MÍNGUEZ GONZÁLEZ, R.; FERNÁNDEZ-MARDOMINGO, B; MÍNGUEZ GONZÁLEZ, O.; RODRÍGUEZ FERRI, E. F.; FERNÁNDEZ RODRÍGUEZ, F. INTRODUCCIÓN: Tras la realización de el análisis serológico a todas las explotaciones de Castilla y León en el año 2005, (se tomaron muestras a 1.048.248 animales, existentes en 18.583 explotaciones), se analizaron las explotaciones en las que aparecían un solo animal positivo a brucelosis bovina a los que llamados “positivos solitarios”. Los resultados obtenidos nos muestran que del total de las 625 explotaciones positivas, 305 explotaciones presentaban un solo animal positivo. La importancia de estos establos “positivos solitarios” en la prevalencia e incidencia de la brucelosis bovina en Castilla y León es la siguiente: INCIDENCIA Por otro lado, los establos positivos solitarios, constituyen el 59.84% de los establos oficialmente indemnes con casos de brucelosis en la presente campaña, lo que representa más de la mitad del total de la incidencia. PREVALENCIA Constituyen el 48.80% de los establos positivos de Castilla y León, por lo que suponen casi la mitad de la prevalencia de establos positivos a brucelosis bovina de toda la comunidad. nº de Establos Reses establos Prevalencia AÑO investigados investigadas positivos 2005 18.583 1.048.248 625 3,36% % de establos nº de establos % de establos positivos con un solo positivos solitarios en animal solitarios en relación con positivo relación con el los establos (POSITIVOS total positivos SOLITARIOS) 305 1,64% AÑO 2005 48,80% Establos Reses investigados investigadas 18.583 nuevos positivos % de los nuevos positivos del total de positivos incidencia 249 39,84% 1,34% 1.048.248 Nº de % de establos establos positivos positivos solitarios de solitarios de los nuevos los nuevos positivos positivos 149 59,84% OBJETIVO: Verificar si estos animales están infectados de Brucella spp. o se tratan de falsos positivos MATERIAL Y MÉ MÉTODOS: Para la realización del estudio se consideraron 33 explotaciones de ganado bovino, de 6 provincias de Castilla y León, diagnosticadas como positivas solitarias en las campañas de saneamiento ganadero mediante diferentes pruebas serológicas autorizadas (en el estudio se emplearon: fijación de complemento, ELISAi, ELISAc, o varias de estas pruebas). Se tomaron muestras de órganos tras el sacrificio obligatorio de los animales en el matadero. Posteriormente las muestras fueron enviadas al Laboratorio Regional de Sanidad Animal de León donde se llevó a cabo el aislamiento de Brucella spp. Los aislados fueron remitidos al Laboratorio Nacional de Referencia para la determinación de la especie y el biotipo. SEROLOGÍA Título/Resultado RESULTADOS: 1. En el 42.42% de las muestras de los animales positivos se aisló B. abortus biotipo 3, incluso cuando los títulos a fijación de complemento no eran elevados, se consiguió aislar el agente etiológico. 2. En el animal en el que se diagnosticó la enfermedad con el ELISAc y en los 2 animales donde el diagnóstico se realizó con ELISAi, no se aisló Brucella spp. 3. En los dos de los animales en los que se diagnosticaron positivos, tras la realización de una prueba positiva a fijación de complemento, seguido de un ELISA indirecto positivo se aisló Brucella spp en una de las muestras. % de nº de aislamientos de Nº de explotaciones explotaciones explotacines donde se aisló positivas positivas solitarias a solitarias Brucella spp. serología Especie 20 U.I. 40 U.I. 80 U.I. Fijación de 160 U.I. Complemento 320 U.I. 640 U.I. 1280 U.I. ELISAc positivo ELISAi positivo 40 U.I./positivo FC Y ELISAi 160 U.I./positivo 8 6 2 4 1 5 2 1 2 1 1 5 2 2 0 1 2 1 0 0 1 0 62,50% B. 33,33% B. 100,00% B. 0,00% 100,00% B. 40,00% B. 50,00% B. 0,00% 0,00% 100,00% B. 0,00% TOTAL 33 14 42,42% Biotipo Observaciones abortus abortus abortus 3 3 3 * * * abortus abortus abortus 3 3 3 * * * abortus 3 * * Todas las especies y biotipos de Brucella spp. fueron iguales Extracto del PNT del Laboratorio Regional de Sanidad Animal de León para realizar el aislamiento de Brucella spp. PROCESADO DE LAS MUESTRAS: Se realiza una limpieza (eliminación de grasa) y selección de las muestras a utilizar (Ganglios mamarios e iliacos, mama y útero, ganglios retrofaringeos y parótideos, en orden descendente de preferencia). CULTIVO: Cultivo en medio selectivo sólido: Medio de Farrel, realizando la siembra por: impronta de cortes limpios de tejidos (para ello se seleccionan varias de las muestras recibidas) o/y homogeneización de pequeños trozos limpios de muestras con suero fisiológico, sembrando a partir de hisopos sumergidos en la suspensión obtenida. Incubación en atmósfera enriquecida con 5% al 10% de CO2. a 37 ºC. Las colonias de Brucella spp. suelen comenzar a ser visibles a los 3 días de incubación, momento en que examinan las placas al objeto de observar colonias compatibles morfológicamente con el género (redondas, de márgenes lisos de color miel pálido, translucidas) que se resiembran en medio de Farrel y se repite la incubación. En las placas en donde no hay crecimiento los tres primeros días, continúan su incubación realizando una observación diaria, hasta que transcurren 10 días, momento en el cual, si no existe ningún crecimiento, se desechan. IDENTIFICACIÓN DE LAS COLONIAS: Se hace una tinción de Gram . Si son Gram- y cocobacilares, se realiza la aglutinación con antisueros específicos y pruebas bioquímicas si son necesarias. Las placas con colonias compatibles con Brucella spp., se duplican para conseguir cepas que se conservan en crioviales manteniéndolos en congelación a -80ºC. Las aislamientos compatibles con Brucella spp., se envían al Laboratorio de Referencia. (Santa Fé, Granada) para su tipificación mediante extracción de ADN y posterior PCR. CONCLUSIONES La aparición de positivos solitarios en las explotaciones presentan un posterior grado de aislamiento de Brucella spp. del 42.42%, lo que indica que no se tratan de falsos positivos, debido a la dificultad del aislamiento de la bacteria. En el marco de este estudio y teniendo en cuenta el escaso número de muestras utilizadas en el estudio, en ninguno de los animales en los que se diagnosticó la enfermedad utilizando el ELISAi y el ELISAc se aisló la bacteria.