(Phaseolus acutifolius) SOBRE - Universidad Autónoma de Querétaro

EVALUACIÓN DEL EFECTO APOPTÓTICO DE UNA FRACCIÓN RICA EN
LECTINAS DE FRIJOL TÉPARI (Phaseolus acutifolius) SOBRE CELULAS DE
CANCER DE MAMA
(1)
Rivera Reyes R (1), Ángeles Zaragoza MV(2), García Gasca T(2)*
Facultad de Ciencias Químicas. (2) Facultad de Ciencias Naturales.
Universidad Autónoma de Querétaro. *tggasca@yahoo.com.mx
RESUMEN
Las propiedades de moléculas con potencial nutracéutico, como las lectinas encontradas en el
frijol, son una fuente importante de investigación para entender y tratar enfermedades como el
cáncer. Estudios previos han mostrado que el frijol tépari contiene al menos una lectina con
efecto citotóxico diferencial sobre células de cáncer humano. El objetivo del presente trabajo fue
determinar si el efecto citotóxico observado sobre células de cáncer de mama está relacionado
con apoptosis. En la fracción rica en lectina se encontró la presencia de 2 glicoproteinas con
pesos moleculares aproximados 31 y 45 kDa mediante SDS-PAGE teñidos mediante reactivo de
Schiff. La actividad aglutinante específica fue de 10,578 UA/mg de proteína. Al evaluar el efecto
citotóxico de la fracción rica en lectina de fríjol tépari en células de cáncer de mama Zr-75-1 se
observó efecto citotóxico al disminuir la tasa de proliferación celular en función de la
concentración. Posteriormente se determinó la concentración inhibitoria 75 y se utilizó para
tratar cultivos preconfluentes de células y extraer el ADN para observar el perfil de degradación
de ADN. Se encontró que las células tratadas presentaron un barrido con fragmentos de bajo
peso molecular, por lo que no fue posible afirmar que se esté llevando apoptosis pero tampoco es
posible descartarlo, ya que el perfil observado puede ser resultado de un proceso apoptótico
tardío. Estudios futuros se encargarán de evaluar el efecto de la fracción rica en lectina a
diferentes tiempos de tratamiento con la finalidad de observar adecuadamente el mecanismo de
muerte celular.
Palabras clave: apoptosis, cáncer de mama, frijol, lectinas, Phaseolus acutifolius
INTRODUCCION
El cáncer es una enfermedad crónico-degenerativa que continúa extendiéndose en nuestro país y
en el mundo. Las características de las células cancerígenas les permiten formar tumores y
emigrar a otras partes del cuerpo, haciendo del cáncer una enfermedad muy agresiva en algunos
casos (Ripa Saldías, 2005). Por otro lado, las semillas de algunas legumbres han sido estudiadas
por contener compuestos activos capaces de regular el inicio y desarrollo de esta enfermedad.
Este es el caso del frijol tépari (Phaseolus acutifolius), frijol endémico del norte de México que
ha llamado la atención de investigadores por su contenido de lectinas (Castañeda-Cuevas y col,
2006), glicoproteínas que son capaces de aglutinar eritrocitos (Boyd, 1963) y que tienen un
efecto citotóxico pronunciado en las células cancerígenas por sobre las células no malignas.
Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han mostrado que una fracción rica en lectina
de frijol tépari presenta efecto citotóxico diferencial sobre diferentes tipos de células de cáncer
humano (Castañeda-Cuevas y col, 2006). Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue
evaluar el efecto apoptótico de la fracción de lectina de frijol tépari sobre células de cáncer de
mama (Zr-75-1) mediante la determinación del patrón en escalera de ADN.
1
MATERIALES Y METODOS
Fracción rica en lectina de frijol tépari. La fracción rica en lectina fue proporcionada por el Dr.
