
digestión, y la obtención de un líquido incoloro o
ligeramente amarillo, si es necesario, agregar más ácido
durante este proceso.
• Enfriar, añadir 10 ml de HCL 1+1 y 15 ml de agua
destilada, calentar levemente para disolver cualquier
residuo.
• Enfriar la muestra lavar las paredes del vaso con agua
destilada y filtrar si es necesario.
• Transferir cuidadosamente el filtrado a un vaso
volumétrico y completar el volumen inicial de muestra
tomado para el análisis.
• Determinar los elementos de interés empleando los
patrones de cada elemento en un medio similar al de la
muestra.
NOTA: La determinación debe realizarse por duplicado y
además deberá prepararse un blanco apropiado con agua
destilada.
5.6 Tratamiento de los resultados
Las concentraciones de plomo se determinaran en
función de la curva de calibración. Los resultados de las
determinaciones se documentaran con tres decimales.
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5.6.1
Criterio de aceptación y rechazo
Este método aceptara un r2 >
calibración efectuada para el análisis.
5.6.2
0.99 de la curva de
Cálculo de la incertidumbre
Se calculara según la siguiente expresión:
µ CCd = µ CM
U = µCCd k
µ (cal I) =
µ(CM) =
k=2
µ2(pp) + µ2(FR) + µ2(resol I) + µ2 (rl)
µ2 (cal I) + µ2 (dcal l) + µ2 (A1)
5.7 Medidas de Seguridad
•
Se recomienda utilizar guantes y mandiles.
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6. FIJACION
DE
VALIDACIÓN
OBJETIVOS.
PARAMETROS
DE
PARAMETRO
Selectividad / Especificidad
Linealidad
Respuesta
/
Limite
de
/Cuantificación
Precisión
OBJETIVO ESTABLECIDO
El
método
es
selectivo/especifico
para
Plomo
Función Ecuación
Lineal
con
coeficiente de correlación r >
0.99
detección
Plomo: < 20 µg/L
Exactitud
Incertidumbre
Intervalo de Trabajo
SR < 10% CV en todos los
niveles
> 95% recuperación < 105%
< 5% (P = 95.45%), en todos
los niveles
0.001 mg/l a 20 mg/l
TABLA 11. Objetivos de Validación
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7. ESQUEMA DEL DISEÑO ESPERIMETAL
Obtención de la función de respuesta
instrumental con seis niveles de
concentración (cinco patrones mas
blanco), por quintuplicado en cada nivel,
en condiciones de repetibilidad.
DISEÑO
Determinación
de
la
exactitud
EXPERIMENTAL (recuperación)
de
materiales
de
referencia
a
cinco
niveles,
por
quintuplicado.
Repetición del diseño anterior en cinco
días distintos en condiciones de
reproducibilidad.
Muestras para la
validación
Patrones de trabajo
A cinco niveles de concentración
obtenidos a partir de una sustancia pura.
Blanco de los reactivos
Materiales de Referencia
a un nivel de concentración
Submuestras
Cinco de cada una, preparadas cada
día en condiciones de repetibilidad.
Total: 55 por día * 5 días = 275 unidades
1. 1 x 5 = 5 blancos
2. 5 x 5 = 25 patrones
3. 5 x 5 = 25 materiales de referencia
Procesamiento
Simultáneo de las 55 unidades cada día
en condiciones de repetibilidad
A las submuestras deberán aplicarse el
método completo
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118
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Lectura
Función de
respuesta
Que produce cada submuestra en el
sistema de medida (por ejemplo en
miliabsorbancias)
Obtenida, cada día, por regresión lineal
con las 50 parejas de x: valores
asignados / y: lecturas obtenidas, de
patrones y blancos.
Determinación, cada día, del grado de
ajuste y de los intervalos de confianza de
los coeficientes de regresión y de la
función de respuesta.
Determinación de la función de
respuesta media de los cinco días y sus
intervalos de confianza.
Interpolación
y cálculos
Cada día, de las lecturas obtenidas de
los materiales de referencia.
Determinación de la exactitud en cada
nivel.
Tratamiento
estadístico
Análisis de varianza simple de los
resultados obtenidos para obtención de
la precisión por niveles.
Obtención de los límites de detección y
cuantificación, del intervalo de trabajo y
de la incertidumbre asociada a cada
nivel.
