Tecnicas anaiticas en Toxicologia-03-11-09
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Técnicas analíticas en toxicología Ana María López Parra Departamento de Toxicología y Legislación Sanitaria. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid (UCM) “Ciencia que estudia las sustancias químicas y los fenómenos físicos en cuanto son capaces de producir alteraciones patológicas a los seres vivos, a la vez que estudia los mecanismos de producción de tales alteraciones y los medios terapéuticos para contrarrestarlas, así como los procedimientos para detectar, identificar y determinar tales agentes y valorar el riesgo que representan” » (M. Repetto 1981/2009) • 1 ÁREAS BÁSICAS Biología Bioquímica Química Fisiología Farmacología Patología Medicina Legal TOXICOLOGÍA ÁREAS FUNDAMENTALES Mecanística Analítica Humana Veterinaria RAMAS APLICADAS Forense Tox. Reguladora General Docencia Investigación Clínica Órgano específica Alimentaria Evaluación Toxicol. Farmacéutica Eval. Riesgo Ecotoxicología Ambiental Ocupacional -Toxicología Analítica -Química Analítica Urgencia en el resultado Anamnesis Muestras biológicas Concentración del producto Determinación del tóxico Instalaciones • 2 Diagnóstico clínico Diagnóstico biológico Diagnóstico químico • 3 Estudio de las constantes o parámetros biológicos y bioquímicos Biomarcadores de exposición Biomarcadores del efecto Biomarcadores de susceptibilidad Experimentación con animales y vegetales Ensayos inmunológicos y radioinmunológicos El análisis químico-toxicológico es el conjunto de procesos analíticos que tienen por objeto el aislamiento, identificación y determinación cuantitativa de los tóxicos, tanto en el vivo como en el cadáver, con el fin de permitir el diagnóstico de la intoxicación. • Modalidad Judicial • Modalidad Clínica • Modalidad Ambiental • 4 • • • • • • • • • • • Contenido gástrico Sangre Orina Humor vítreo Hígado Cerebro Riñón Bilis Pelo Saliva Meconio Contenido gástrico -Vómito, aspirado gástrico y lavados gástricos. -En el caso de los lavados gástricos, primer lavado (500 ml). -Puede ser necesario procedimientos de homogenización, filtración y/o centrifugación. -No representa grado de intoxicación (tóxico no absorbido). -Se pueden encontrar tabletas o cápsulas, o tóxico sin metabolizar. Sangre -Es una de las muestras más útiles para la identificación y especialmente para el análisis cuantitativo. -La sangre total y el plasma son las muestras más representativas. -Recoger la muestra en tubos con fluoruro sódico como anticoagulante. -Si se sospecha de intoxicación con plomo, utilizar EDTA. • 5 Orina -Ensayos preliminares en el screening de tóxicos. -Para drogas de abuso. -La concentración de un tóxico puede llegar a ser 100 veces mayor que en la sangre. -Exenta de proteínas. -Se debe de tomar antes del tratamiento. -Como mínimo 50 ml. -No añadir conservantes. -Desventaja: Tóxicos que se eliminan en su totalidad como metabolitos comunes. Humor vítreo. -Fácil accesibilidad -Volumen suficiente (casi 2 ml por ojo) -No muchas proteínas -Protegido de circulación general -Pocas enzimas -Resistente a la contaminación bacteriana -Drogas y alcohol Hígado -Niveles de tóxicos superiores a los de la sangre. -Especialmente útil cuando no se puede disponer de sangre. -Evitar contaminación por bilis. -Evitar añadir conservantes. • 6 Otros tejidos y fluidos biológicos -Cerebro: especialmente casos de inhalación. -Riñón: especialmente en intoxicaciones por metales y tóxicos que se acumulan en riñones. -Bilis: Tóxicos que se eliminan por vía biliar. En sobredosis por opiáceos se acumulan altas concentraciones de glucurónidos. Pelo -Tóxicos minerales -Detección de drogas de abuso en consumidores crónicos. -Exposición prenatal -Refleja el estado promedio de los elementos minerales del organismo durante su crecimiento. Saliva. -Correlación de los análisis séricos con drogas de abuso y psicofármacos. Drager DrugCheck™ Kit Drug Testing in Oral Fluid–Evaluation of Sample Collection Devices Journal of Analytical Toxicology Vol. 32: 393- 