Alejandro Blanco Labra del CINVESTAV Campus Guanajuato. Brevemente, se obtuvo el
extracto crudo acuoso que fue precipitado con sulfato de amonio al 40 y 60% y sometido a
cromatografía de exclusión de peso molecular en una columna empacada con Sephadex G75 de
la que se recuperó la fracción rica en lectina. El contenido de proteína se determinó por el
método de Bradford (1976) en el que se utilizó una curva patrón con albúmina sérica de bovino
(ASB) de la que resultó la siguiente ecuación: y = 0.1932 x - 0.1973, R2 = 0.9963. La actividad
aglutinante de la lectina presente en la fracción se determinó mediante el método descrito por Lis
y Sharon (1998) y se expresó en unidades de aglutinación (UA) por mg de proteína.
Se realizó un perfil electroforético SDS-PAGE (Laemmli, 1970) en geles de poliacrilamida al
12% de 1.5 mm de grosor, los cuales se cargaron con 10 μg de proteína/pozo. Los geles fueron
teñidos con reactivo de Schiff-ácido peryódico (PASS) para la determinación de glicoproteínas a
través de la generación de aldehídos a partir de azúcares. Posteriormente se realizó una tinción
general para proteínas con Azul de Coomassie.
Curva dosis-respuesta de la fracción rica en lectina sobre células de cáncer de mama. Las células
Zr-75-1 de cáncer de mama se sembraron en placas de 24 pozos a 3 x 104 cel/pozo en medio de
Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) alto en glucosa, 10% de suero fetal bovino (SFB),
antibióticos y antimicótico. Después de 48 h de incubación a 37° C se cambió el medio por
DMEM suplementado con 0.5% de ASB y diferentes concentraciones de la fracción rica en
lectina (de 0.1 a 50 µg de proteína/mL). Luego de 24 h de tratamiento, las células fueron
cosechadas con tripsina al 0.15% y contadas mediante un hemocitómetro. La tasa de
proliferación celular se determinó considerando como 100% al número de células del control con
ASB (García-Gasca y col, 2002). A partir de los resultados obtenidos se determinó la
concentración inhibitoria 75 (CI75) mediante regresión linear simple del logaritmo de la
concentración contra el porcentaje de proliferación celular.
Determinación de apoptosis mediante el patrón en escalera de ADN. Se sembraron células ZR75-1 en cajas de 60 mm y se permitió que alcanzaran entre 70 y 90% de confluencia. Se les trató
con la fracción rica en lectina en su CI75 (10 µg de proteína/mL) por 24h, las células se lavaron
con PBS y se cosecharon con tripsina. El paquete celular se disolvió en DNAzol y se extrajo el
ADN (Chomczynski y col, 1997). El contenido e integridad del ADN se determinó por
espectrofotometría a 260 y 280 nm. Se prepararon geles de agarosa al 0.8% con 5 μl de SYBR
green 10000X y se realizó una electroforesis con 5 μg de ADN/pozo. El gel fue observado en un
transiluminador con luz UV.
Análisis estadístico. Se realizó un ANOVA mediante los métodos de Tukey y Dunnett (p<0.05)
para la comparación de medias en los ensayos de proliferación celular.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La fracción concentrada de lectina presentó una cantidad de proteína de 0.121 mg/mg de
liofilizado y actividad específica de 10,578 UA/mg de proteína. El perfil de proteína obtenido
mediante SDS-PAGE se muestra en la Figura 1. Es posible observar 2 bandas de proteína en la
tinción por azul de Coomassie, la 1ª de un peso apenas por debajo de los 31 kDa y que se
2
presentó siempre en mayor cantidad que la 2ª banda, cercana a los 45 kDa. La tinción por PASS
demostró que las bandas mencionadas corresponden a glicoproteínas, presumiblemente lectinas.
Los pesos de las bandas obtenidas son similares a las observadas por otro autores, proteínas entre
31 a 45 kDa (González de Mejía y col. 1990; Reynoso-Camacho y col. 2003; López Martínez, 2007)
kDa
1
2
97
66
45
31
21
14
Figura 1. Electroforesis SDS-PAGE de la fracción rica en lectina. Se realizó una electroforesis desnaturalizante
en geles de poliacrilamida al 12% en los que se cargaron 10 µg de proteína por carril. Se llevó a cabo una tinción
para glicoproteínas por PASS (1) y para proteínas por Coomassie (2).