TABLA 12. Diseño Experimental
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8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS
8.1 Condiciones Instrumentales para la lectura de Plomo:
•
•
•
•
•
•
Corriente de lámpara: 450 mAmperios
Longitud de onda: 283.31 nm
Paso de la luz: 2.7 – 1.05 mm
Flujo de Aire: 10 L/min
Flama utilizada: Aire/Acetileno
Flujo de Acetileno: 2.50 L/min
8.2 Curvas de Calibración para Plomo:
Día 1:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Pb
(ppm)
0.0
5.0
Absorbancia
10.0
0.2393
Y = 0.023x + 0.002
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0.00
0.1280
r2 = 0.998
120
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Día 2:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Pb
(ppm)
0.0
5.0
Absorbancia
10.0
0.2298
Y = 0.023x + 0.001
0.00
0.1207
r2 = 0.999
Día 3:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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Pb
(ppm)
0.0
5.0
Absorbancia
10.0
0.0484
/2008
0.0
0.0253
121
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Y = 0.004x + 0.000
r2 = 0.999
Día 4:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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Pb
(ppm)
0.0
5.0
Absorbancia
10.0
0.0632
/2008
0.0
0.0334
122
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Y = 0.006x + 0.000
Día 5:
Blanco
Estándar
1
Estándar
2
r2 = 0.998
Pb
(ppm)
0.0
5.0
Absorbancia
10.0
0.2156
Y = 0.021x + 0.002
8.3 CALCULO DEL ANOVA
0.0
0.1137
r2 = 0.999
8.3.1 ANOVA DEL BLANCO
TABLA PARA ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
1
2
3
4
Día 1
0,114
0,138
0,113
0,103
Día 2
0,057
0,042
0,024
0,015
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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BLANCO
Día 3
0,203
0,333
0,304
0,251
/2008
Día 4
0,066
0,127
0,167
0,092
Día 5
0,086
0,076
0,080
0,061
123
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ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
5
0,124
MEDIA
(Li)
0,118
DESVEST 0,013
0,038
0,516
0,068
0,043
0,035
0,016
0,321
0,120
0,104
0,043
0,069
0,017
Li (Li -L)2 5(Li -L)2
0,118 0,000
0,001
0,035 0,009
0,045
0,321 0,037
0,184
0,104 0,001
0,003
0,069 0,004
0,018
SDCB
0,251
=
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
(Lij - Li)2
0,000 0,014
0,000 0,000
0,000 0,000
0,000 0,005
0,000 0,038
0,001
0,001
0,004
0,000
0,001
SDCW =
0,000
0,000
0,000
0,000
0,001
0,068
MEDIA GENERAL (L) = 0.130
DESVEST. GEN. = 0.115
ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA (BLANCO)
Grados
Origen
de
de la
libertad
varianza
(v)
V1
Entre
=5–1
grupos
=4
V2
Dentro
= 25 –
del
5
grupo
= 20
V
Total = 25-1
= 24
(SDC)
DCM =
Repetibilidad Reproducibil
(SDC/v)
(Sr)
(SR)
(varianzas)
0,251
0,063
0,068
0,003
0,318
0,013
0,058
0,123
Factor de
corrección
SL2
0,011855628
F
F
calculado tabulado
18,531
CV = RSD = 0.888
% CV = % RSD = 88.828
Límite de Detección:
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
124
2,87
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LD = B + 3s
LD = 0.48 µg Pb
Límite de Cuantificación
LC = B + 10s
LC = 1.28 µ g Pb
Hipótesis Nula:
Ho = Xm1 = Xm2 = Xm3 = Xm4 =
Xm5
Hipótesis Alternativa:
H1 = Las medias son
diferentes
α= 0.05
Toma de decisión
F calculado < F tabulado
nula
Se acepta la hipótesis
las medias no son iguales
FALSO
8.3.2 ANOVA DEL PATRON
TABLA PARA ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
1
2
3
4
5
Día 1
9,510
9,630
9,836
9,850
9,822
Día 2
9,770
9,910
9,879
9,985
9,784
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
PATRON
Día 3
7,190
7,910
8,006
7,872
8,600
/2008
Día 4
9,770
9,495
9,746
9,250
9,764
Día 5
9,950
10,160
10,253
10,170
10,112
125
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MEDIA
(Li)
9,730
DESVEST 0,152
Li
(Li -L)2 5(Li -L)2
9,730
0,079
0,394
9,866
0,174
0,868
7,916
2,351 11,756
9,605
0,024
0,122
10,129
0,462
2,312
SDCB
15,452
=
9,866
0,090
0,048
0,010
0,011
0,014
0,009
7,916
0,501
0,009
0,002
0,000
0,014
0,007
9,605 10,129
0,229 0,112
(Lij - Li)2
0,526
0,000
0,008
0,002
0,468
0,027
0,012
0,020
0,126
0,025
SDCW =
0,032
0,001
0,015
0,002
0,000
1,391
MEDIA GENERAL (L) = 9.449