401, (2008) • 7 Meconio. -Meconio: líquido amniótico, moco, lanugo, bilis y células que se han desprendido de la piel y del tracto intestinal. -Identificación de drogas durante la gestación. Muestras envenenadas, fortificadas o reforzadas Muestras certificadas o estándares de referencia B.O.E. DEL 23 DE DICIEMBRE DE 1.996 28654 ORDEN de 8 de noviembre de 1.996 por la que se aprueban las normas para la preparación y remisión de muestras objeto de análisis por el Instituto de Toxicología. • 8 TOXICOS DESCONOCIDOS • Un recipiente con estómago y su contenido, y además vómitos y los lavados gástricos que en el tratamiento de urgencia se hicieran con agua sola. • Un frasco seco con sangre en cantidad de unos 50 ml. • Un frasco de orina; toda cuanta sea posible extraer. • Un recipiente con aproximadamente 100 g de cerebro. • Un recipiente con hígado (aproximadamente 100 g) y vesícula biliar. • Un recipiente con una cuña renal de aproximadamente 100 g. • Un recipiente con aproximadamente 100 g de pulmón. • Si se sospecha de intoxicación por arsénico, plomo, berilio, talio, estroncio, uranio y fluor, deberán remitirse muestras de uñas, cabellos o huesos. -Desinfección del instrumental -Desinfección de la piel -Cantidad de sangre que se debe extraer -Frasco para remitir la muestra -Aditivos conservadores -Etiquetado -Documentación -Sangre de cadáveres • Tapones PTFE (polytetrafluoroethylene) • Evitar frascos con cámaras de aire en el caso de tóxicos gaseosos o volátiles • Etiquetas • No conservantes excepto – Fluoruro sódico – Formol • 9 • Polvos, nieblas, gases y vapores recogibles sobre filtros de soportes sólidos • Gases y vapores recogibles mediante frascos lavadores • Vapores orgánicos absorbibles en tubos de carbón activo. • Muestreo de aguas • Comprimidos AIRE • Restos vegetales • Residuos AGUA en una taza, vaso , etc • Alimento • Bebida • Envase de una conserva ALIMENTOS • Aire urbano SUELO • Recinto • Ecosistema Factores que intervienen: Luz Temperatura Hidrólisis Oxidación Descomposición biológica • 10 Se sospecha de un determinado tóxico: 1. Separación del medio. 2. Técnicas de identificación directas (sin separación). No se sospecha de ningún tóxico concreto: 1. Separación o extracción del tóxico de la muestra problema. 2. Fraccionamiento del extracto. 3. Purificación de los extractos obtenidos. 4. Detección de la sustancia xenobiótica. 5. Identificación del tóxico. 6. Determinación o valoración cuantitativa. Extracción: Conceptos • La extracción es una técnica de separación o aislamiento que se puede aplicar a todo tipo de mezclas, ya sean éstas sólidas, líquidas o gaseosas. • La extracción se basa en la diferencia de solubilidad de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado. • La forma más simple de realizar una extracción consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de manera que uno de los componentes se disuelva y los demás no. • 11 Extracción clásica Líquido-Líquido • Disolvente apolar • Disolvente polar • Partícula apolar • Partícula polar • Los componentes de la mezcla se distribuyan entre los dos disolventes según su coeficiente de reparto, que está directamente relacionado con la solubilidad de cada compuesto. Criterios para elegir método de extracción • • • • • • Selectividad Rendimento Tiempo Seguridad Coste Posibilidad de automatización Finalidad: Aislamiento y purificación del tóxico Concentración del tóxico en el extracto obtenido Parte de la muestra se reserva íntegra Desde el punto de vista analítico los tóxicos se dividen en: – Tóxicos volátiles – Tóxicos gaseosos – Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles – Tóxicos inorgánicos o minerales • 12 • Aquellos que se volatilizan por debajo de los 100ºC, por lo cual son arrastrados por el vapor de agua cuando ésta destila (alcohol etílico, alcohol metílico, benceno, fenoles, ...). Las técnicas son: -Destilación simple. -Destilación fraccionada. -Destilación directa al vacío. -Destilación por arrastre en corriente de vapor. -Microdifusión. -Técnica de “espacio en cabeza” ("head space" ). • Muestra • problema • Tóxico • volátil • extraído • 13 • Separación según puntos de ebullición • Camara • de • Conway 1. La muestra se deposita en un vial cerrado con tapón perforable, en el que se deja una cámara de aire. 2. Se calienta a 60ºC durante 30 minutos. 