RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS NMX-F-286-1992. ALIMENTOS. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS. FOODS. PREPARATION AND DILUTION OF FOOD SAMPLES FOR MICROBIOLOGICAL ANALYSIS. NORMAS MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS. PREFACIO En la elaboración de esta Norma participaron las siguientes Dependencias, Instituciones y Organismos: Secretaría de Salud Laboratorio Nacional de Salud Pública. Secretaría de Comercio y Fomento Industrial Laboratorios Nacionales de Fomento Industrial Secretaría de Hacienda y Crédito Público Laboratorio Central de la Dirección General de Aduanas Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Leche Industrializada CONASUPO, S.A. Instituto Nacional del Consumidor Cámara Nacional de la Industria de Transformación Cámara de Productos Alimenticios Elaborados con Leche Sigma Alimentos, S.A. de C.V. 1. INTRODUCCIÓN Independientemente del grupo de microorganismos que se pretenda enumerar, el procesamiento de la muestra y la preparación de las diluciones debe realizarse con estrecho apego a las directrices que se describen a continuación. El incumplimiento de estas condiciones dará lugar a variaciones importantes en los resultados hasta el punto de resultar inutilizables. Así, no es posible comparar los resultados entre 2 laboratorios que trabajan en la misma muestra con un manejo diferente de la técnica de análisis, ni es posible interpretar los resultados sucesivos de un laboratorio, si no se observan en cada ocasión las normas precisamente en los términos descritos. 2. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN Esta Norma especifica el procedimiento mediante el cual debe hacerse la preparación y la dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológico. 3. REFERENCIAS Esta Norma se complementa en la siguiente Norma Mexicana: NMX-F-285 Muestreo y transporte de meustras de alimentos para su análisis microbiológico. 4. REACTIVOS Y MATERIALES 4.1 Reactivos Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe entenderse agua destilada. Solución de Hidróxido de sodio 1 N. Agua peptonada a) Solución reguladora de fosfatos b) Agua peptonada 4.1.1 Preparación de reactivos 4.1.1.1 Solución de Hidróxido de sodio 1N. Fórmula: Hidróxido de sodio 4g Agua 100ml • Disolver el Hidróxido de sodio y aforar a 100cm³ con agua. 4.1.1.2 Soluciones diluyentes 4.1.1.2.1 Solución reguladora de fosfatos Fórmula: KH2PO4 34 g Agua 500 ml • • • • • • Disolver el fosfato en el agua y ajustar el pH a 7.2 con hidróxido de sodio 1 N. Llevar a un litro con agua Esterilizar durante 20 minutos a 121ºC. Conservar en refrigeración. Tomar 1.25ml de solución concentrada y llevar a un litro con agua. Esta es la solución de trabajo. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9ml según se requiera Esterilizar a 12°C durante 20 minutos. 4.1.1.3 Agua peptonada Fórmula: Peptonada NaCl Agua • • • • 4.2 1.0 g 8.5 g 1.0 L Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7.0 con hidróxido de sodio 1 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar al 121°c durante 15 minutos. Materiales Todo el material que tenga contacto con las muestras de microorganismos debe estar estéril. • • • • Pipetas bacteriológicas de 10ml y 1ml (graduadas en 0.1 y 0.01ml respectivamente). Frascos de vidrio de 250ml. Tubos de 16 X 150mm con tapón rosca. Utensilios esterilizables para la presentación de las muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas. 5. APARATOS E INSTRUMENTOS • • • • • • Horno para esterilizar con regulador de temperatura. Autoclave con termómetro o manómetro probado con termómetro de máximas. Baño de agua con termostato y termómetro. Licuadora de 1 ó 2 velocidades controladas por un reostato y/o stomacher. Vasos esterilizables para licuadora. Balanza granataria con sensibilidad de 0.1g. 6. PROCEDIMIENTO 6.1 Si se trata de una muestra congelada de un alimento originalmente líquido o licuable, fundirla por completo (405-45°C máximo) y homogeneizarla por agitación vigorosa del recipiente, según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. 6.2 En caso de un alimento sólido congelado, se debe congelar a refrigeración de 4 a 8°C durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. 6.3 Si la muestra es líquida o semilíquida, agitarla firmemente. Cuando el producto por analizar llena totalmente el recipiente, es recomendable vaciarlo en otro (estéril) para homogeneizarlo; se debe tener cuidado de evitar contaminaciones al escurrir el líquido por el labio de ambos recipientes. 6.4 Si se trata de alimentos sólidos, pesar 10 o 11g de la muestra, obtenidos de diferentes zonas, auxiliándose de cuchara, cucharilla, abatelenguas, espátula o cuchillo estériles, transferirlos a un vaso estéril de licuadora y agregar 90 o 99ml de solución diluyente (según se haya pesado 10 o 11g respectivamente) lentada o no, según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. 6.5 Licuar durante 1-2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente a cada alimento. 6.6 Puede sustituirse el tratamiento con licuadora haciendo uso de stomacher y procediendo de tal manera que se logre una suspensión completa y homogénea de la muestra. 6.7 La anterior constituye la primera dilución de la muestra. 6.8 Continuar las diluciones de la muestra con el mismo diluyente, siguiendo los pasos que ilustran los esquemas 1 y 2, según convenga para cada caso. La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado, en ausencia total de información, trabajar con todas las diluciones de la 1 a la 6-. 6.9 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor del 10% de la capacidad total de la pipeta. Para transferir 1.0ml no usar pipetas mayores de 10ml. 6.10 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrirla aplicando la punta de las pipetas al fondo en una zona sin líquido una sola vez y retirarla. 6.11 Mientras se afora el líquido en la pipeta, la punta de ésta debe aplicarse en el interior del cuello del frasco y mantenerse en posición vertical, para lo cuál este último debe inclinarse lo necesario. Para aspirar el líquido de las muestras con la pipeta, sumergir ésta lo menos posible al realizar la operación. 6.12 Cada botella con diluyente que se inocule debe agitarse siempre de la misma manera: 25 movimientos de abajo a arriba en un arco de 30cm efectuados en 7 segundos. 6.13 Transferir la muestra y/o cada una de las diluciones a las cajas petri (recuento en placa) o tubos en medio (recuento en tubo) que se requiera para cada caso, siguiendo las indicaciones señaladas en 4.9 7. BIBLIOGRAFÍA Técnicas para el muestreo y análisis microbiológico de alimentos. Dirección General de Investigación en Salud Pública, S.S.A. 1978 NMX-Z-013 Guía para la redacción, estructuración y presentación de las Normas Mexicanas. Comité Internacional sobre las Especificaciones Microbiológicas para los Alimentos. 8. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES Al momento de la elaboración de la presente Norma no se encontró concordancia con ninguna Norma Internacional. Fecha de aprobación y publicación: Junio 5, 1992. Esta Norma cancela a la: NMX-Y-2861977.