DESVEST. GEN. = 0.837
ANALISIS SIMPLE DE LA VARIANZA (PATRON)
Grados
Origen
de
de la
libertad
varianza
(v)
V1
Entre
=5–1
grupos
=4
V2
Dentro
= 25 –
del
5
grupo
= 20
V
Total = 25-1
= 24
(SDC)
DCM =
Repetibilidad Reproducibil
(SDC/v)
(Sr)
(SR)
(varianzas)
15,452
3,863
1,391
0,070
16,842
0,702
0,264
0,910
Factor de
corrección
SL2
0,758680192
F
F
calculado tabulado
55,559
CV = RSD = 0.089
% CV = % RSD = 8.866
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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126
2,87
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Hipótesis Nula:
Ho = Xm1 = Xm2 = Xm3 = Xm4 =
Xm5
Hipótesis Alternativa: H1 = Las medias son diferentes
α= 0.05
Toma de decisión
F calculado < F tabulado
nula
FALSO
Se acepta la hipótesis
las medias no son iguales
Juana Monserrath Méndez Álvarez
Burgos Geovanny Gordillo Guambaña
/2008
127
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CAPÍTULO 5
CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
128
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CONCLUSIONES
El objetivo de la validación de métodos de ensayo y
calibración es demostrar que el método es apto para el
propósito previsto y que los resultados tienen una
incertidumbre aceptable.
La validación debe entregar información sobre la
representabilidad, reproducibilidad y repetibilidad del método
de ensayo así como también sobre la influencia de los
factores instrumentales, ambientales y humanos en la
incerteza de los resultados. Todo esto con el objeto de
conocer las características como el funcionamiento del
método proporcionando así confianza y seguridad de este y
los resultados que genera.
Dentro de un proceso de validación es necesaria la
aportación de evidencias que demuestren el cumplimiento de
ciertos requisitos específicos los cuales se detallan a
continuación:
•
•
•
•
•
•
•
•
Selectividad/Especificidad
Función respuesta (recta de calibrado)/Linealidad
Limite de detección
Límite de Cuantificación
Precisión
Exactitud
Incertidumbre
Intervalo de Trabajo
SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD.
La selectividad y la especificidad evalúan la
confiabilidad de las mediciones ante la presencia de
Juana Monserrath Méndez Álvarez
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/2008
129
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interferencias, la especificidad se considera un 100% de la
selectividad.
SELECTIVIDAD ESPECIFICIDAD
PLOMO
NO
NO
MINERALES
CADMIO
NO
NO
PLOMO
SI
SI
AGUAS
CADMIO
SI
SI
Basándonos en la tabla anterior se concluye que el
método para minerales no es selectivo ni específico ya que
no contamos con patrones certificados y por que las lecturas
obtenidas del material de estudio son diferentes a las
lecturas del patrón.
En el método para agua la selectividad y la
especificidad se cumplen ya que contamos con patrones de
referencia, obteniéndose lecturas similares entre si.
FUNCIÓN RESPUESTA.
Para la validación se planteó una función de respuesta
instrumental (recta de calibrado) basada en un factor de
correlación r2 > 0.99.
Luego del análisis se obtuvo los valores de este
coeficiente, los cuales se detallan en la siguiente tabla:
VALIDACIÓN EN MINERALES
DIA 1
DIA 2
DIA 3
CADMIO
m
Lo
0.282 0.008
0.372 0.012
0.291 0.010
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r2
0.993
0.993
0.996
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DIA 4
DIA 5
0.320
0.367
0.010
0.012
0.996
0.996
DIA 1
DIA 2
DIA 3
DIA 4
DIA 5
PLOMO
m
Lo
0.020 0.001
0.019 0.001
0.023 0.002
0.024 0.001
0.025 0.001
r2
0.999
0.999
0.999
0.999
0.999
VALIDACIÓN EN AGUA
DIA 1
DIA 2
DIA 3
DIA 4
DIA 5
CADMIO
m
Lo
0.138 0.000
0.138 0.000
0.179 0.001
0.175 0.000
0.237 0.003
r2
1.000
1.000
0.999
0.999
0.999
DIA 1
DIA 2
DIA 3
DIA 4
DIA 5
PLOMO
m
Lo
0.023 0.002
0.023 0.001
0.004 0.000
0.006 0.000
0.021 0.002
r2
0.998
0.999
0.999
0.998
0.999
En el proceso de validación para Pb y Cd tanto como
para minerales y agua tienen una función de respuesta o
rectas de calibrado lineales, que corresponden a un
coeficiente de correlación mayor al 0.99 planteado en los
objetivos.
