Jornadas SAM 2000 - IV Coloquio Latinoamericano de Fractura y Fatiga, Agosto de 2000, 23-30 USO DE BIORREACTORES PARA LA LIXIVIACIÓN DE UN MINERAL OXIDADO a a b A. Giaveno , L. Lavalle y E. Donati a Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional del Comahue, Bs As 1400, (8300) Neuquén Centro de Investigación y Desarrollo de Fermentaciones Industriales.(CINDEFI-CONICET), 47 y 115 (1900) La Plata b RESUMEN Se realizaron dos metodologías de lixiviación ácida sobre un mineral de cobre de baja ley, con abundancia de especies oxidadas, proveniente del yacimiento Barda González de la provincia de Neuquén. En la primera se inocularon directamente células de Thiobacillus thiooxidans en una columna conteniendo el mineral a lixiviar y azufre como fuente de energía para el microorganismo. En la segunda metodología, se utilizaron biorreactores con células de Thiobacillus thiooxidans inmovilizadas sobre azufre para generar ácido sulfúrico el cual fue transferido a otra columna conteniendo el mineral. En la primera metodología se observó un bajo desarrollo celular y consecuentemente, una baja recuperación de cobre; sin embargo, en la segunda, y luego de cuatro reemplazos de medio por medio fresco cuando el pH ascendía demasiado, se alcanzó una recuperación del orden del 60 % de cobre presente en el mineral. Palabras claves Biorreactores, Thiobacillus Thiooxidans, Cobre, Mineral Oxidado INTRODUCCION Thiobacillus thiooxidans es una bacteria quimiolitotrófica frecuentemente asociada a minerales sulfurados y que participa directa o indirectamente en los procesos de solubilización de metales a partir de minerales junto a otros microorganismos [1]. Esta bacteria es capaz de catalizar la oxidación de compuestos inorgánicos reducidos de azufre utilizando el oxígeno como último aceptor de electrones. Cuando el azufre elemental es el sustrato utilizado por este microorganismo [2,3], la ecuación global que interpreta el proceso que tiene lugar es: S + O2 + H2 O → H2 SO4 (1) Precisamente, la ecuación anterior indica probablemente la contribución más importante de esta bacteria a la solubilización de metales especialmente cuando estos se encuentran asociados a especies oxidadas fácilmente atacables por vía ácida [4,5]. La producción de ácido sulfúrico puede realizarse en forma continua utilizando biorreactores que contengan células inmovilizadas directamente sobre el sustrato, es decir, sobre azufre elemental [6,7]. En este trabajo, se estudió la producción de ácido sulfúrico utilizando un biorreactor de células de Thiobacillus thiooxidans inmovilizadas, y su aplicación a la lixiviación de un mineral de la provincia de Neuquén cuyo contenido en cobre está mayoritariamente presente como compuestos oxidados fácilmente solubilizados por soluciones diluidas de ácidos. 23 Giaveno, Lavalle y Donati PARTE EXPERIMENTAL Cultivo: En los experimentos realizados se ha utilizado una única cepa de Thiobacillus thiooxidans cuya denominación es DSM 11478, rutinariamente cultivada a 30ºC en medio 9 K [8] sin hierro denominado 0K con azufre como única fuente de energía. Biorreactor de azufre: Los biorreactores fueron preparados utilizando columnas percoladoras de 29 cm de altura y 4 cm de diámetro, conteniendo 300 ml de medio 0K de pH inicial igual a 5,0 y 100 g de azufre cuyo tamaño de partícula estaba comprendido entre malla nº10 (2mm) y retenida en malla nº16 (1mm). El cultivo fue inoculado con células de Thiobacillus thiooxidans en estado exponencial de desarrollo. El medio en las columnas se recirculó mediante el pasaje de aire a 2,5 VVM. Cuando el pH del cultivo alcanzó un valor de 1,0 fue reemplazado por medio fresco. Esta operación fue repetida en función de alcanzar una velocidad constante de producción de ácido sulfúrico. Durante estas etapas de crecimiento, fueron seguidos pH, concentración de protones y población bacteriana en suspensión. La morfología de las células fue observada por microscopía electrónica de barrido con un equipo Philips-SEM 515 sobre muestra bañada en oro. Mineral: Las muestras de mineral utilizadas provenían del yacimiento Barda González de la provincia de Neuquén, Departamento Confluencia, constituido por depósitos de cobre diseminado emplazados en sedimentitas [9]. El mineral fue caracterizado para determinar la ley y conocer las especies mineralógicas presentes a fin de diseñar las mejores estrategias de extracción. El contenido de cobre total se determinó a partir de la disolución total de la muestra en medio ácido y los análisis de difracción de rayos X se realizaron con equipo Rigaku DII-Max sobre muestra en polvo entre 5-70º 2 Θ y velocidad 2º/min. Ensayos de biolixiviación: En las experiencias de lixiviación del mineral se ensayaron dos metodologías diferentes. En la primera se intentó generar el ácido sulfúrico “in situ” empleando células de T. thiooxidans provenientes de un cultivo en estado exponencial de desarrollo, directamente inoculadas dentro de una columna de dimensiones similares a la descripta previamente que contenía 100 g de mineral, 100 g de azufre y 250 ml de medio 0 K con pH inicial igual a 5. En cambio, en la segunda metodología, el ácido sulfúrico