Biotecnología Vegetal 2010 Transformación

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Biotecnología Vegetal 2010
Transformación
Introducción de ADN foráneo en células vegetales
Sistemas basados en vectores biológicos
• Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
y Agrobacterium rhizogenes
• Sistemas basados en virus vegetales
Sistemas de transferencia física
• Transformación por bombardeo con
micropartículas
• Transformación de protoplastos por fusógenos
y/o cationes divalentes
• Transformación de protoplastos
por electroporación
•“Whiskers” de siliconas
• Microinyección
• Electroporación de tejidos enteros
TRANSFORMACION CON AGROBACTERIUM
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium ataca a un amplio rango de huéspedes, a la mayoría de
las dicotiledóneas, y con baja eficiencia a varias monocotiledóneas
Tumor provocado por A.tumefaciens
Los tumores aparecen asociados
a heridas
Células aisladas de los tumores
siguen creciendo en ausencia de la
bacteria
Células aisladas de los tumores
siguen creciendo en ausencia de
hormonas
Células aisladas de los tumores
producen grandes cantidades de
opinas
La formación del tumor está asociada
con la presencia de un megaplásmido
Ciclo de la enfermedad de la agalla de corona causada por
Agrobacterium tumefaciens
Mapa genético del plásmido Ti de octopina
Ti 200-800 kpb
Región T entre 20 y 80 kpb
La región T
La región T está definida por dos repeticiones directas de 25 pares
de bases altamente homólogas
El borde derecho es imprescindible, el izquierdo no
Sistema de dos componentes para reconocer células vegetales susceptibles
Procesamiento de la hebra T y formación del complejo T maduro
El complejo T esta compuesto de una
cadena simple de ADN-T cubierta por
proteína VirE2. Una única molécula de
proteína VirD2 se halla unida
covalentemente al extremo 5’ del DNA.
Se estima que se requieren 600
moléculas de VirE2 para recubrir los 20
kb del ADN-T.
Transporte del complejo T
Procesos celulares y factores en la planta
La integración del ADN-T al genoma de la célula vegetal involucra el apareamiento
no homólogo entre éste y el ADN cromosómico
Agrobacterium tumefaciens aprovecha los mecanismos de defensa
de la planta
Resumen de los mecanismos implicados en la transformación por
Agrobacterium tumefaciens
Vectores basados en el plásmido Ti
Síntesis de hormonas
y opinas prescindible
cointegrados
binarios
Ejemplos de vectores binarios
Optimización en el diseño de los vectores binarios
Vector
Tamaño
(kb)
Sitios
únicos de
restricción
en ADN-T
LacZ
Selección
bacteriana
Marcador
de
selección
en:
pBIN19
11777
9
Si
Kanamicina
pC22
17500
2
No
pGA482
13200
7
pPCV001
9200
pCGN1547
Origen de replicación
Mobilización
Agrobacterium
E. coli
BD
pRK2
pRK2
Si
Ampicilina,
estreptomicina y
espectinomicina
BD
pRi
ColE1
Si
No
Tetraciclina
BD
pRK2
ColE1
Si
6
No
Ampicilina
BD
pRK2
ColE1
Si
14440
5
Si
Gentamicina
BI
pRi
ColE1
Si
pJJ1881
25700
4
No
Tetraciclina
BI
pRK2
pRK2
Si
pPZP111
8909
9
Si
Cloranfenicol
BI
pVS1
ColE1
Si
pGreen0029
4632
18
Si
Kanamicina
BI
pSa
pUC
No
Tomado de: Hellens y Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.