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LIMITE DE DETECCIÓN.
Este parámetro se obtiene a partir de los resultados
registrados en el blanco. Los objetivos establecidos para
Plomo sea < 20 µg/L y para Cadmio sea < 10µg/L, basados
en la experiencia del laboratorio en referencias bibliográficas.
MINERALES
Cadmio
Plomo
0.01 µg Cd
0.10 µg Pb
AGUA
Cadmio
Plomo
0.03 µg Cd
0.48 µg Pb
El Límite de Detección se cumple para minerales y
agua debido a que las lecturas registradas se encuentran
bajo el limite especificado para plomo y cadmio.
LIMITE DE CUANTIFICACIÓN.
El límite de Cuantificación es la mínima concentración
del analito que se puede determinar con un nivel aceptable
de precisión (repetibilidad) y exactitud.
Al igual que para el limite de detección los objetivos
establecidos para el limite de cuantificación son para Plomo
< 20 µg/L y para Cadmio < 10µg/L.
MINERALES
Cadmio
Plomo
0.02 µg Cd
0.24 µg Pb
AGUA
Cadmio
Plomo
0.10 µg Cd
1.28 µg Pb
El Límite de Cuantificación se cumple para los dos
métodos, debido a que los datos obtenidos en el cálculo
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desarrollado son inferiores a los valores de los objetivos
planteados en los parámetros de validación.
PRECISIÓN (REPETIBILIDAD/REPRODUCIBILIDAD).
Estos parámetros se calculan mediante el análisis de
varianza (ANOVA) la cual es una potente herramienta
estadística de gran utilidad.
Para este tipo de análisis se toma en cuenta dos
valores: ENTRE GRUPOS y DENTRO DE GRUPOS, de los
cuales los valores de entre los grupos deben ser mayores a
los valores de dentro del grupo.
En nuestra validación tanto en minerales como en agua
los valores de entre grupos son mayores a los valores de
dentro del grupo para Cd y Pb, cumpliéndose con la
precisión y la repetibilidad ya que las lecturas obtenidas
tienen un grado de concordancia entre si.
Contamos con valores de reproducibilidad dentro del
laboratorio, paro estos no fueron sometidos a un análisis de
comparación con otros laboratorios.
CADMIO
Sr
Entre
grupos
MINERALES
Blanco 0,001 0,002
0,000
Patrón 6,801 18,571 1539,324
Sr
AGUA
Blanco
Patrón
SR
SR
0,006 0,011
0,296 0,397
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Entre
grupos
0,000
0,436
Dentro
grupos
0,000
46,254
Dentro
grupos
0,000
0,088
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PLOMO
Sr
Entre
Dentro
grupos
grupos
MINERALES
Blanco 0,012
0,021
0,002
0,000
Patrón 252,924 594,914 1513729,924 63970,555
Sr
AGUA
Blanco
Patrón
SR
SR
0,058 0,123
0,264 0,910
Entre
grupos
0,063
3,863
Dentro
grupos
0,003
0,070
EXACTITUD
Se establece por la comparación de los resultados
obtenidos entre los Materiales de Referencia (MRi) con los
valores teóricos. Tanto para el Cadmio como para el plomo se
planteó una exactitud > 5%.
MINERALES
Cadmio
Plomo
Objetivo establecido
> 95% recuperación <
105%
> 95% recuperación <
105%
Valor encontrado
----------------
Objetivo establecido
> 95% recuperación <
105%
> 95% recuperación <
105%
Valor encontrado
94.46%
----------------
AGUA
Cadmio
Plomo
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94.49%
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La exactitud no se cumple en la validación del método
para minerales debido a que no se contó con patrones
certificados siendo estos de gran importancia para el cálculo
de la exactitud.
Para el análisis de agua el laboratorio contaba con
patrones certificados haciendo posible el cálculo de la
exactitud, pero los valores obtenidos son los valores
esperados; esto puede ser debido a factores como la
calibración del equipo, uso de reactivos, operador, etc.
INCERTIDUMBRE.
Para calcular la incertidumbre de los resultados es
necesario identificar todas las fuentes de incertidumbre de
los términos de la expresión utilizada para calcular la
concentración de Plomo y Cadmio tanto para minerales
como para agua. La incertidumbre depende de la tolerancia y
de la precisión del material volumétrico utilizado.
