Rol del ácido hialurónico en la maduración y fecundación de

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Doctorado en Ciencias Naturales
Facultad de Ciencias Naturales y Museo
Universidad Nacional de La Plata – Argentina
Resúmenes de Tesis Doctorales
Tesis nº: 0756
Area: Zoología
Furnus, Cecilia C.. Rol del ácido hialurónico en la maduración y fecundación de ovocitos y en el
desarrollo preimplantacional de embriones de mamífero.
Director (es): Errecalde, Ana Lía; Dulout, Fernando N.
La Plata: Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo, 2000.
El ácido hialurónico (HA) es uno de los glicosaminoglicanos más abundantes en los fluidos
uterino, oviductal y folicular. La síntesis y la acumulación de HA en la matriz del complejo
ovocito-cumulus inducen la expansión del cumulus oophorus. Esta expansión o mucificación
que se correlaciona directamente con la cantidad de HA sintetizado, se produce debido al
depósito de este mucopolisacárido en una matriz organizada que facilita la captura del óvulo
por parte de la fimbria del oviducto. Por otro lado, induce cambios en los espermatozoides
durante los procesos de capacitación y reacción acrosómica antes de la fecundación. Debido a
que sólo los ovocitos que han madurado (maduración meiótica y citoplasmática) pueden ser
fecundados, desarrollar normalmente hasta el estadio preimplantacional de blastocisto y dar
origen a fetos viables, es imprescindible la presencia de precursores de la síntesis de HA, que
permitan la expansión óptima del cumulus para que se produzca la ovulación normal y para
que el óvulo pueda ser fecundado. Estudios in vitro revelaron que durante el proceso de
maduración del ovocito es fundamental la presencia de aminoacidos y sustratos energéticos ya
que se produce un aumento en la actividad glucolítica, en la oxidación de la glucosa y la
glutamina y en el metabolismo oxidativo del piruvato luego de la ruptura de la vesícula
germinal. El glutation (GSH) es un tripéptido que se forma a expensas de los aminoácidos
cisteína, ácido glutámico y glicina. En los ovocitos, el nivel de GSH intracelular constituye otro
de los factores importantes que afectan la maduración citoplasmática, tanto que se lo considera
como un indicador de la maduración. El HA además forma parte de la matriz extracelular de la
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mayoría de los tejidos animales y ejerce una profunda influencia sobre el comportamiento
celular. Está involucrado en la adhesión entre células y promueve la diferenciación de los
tejidos extraembrionarios en ratón. Se ha demostrado que retrasa la muerte y previene la
fragmentación de los ovocitos de porcino y se ha sugerido que interviene en la migración
celular durante el desarrollo embrionario temprano. El HA interactúa con las células a través de
un receptor denominado CD44 que ha sido detectado en diferentes tipos celulares y que
pertenece a un grupo amplio de proteínas (HA-binding proteins) denominadas hialaderinas.
Este receptor se expresa preferentemente en células epiteliales que tienen una división activa.
Por otro lado, el CD44 cumple también un papel esencial en la degradación de HA. La
búsqueda de sistemas de maduración, fecundación y desarrollo in vitro para cada especie
aportó gran cantidad de información sobre el rol de diversos compuestos que afectan la
ovulación, la capacitación del espermatozoide y la fecundación del ovocito maduro. Estos
sistemas, denominados de "Producción in vitro" (PIV) comprenden las etapas de maduración in
vitro (MIV), fecundación in vitro (FIV) y cultivo in vitro de embriones (CIV). Los sistemas de PIV
que han presentado mayores avances en los últimos años son el utilizado en humano, por su
aplicación para resolver problemas de fertilidad y los de especies domesticas de interes
comercial como el de Bos taurus. Además, el fácil acceso a ovarios de Bos taurus de frigorífico
lo convirtió en uno de los modelos más usados para el estudio de diversas cuestiones
relacionadas con la biología de la reproducción en mamíferos. Sobre la base de lo expuesto los
objetivos de esta tesis fueron los siguientes: 1) Poner a punto la técnica de PIV de embriones
de Bos taurus; 2) Analizar el efecto de la glutamina (GLN) (como precursor de la síntesis de
HA) sobre el grado de expansión del cumulus durante la maduración del ovocito de Bos taurus
y su relación con el metabolismo del GSH; 3) Determinar el efecto del HA durante el desarrollo
preimplantacional en embriones de mamífero, utilizando como modelo el embrión de Bos
taurus y 4) Estudiar la expresión del receptor CD44 en los distintos estadios del desarrollo.