Genes para la selección de transformantes
Gen de selección
Producto genético
Fuente
Selección
nptII
Neomicina fosfotransferasa
Tn5
Kanamicina, G418,
paromomicina, neomicina
Ble
Resistencia a bleomicina
Tn5 y Streptoalloteichus
hindustanus
Bleomicina, fleomicina
dhfr
Dihidrofolato reductasa
Plásmido R67
Metotrexato
cat
Cloranfenicol acetil
transferasa
Fago p1Cm
Cloranfenicol
Higromicina fosfotransferasa
E. coli
Higromicina B
SPT
Estreptomicina
fosfotransferasa
Tn5
Estreptomicina
aacC3, aacC4
Gentamicin-3-Nacetiltransferasa
Serratia marcescens;
Klebsiella pneumoniae
Gentamicina
Fosfinotricin acetil
transferasa
Streptomices
hygroscopicus
Fosfinotricina, bialofos
5-enolpiruvilshikimato-3fosfato sintasa
Petunia hybrida
Glifosato
aphIV
bar
EPSP
Genes para la selección de transformantes
Gen selector
Producto genético
Fuente
Selección
bxn
Bromoxinil nitrilasa
Klebsiella ozaenae
Bromoxinil
psbA
Proteína Qn
Amaranthus hybridus
Atrazina
tfdA
2,4-D monooxigenasa
Alcaligenes eutrophus
Ácido 2,4
diclorofenoxiacético
Dihidroxipicolinato sintasa
E. coli
S-aminoetil L-cisteína
AK
Aspartato kinasa
E. coli
Alta concentración de
lisina y treonina
sul
Dihidropteroato sintasa
Plásmido R46
Sulfonamida
Acetolactato sintasa
Arabidopsis thaliana
Herbicida sulfonilurea
Triptofano decarboxilasa
Catharanthus roseus
4-metil triptofano
Manosa 6P-isomerasa
E. coli
Manosa 6P
DHPS
Csrl-l
tdc
manA
PROTOCOLOS DE TRANSFORMACION
Totipotencialidad
Desdiferenciación
Rediferenciación
Transformación mediante cocultivo de Agrobacterium tumefaciens
y discos de hojas de tabaco
A
B
C
D
Transformación mediante co-cultivo de Agrobacterium tumefaciens y
cotiledones de soja
A
cotiledón con heridas
E
inducción de tallos
+ higromicina
B
inducción de tallos
- higromicina
F
C
inducción de tallos
+ higromicina
G
enraizamiento
+ higromicina
transplante
Transformación de Arabidopsis thaliana mediante Agrobacterium
tumefaciens usando la técnica de inmersión floral
plantas de
Arabidopsis
florecidas
recolección de
semillas
inmersión de las
flores en la
solución de
infiltración con
Agrobacterium
selección de
semillas en placa
Transformación transitoria de Nicotiana benthamiana por agroinfiltración
GENES REPORTEROS
Genes reporteros
Genes reporteros
Abreviatura
Origen
Detección
β-glucuronidasa
gus/uidA
E. coli
Fluorométrico (cuantitativo)
o histoquímico (in situ),
no radiactivo
Proteína de fluorescencia
verde
GFP
Aequorea victoria
Fluorescencia,
no destructiva
Cloranfenicol
acetiltransferasa
Cat
E. Coli
Ensayo radiactivo
sensitivo, semi cuantitativo
Luciferasa
Luc
Photinus pyralis
Luminiscencia
Luciferasa
luxA, luxB
Vibrio harveyi
Luminiscencia
Uso de GFP para estudiar el desarrollo de la raíz
Uso de GFP para seguir la transformación de Brachypodium distachyon
semillas esterilizadas
embriones inmaduros
cultivo en medio de proliferación con auxina
2+2+1 semanas
proUbq1/intron
GFP
tNOS pro35S
HPT
tNOS
RB
LB
incubación con Agrobacterium+acetosiringona
2 días
paso a medio con auxina, higromicina y antibiótico
2+2 semanas
Ventaja: no invasivo, se puede seguir in vivo
Uso de GFP para seguir la transformación de Brachypodium distachyon
3 semanas en medio de regeneración (-aux+citoquinina)
+ higromicina + antibiótico
medio de germinación (-aux-citoq)
- higromicina + antibiótico
análisis de la progenie
Uso del gen uidA (β-glucuronidasa) de E.coli
embriones de arroz
• La proteína Gus es estable y conserva su
actividad cuando es fusionada a otras
proteínas.
• La detección de la actividad Gus es muy
sensible.