Con la finalidad de determinar si el efecto citotóxico de la fracción rica en lectina está
relacionado con apoptosis, se llevó a cabo una curva dosis-respuesta para determinar el efecto
sobre proliferación celular (Figura 2) y calcular la concentración inhibitoria 75 (CI75). Se observó
efecto negativo sobre la proliferación celular, tal como había sido descrito anteriormente
(Castañeda-Cuevas y col, 2006). En este caso, la CI75 fue de 10 µg de proteína/mL.
120
% PROLIFERACIÓN CELULAR
c
b, c
100
b, c
b*
80
60
a*
40
a*
20
a*
0
ASB
0.1
0.5
1
5
10
50
TRATAMIE
NTO
TRATAMIENTO
(µg de proteína/mL)
Figura 2. Curva dosis-respuesta de la fracción rica en lectina sobre la proliferación de células ZR-75-1.
Las células ZR-75-1 fueron tratadas con 01, 0.5, 1, 5, 10 y 50 µg de proteína/mL durante 24 horas. Las letras
minúsculas indican diferencia estadística entre los diferentes tratamientos (Tukey, p<0.05) y los asteriscos
significan diferencias significativas entra cada tratamiento y el control con ASB (Dunnett, p<0.05). Se muestra
el promedio de dos experimentos independientes.
Posteriormente se determinó el efecto de la CI75 sobre degradación de ADN como marcador de
apoptosis. En la Figura 3 se observa el patrón obtenido para el ADN recuperado de células no
tratadas y tratadas con la fracción estudiada. Las células tratadas presentaron un barrido de ADN
y fragmentos de bajo peso molecular. Este perfil puede deberse a un efecto necrótico de la
fracción estudiada, apoptosis tardía o apoptosis tipo necrosis.
3
1
2
Figura 3. Electroforesis de ADN de células ZR-75-1 tratadas con la fracción rica en lectina. Células ZR-75-1
tratadas por 24 horas con la fracción rica en lectina fueron cosechadas y el ADN extraído. Se realizó una
electroforesis en gel de agarosa al 0.8% y se cargaron 7 µg de ADN por carril. Se observa el perfil de ADN para las
células control (1) y para las células tratadas con 10 µg de proteína/mL (2).
CONCLUSIONES
La fracción rica en lectina contiene al menos 2 glicoproteínas de aproximadamente 31 y 45 kDa
de peso, siendo la de 31 kDa más abundante. Al menos una de ellas corresponde a una lectina ya
que se observó activad aglutinante persistente. Se confirmó el efecto citotóxico sobre células Zr75-1 tratadas durante 24 h con la fracción rica en lectina. La electroforesis de ADN mostró un
perfil de degradación de ADN en células tratadas sin embargo, no fue posible confirmar que se
trate de apoptosis ya que se presentó un barrido con fragmentos de bajo peso molecular. Lo
anterior pudiera ser debido a que se está obteniendo el ADN en etapas tardías de la apoptosis,
hecho que deberá ser confirmado en futuros experimentos.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Humano”. 2° Congreso Nacional de Química Médica. México. 2006. RESPYN Edición especial No. 7-2007
Chomczynski P, Mackey K, Drews R, Wilfinger W. “DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA”.
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González de Mejía, E., Hanklin, C, Paredes-López, O. y Shanon, L. “The lectins and lectin-like proteins of tepary
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López Martínez F.J. “Efecto in vitro de una lectina de frijol tépari sobre células de cáncer de colon humano”. Tesis
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Reynoso-Camacho R., González de Mejía E. y Loarca-Piña G. Purification and acute toxicity of a lectin extracted
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Ripa Saldías L. “Carcinoma micropapilar de vejiga: aportación de un caso y revisión de la bibliografía”. Actas Urol
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