Para la realización de los experimentos se aplicó la técnica de PIV con ovocitos obtenidos a
partir de ovarios de frigorífico de Bos taurus. Los resultados de los estudios realizados durante
la MIV nos permiten concluir que: 1) El cumulus alcanzó una expansión máxima con el
agregado de 2 mM de GLN al medio de maduración mientras que el área de expansión del
cumulus observada en presencia de 3 mM de GLN fue comparable a la obtenida con 1 mM de
GLN; 2) La presencia de 2 mM de GLN mejoró las tasas de clivaje y desarrollo embrionario
hasta el estadio de blastocisto; 3) La presencia de GLN a altas concentraciones durante la
maduración in vitro disminuyó el contenido intracelular de GSH en ovocitos y células del
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cumulus; 4) El efecto observado sobre la disminución en el nivel de GSH cuando se agregaron
3 mM de GLN al medio de MIV no modificó la tasa de desarrollo embrionario, obteniéndose
resultados similares a los observados en presencia de 1 mM de GLN y 5) El contenido GSH en
embriones de 6 a 8 células no se vio afectado con ninguna de las concentraciones de GLN
utilizadas. Por otro lado, a partir de los resultados obtenidos en los experimentos realizados
durante el desarrollo preimplantacional podemos concluir que: 1) El HA agregado al medio de
cultivo a una concentración de 1 mg/ml estimula el desarrollo de embriones de Bos taurus
obtenidos a partir de MIV/FIV hasta el estadio de blastocisto y 2) La sobrevida luego del
congelamiento y la calidad embrionaria, evaluada en número de células por blastocisto, no se
vieron afectadas por la presencia de HA en el medio de cultivo. Por último, de acuerdo a los
experimentos realizados con inmunofluorescencia para la detección del receptor CD44
podemos concluir que: 1) Los ovocitos inmaduros no reaccionaron con los anticuerpos
monoclonales anti-CD44; 2) Los ovocitos maduros y los embriones en los estadios de 2, 4, 8 y
16 células, morulas y blastocistos reaccionaron positivamente con los dos anticuerpos
monoclonales utilizados; 3) En todos los blastocistos la coloración fluorescente estuvo presente
en las células del trofoblasto, observándose un patrón de mayor intensidad en las células de la
masa celular interna; 4) El HA ingresó a las células de los embriones a partir del estadio de 2
células, pasando por los estadios de 4, 8, 16 células, mórulas y blastocistos; 5) En los
especímenes evaluados a los 5 y 15 minutos posteriores a la incubación con HA marcado no
se observó internalización del mismo sino que su ingreso en el citoplasma de las células se
hizo evidente a partir de las 4 horas y se mantuvo hasta las 24 horas y 6) Los ovocitos
inmaduros, maduros y cigotas no mostraron HA internalizado a ninguno de los tiempos
mencionados (5 y 15 minutos, 4 y 24 horas). El presente trabajo de tesis brinda evidencias que
indican que la expansión máxima del cumulus mejora la capacidad de los ovocitos de Bos
taurus para el desarrollo embrionario posterior hasta el estadio de blastocisto. Por otro lado, la
estimulación de la síntesis de hexosaminas provocada por la GLN altero los niveles del GSH
intracelular, cuando este aminoácido se agregó al medio de MIV a altas concentraciones, sin
afectar el desarrollo embrionario posterior. La recuperación de los niveles de GSH intracelular
en embriones de 6 a 8 células derivados de ovocitos madurados en presencia de altas
concentraciones de GLN sugiere que los ovocitos con bajo nivel de GSH podrián recuperar los
niveles 'normales' luego de la maduración. Este estudio también brinda evidencias que indican
que la expansión óptima del cumulus in vitro es en parte dependiente de la producción de
hexosaminas, así como del contenido intracelular de GSH. Además, los resultados presentados
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demostraron que el HA promueve el desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocisto sin
que la calidad embrionaria, medida en términos del número de células por blastocisto y de la
sobrevida de los embriones al congelamiento y descongelamiento, se vea afectada. En el
presente trabajo se observa que el CD44 se expresa en el ovocito maduro, en la cigota y en el
embrión preimplantacional de Bos taurus y que el HA se internaliza para incorporarse al interior
del citoplasma de la células. En consecuencia, todas las evidencias obtenidas sugieren que el
HA no solo tendría un papel importante en la etapa de maduración del ovocito, sino también en
el desarrollo preimplantacional del embrión de mamífero y que su acción estaría regulada por el
CD44.
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