3. Se extrae con una jeringa para gases una muestra de la parte superior del frasco para inyectarla en un cromatógrafo de gases. • 14 • Se denominan tóxicos gaseosos a todas aquellas sustancias que a temperatura ambiente se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo: CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2. • Las técnicas son: -La extracción de gases en sangre se basa en leyes físicas, según las cuales su solubilidad disminuye elevando la temperatura o disminuyendo la presión. -Mediante las mismas técnicas que para los tóxicos volátiles. -Cromatografía de gases: técnica de separación tanto para tóxicos gaseosos como volátiles. In the animation below the red molecules are more soluble in the liquid (or less volatile) than are the green molecules. • 15 • Cromatografía de gases (GC) • Técnica de separación. • Se basa en la diferente velocidad con que se mueven los solutos a través de un medio poroso arrastrados por un disolvente en movimiento. Cromatografía de gases (GC) • 16 Ventajas e inconvenientes • Costoso. • Personal especializado. • Técnica muy sensible, fiable y rentable para determinaciones cualitativas (casi la totalidad de los tóxicos) y cuantitativas (límite de sensibilidad 1-5 µg/ml.) . • Posibilidad de derivatización (obtener un compuesto intermedio a partir de una sustancia no volátil) hace su aplicación prácticamente universal. • 17 Sustancias orgánicas y no volátiles. Se incluyen: *Tóxicos de origen vegetal (glucósidos, aceites esenciales, alcaloides, etc) *Productos de síntesis (medicamentos). Sin o con tratamiento previo de la muestra (desproteinización y liberación de conjugados) Fase A. Extracción: -con disolvente apolar -con disolvente polar (etanol): técnica de Stas-Otto. Fase B. Purificación del extracto. Fase C. Fracionamiento del extracto, para grupos: - ácidos - básicos - neutros Las técnicas son: -Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad que tiene la corriente eléctrica de descomponer las sales de los tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polo negativo y el resto al polo positivo. -Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicas son absorbidas por la resina y luego son eluidos con solventes apropiados. • 18 Extracción en fase sólida Estos tóxicos se encuentran en el organismo firmemente unidos a albúmina, lípidos o glúcidos, siendo requisito la destrucción de la materia orgánica para poder realizar su análisis. • 19 1. Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucción de la materia orgánica y la consiguiente liberación del tóxico. a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleando ácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, etc. b) Destrucción de materia orgánica por vía seca (calcinación). c) Formación de complejos y posteriormente se separa con disolventes orgánicos. Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, para obtener una muestra más apropiada. Existen métodos que no precisan la destrucción de la materia orgánica como: *Diálisis. *Ultrafiltración. *Electrodiálisis. *Desproteinización. 2. Marcha posterior de extracción Dos etapas: 1. Rastreo o detección rápida: -Técnicas de inmunoensayo -Cromatografía en capa fina 2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas. -Técnicas cromatográficas. • 20 Fundamento: Reacciones antígeno-anticuerpo. Se basan en la competencia por un anticuerpo de tóxico marcado frente al tóxico sin marcar de la muestra problema. Se aplica especialmente para drogas de abuso y psicofármacos. Tóxico libre + AC Tóxico libre-AC Tóxico marcado Tóxico marcado 1. Radioinmunoensayo (RIA): isótopo radioactivo. 2. Enzimoinmunoensayo: enzima. -ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas -EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas 3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluoróforo. 