En nuestro caso el cálculo de la incertidumbre para la
validación de los dos métodos no pudo realizarse debido a la
falta de parámetros indispensables, ya que el laboratorio no
posee estos documentos entre sus registros. Dichos
parámetros se detallan a continuación:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Componente debido a la calibración de la balanza y
material volumétrico,u (cal)
Componente debido a la deriva de la balanza, u (der)
Componente de la incertidumbre debido a la variación
de la temperatura durante el uso de la balanza, u(Tu)
Componente debida a la falta de repetibilidad de la
balanza y material volumétrico, u(Rep)
Incertidumbre debida a la preparación de los patrones
Contribución a la incertidumbre por el material
volumétrico empleado para realizar las disoluciones
Calibración del instrumento de medida
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INTERVALO DE TRABAJO
El intervalo de trabajo validado puede coincidir con el
que utilizamos al principio, en el estudio de la función de
respuesta, como intervalo de trabajo deseable, pero puede
haber disminuido como resultado del proceso de validación.
Normalmente estará comprendido entre el Límite de
Cuantificación y el valor asignado al mayor patrón utilizado.
MINERALES
Intervalo
de trabajo
Cadmio
Plomo
Objetivo
establecido
0.0003 - 2.5
mg/L
0.001 – 20 mg/L
Valor
encontrado
0.01 – 1.5
mg/L
0.10 – 10
mg/L
Objetivo
establecido
0.0003 - 2.5
mg/L
0.001 – 20 mg/L
Valor
encontrado
0.03 – 2.5
mg/L
0.48 – 10
mg/L
AGUA
Intervalo
de trabajo
Cadmio
Plomo
El intervalo de trabajo es aceptado ya que el valor
encontrado para cadmio y plomo en minerales y agua esta
dentro del rango establecido.
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DECLARACION DEL METODO.
Luego de realizado el proceso de validación para la
Determinación de Pb y Cd por Espectrofotometría de
Absorción Atómica aplicado a minerales y agua podemos
concluir que se cumple con la linealidad, limite de detección,
limite de cuantificación, repetibilidad e intervalo de trabajo,
parámetros que no son suficientes para declarar a los
métodos como validados, ya que los resultados del análisis
del ANOVA no están dentro del rango esperado, siendo este
un parámetro fundamental para dicha validación.
Por lo que procedemos a concluir que los métodos no
pueden ser validados debido a la falta de cumplimiento de
varios de los objetivo planteados.
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RECOMENDACIONES
1.
Obtención
de
patrones
de
referencia
con
sus
respectivos certificados de calibración.
2.
Obtención de pesas calibradas y certificadas para la
respectiva calibración de la balanza.
3.
Contar con la respectiva calibración del equipo de
Absorción Atómica
4.
Tener en consideración hasta el mínimo parámetro para
la validación, entre ellos podemos citar la temperatura,
variación de la energía de la lámpara en el equipo, y el
ruido entre otros.
5.
Establecer un óptimo almacenamiento del material para
estudio
con
la
finalidad
de
evitar
posibles
contaminaciones con el medio ambiente, considerar
también el tiempo entre la preparación y la lectura de
las muestras para que este sea el menor posible.
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BIBLIOGRAFIA:
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Medida, primera edición.
2. BONETTY, A. Moreno – JAUFFRED F. Javier.
Elementos de probabilidad y estadística.
3. BOQUÉ, Ricard – MAROTO, Alicia. Análisis de la
Varianza (ANOVA)
4. GARCIA, A. José. Analisis de Varianza (ANOVA)
5. Guías y Requisitos del Organismo de Acreditación
Ecuatoriano (OAE)
6. KENNEDY b. John – NEVILLE M. Adam. Estadística
para ciencias e ingeniería
7. Norma ISO 17025 – 2005
8. ELMER, Perkin (manual). Analytical Methods (Atomic
Absorption Spectroscopy)
9. Rodríguez G. Francisco. Validación de métodos
Analíticos
10.
VEGA,
Manuel.
Metrología:
Mediciones
importantes. (Fisica I)
PAGINAS EN INTERNET:
www.standardmethods.org
www.nlm.nin.gov/medlineplus/spanish/eney/article/
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13.
www.uam.es/departamentos/economicas/econapli/
anova - pdf
14.
www.chesniuk.com.ar/php?option=com_content&
15.
www.wikipedia.com
16.
www.epa.gov/opptintr/lead/nlic.htm
11.
12.
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