• La reacción históquímica es destructiva
por lo tanto el ensayo no puede realizarse
en tejido vivo.
vasculatura de Arabidopsis
SISTEMAS DE TRANSFERENCIA DIRECTA
El rango natural de hospedantes de Agrobacterium es un factor limitante en la
transformación de monocotiledóneas y algunas dicotiledóneas que no presentaban
susceptibilidad a la bacteria. En consecuencia, se desarrollaron métodos alternativos
de transferencia de ADN basados en procedimientos de naturaleza química,
fisicoquímica, o mecánica.
Estos nuevos métodos son conocidos como de transferencia directa por transferir
ADN desnudo sin la mediación de vectores biológicos.
Sistemas de transferencia directa de ADN
Transferencia por bombardeo de micropartículas o biobalística
Transferencia mediada por policationes (PEG, PVP) y/o fusógenos lipídicos
Transferencia mediada por electroporación
Transferencia con whiskers de carburo de silicio
Transferencia por microinyección
Sistemas de transferencia directa de ADN
Ventajas
• Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos
vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal
• No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas
transgénicas
• Requieren construcciones más simples y pequeñas
• Son apropiados para estudios de expresión transitoria
Desventajas
• Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y
del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas
• Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de rearreglos en los
transgenes
La biobalística puede utilizarse con diversos fines experimentales
- Transferencia de genes a células, tejidos y órganos
vegetales
- Transferencia de genes a microorganismos y
organelas
- Estudio de expresión transitoria
- Análisis de promotores y de delección de genes
- Estudio de mecanismos de expresión y regulación
de genes
- Estudio de infecciones virales
- Transferencia de ARN viral
- Estudio de vías metabólicas
- Estudio del desarrollo de plantas
Aceleración de micropartículas
Acelerador de micropartículas PDS 1000/He®
por descarga de helio a alta presión
Modelo comercial actual
Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
Interruptores de control
Medidor de vacío
Portador del disco
de ruptura
Portador del
macroproyectil
Ensamblaje del propulsor
de microproyectiles
Cámara de
bombardeo
Células blanco
Soporte del blanco
Válvula de medición
de helio
Controles del flujo
de aire y de vacío
1. Adsorción de ADN a micropartículas
Au
W
2. Disparo
Adaptado de: Hagio, JARQ,1994.
Promotores constitutivos usados en transformación de
cereales por biobalística
Promotor
Actividad relativa en
células de cereales
Uso en cereales
transgénicos
35S
Baja
Arroz
Maíz
Pasturas
35S-Adh1
intrón 1
Baja
Maíz
Avena
Trigo
Emu
Moderada
Caña de
azúcar
Arroz
Act1-Act1
intrón 1
Moderada
Arroz
Ubi1-Ubi1
intrón 1
Alta
Trigo
Cebada
Arroz
Adapatado de: Christou. Plant Molecular Biology Manual, 1995.
• La transformación por
biobalística no requiere
construcciones genéticas
especiales. En algunos casos, se
ha obtenido mayor eficiencia de
tansformación cuando los
plásmidos son linealizados.
• El promotor constitutivo más
ampliamente utilizado para inducir
la expresión de genes en
dicotiledóneas es el promotor 35S
del Cauliflower Mosaic Virus
(CaMV). En monocotiledóneas se
utilizan promotores como el del
gen ubi1 (ubiquitina) de maíz y el
del gen act1 (actina) de arroz.
Expresión transitoria del gen reportero uidA en explantos bombardeados
con micropartículas
piel de cebolla
hojas
Tipos de explantos utilizados para experimentos de transformación
A
B
C
D
E
F
M
P
Adaptado de: Hansen and Wright, Trends in Plant Science, 1999
A y B: callos de maíz. C: brotes de maíz. D y E: callos y brotes
de soja. F: ápice de una plántula de algodón de 4 días (M:
meristema apical y P: primordio foliar)
QTLs
Variación cuantitativa
Un carácter cuantitativo es aquel para el que la diferencia fenotípica
media entre genotipos es pequeña comparada con la variación entre
individuos dentro decada genotipo.
VP=VG+VE
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