4. Inmunoanálisis por interacción cinética de partículas (KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar agregados de micropartículas. • 21 Reacciones cruzadas Cromatografía en capa fina (CCF) Cromatografía en capa fina (CCF) • 22 2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas. -Técnicas cromatográficas. Fundamento: capacidad que tienen las moléculas y los átomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda utilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambios energéticos en su estructura (en los átomos transiciones electrónicas y en las moléculas movimientos electrónicos) • 23 1. Al aplicar energía, el átomo absorbe 2. El electrón exterior es inducido a moverse a un orbital menos estable, estado excitado = estado provocado. Emisión 4 2 1 3 3. Retorno a su estado fundamental. Absorción 4. El electrón emitirá energía radiante equivalente a la cantidad de energía inicialmente absorbida = estado espontáneo La longitud de onda de la energía radiante emitida esta directamente relacionada a la transición electrónica producida y es específica. Los procesos de: 1 excitación = absorción 4 Decaimiento= emisión Pueden ser medidos E* Luz incidente Fluorescencia emitida E Lámpara de cátodo hueco Sistema atomizador Sistema monocromador Sistema detector La emisión de una energía electromagnética de longitud de onda determinada, se hace incidir sobre un átomo libre en estado fundamental, este átomo absorbe la energía y con lo que pasa a un estado excitado. • 24 Lámpara de cátodo hueco La lámpara produce líneas específicas del cátodo con el que se la diseña. El cátodo debe de ser buen conductor de la corriente Siempre se precisa atomizar la muestra. Hay dos procedimientos: Atomización con llama Muestras líquidas y gases Atomización sin llama Horno con cámara de grafito Muestras sólidas y líquidas Atomización con llama El atomizador consiste en un mechero con cabeza larga y estrecha que sirve de paso óptico para la muestra (b) La muestra se aspira dentro de la llama. El nebulizador controla el flujo de muestra y la nebuliza. Cámara de mezclado La cámara de mezclado, asegura que la muestra se mezcla con el fuel y el oxidante, antes de entrar en el interior de la llama nebulizador • 25 Horno de grafito Atomización sin llama purga de gas inyector-muestra Paso óptico tubo grafito agua de refrigeración HORNO DE CÁMARA DE GRAFITO E* Luz emitida E • 26 Volatilización Ionización 2.Aceleración iones 3. Separación 4. Detección Técnica cualitativa y cuantitativa. Separa partículas moleculares o atómicas según su masa. Técnica cualitativa y cuantitativa. Análisis de fragmentos moleculares. Determinación de la estructura molecular. Su principal aplicación es la identificación de sustancias desconocidas Cromatografía de gases: espectrómetro de masas (CG-EM). • 27 ICP: Plasma de acoplamiento inducido Cromatografía de líquidos Cromatografía de gases • 28 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) fase móvil v/s fase estacionaria • 29 Tiempo de retención Polaridad • 30 • Electroforesis capilar • Capilar con polimero • Laser Argon • 50-100 µm x 27 cm • + • Ventana del capilar • - • Separación de moléculas • Anodo • Catodo • 5-20 kV • Datos pasan al equipo cIEF Methodology (Sample Loading) • 31 cIEF Methodology (Focusing) 1. Momento de la toma de la muestra 2. Estabilidad del compuesto en la muestra y homogeneidad de ésta 3. Amplitud y reproducibilidad del método analítico 4. Interferencias en el método analítico No se detecte el tóxico • Defectos operatorios • Desaparición del tóxico del cuerpo del intoxicado • 32 Factores que intervienen: Soporte estadístico Sensibilidad Exactitud Confusión valores Diferencias individuales Metabolitos activos e inactivos • http://www.chem.wits.ac.za/chem212-213-280/0%20Introduction%20-%20Lecture.ppt 1. 2. 3. 4. 5. Capacitación del personal del laboratorio Cadena de custodia Métodos Normalizados Sustancias certificadas Programas de control y de garantía de calidad internos • 33 • 34