fue generado en un biorreactor preparado como se ha descripto previamente y posteriormente enviado a una columna conteniendo 100 g del mineral. En este segundo caso, el ácido fue reemplazado cada vez que el pH del sistema superaba el valor 3; a este proceso se le denomina “carga” del biorreactor habiéndose realizado cuatro durante el desarrollo de la experiencia. La población bacteriana en suspensión fue determinada por conteo en un microscopio Bausch y Lomb con dispositivo de contraste de fase utilizando una cámara de recuento de Petroff-Hausser. La concentración de protones en solución fue medida a través de titulaciones realizadas con soluciones valoradas de hidróxido de sodio. La concentración de ion cobre en solución fue determinada por espectrofotometría de absorción atómica. RESULTADOS Caracterización del mineral: a partir de los diagramas de difracción de rayos X presentados en la figura 1, se pudo comprobar que la muestra es una arenisca cuarzofeldespática que presenta al metal de interés con una mineralización de calcosita y compuestos oxidados como malaquita y azurita. A partir del análisis químico se determinó que el contenido de cobre total es de 5,2%. 24 Jornadas SAM 2000 - IV Coloquio Latinoamericano de Fractura y Fatiga Figura 1: Diagrama de difracción de rayos X de la muestra utilizada. Cz = cuarzo; C = calcocita; Fd = feldespato; Ma = malaquita. Generación de ácido sulfúrico En las figuras 2 y 3 se observa la evolución de la concentración de protones en solución y la productividad de ácido sulfúrico durante las diferentes etapas de preparación del biorreactor. Carga I 0,20 Carga II Carga III 0,15 Carga IV Carga V 0,10 0,05 0,00 0 100 200 300 Tiempo (horas) Figura 2: Producción de protones en los primeros cinco pasos de formación del biorreactor de azufre. Productividades de Acido (mMoles/l h) Conc. de H+ (moles/l) 0,25 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 1 2 3 4 5 Cargas del biorreactor Figura 3: Productividad de ácido sulfúrico durante los primeros cinco pasos de formación del biorreactor de azufre. 25 Giaveno, Lavalle y Donati Evolución del cultivo: el desarrollo del cultivo durante las diferentes cargas del biorreactor se puede observar en la figura 4, donde está representada la población bacteriana libre (en suspensión). La morfología característica de la cepa de T. thiooxidans correspondiente al cultivo líquido, se muestra en las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la figura 5. 12.0 10 8 Bacterias/ml 10.0 Carga I 8.0 Carga II Carga III 6.0 Carga IV 4.0 Carga V 2.0 0.0 0 100 200 300 Tiempo (horas) Figura 4: Población bacteriana en suspensión durante los primeros cinco pasos de formación del biorreactor de azufre. Figura 5: Microscopía electrónica de barrido (SEM) de cepas de T. thiooxidans creciendo en suspensión en medio de cultivo 0K en un biorreactor con azufre elemental Ensayos de biolixiviación: La figura 6 muestra la evolución del cobre en solución durante la lixiviación realizada en forma directa (por inoculación interna de T. thiooxidans). El pH sufrió un ascenso inicial hasta un valor cercano a 7 y luego mostró un descenso hasta 4,5 manteniéndose en ese valor hasta el final de la experiencia. No se observó un crecimiento bacteriano significativo. 26 Jornadas SAM 2000 - IV Coloquio Latinoamericano de Fractura y Fatiga 140 8 Cu solubilizado (ppm) 120 100 6 pH 80 60 2+ 40 4 20 0 0 2 4 6 8 10 0 4 8 12 16 20 Tiempo (días) Figura 6: Solubilización de cobre por biolixiviación en la metodología de inoculación directa En la siguiente figura se observa la solubilización de cobre en las 4 cargas consecutivas durante la lixiviación realizada en forma indirecta (utilizando medio proveniente de un biorreactor de ácido sulfúrico). 4 1,0 0,9 2+ 3 Carga I 0,7 0,6 Carga III pH g Cu /100 g de mineral 0,8 0,5 2 0,4 Carga IV 0,3 1 Carga II 0,2 Cargas I II 0 0,1 0 2 4 6 8 0 10 2 4 III I V 6 8 10 Tiempo (días) Figura 7: Solubilización de cobre por biolixiviación en la metodología de lixiviación indirecta (cada carga indica el reemplazo de medio por ácido sulfúrico bio-generado) 27 Giaveno, Lavalle y Donati % Cu Acumulado 60 50 40 30 20 10 0 I II III IV Cargas Figura 8: Porcentaje de cobre al final de cada etapa de lixiviación indirecta considerando la cantidad de metal acumulada en la carga previa. DISCUSION El conocimiento de la mineralogía de la muestra observada en la figura 1 permitió inferir la posibilidad de aplicación de técnicas de lixiviación ya que las especies oxidadas y la calcocita [10] son factibles de ser solubilizadas en medios ácidos diluidos con la consecuente liberación de cobre a la solución. La composición química de las muestras fue mayor que los valores medios reportados para el yacimiento [11] debido a que las características del lugar de muestreo seleccionado y la molienda realizada contribuyeron al enriquecimiento en cobre de la misma. En la figura 2 se observa que en el proceso de formación de una biopelícula de células de T. thiooxidans sobre azufre elemental, la velocidad de producción de protones se incrementa con cada nuevo paso alcanzándose prácticamente una velocidad constante luego de la cuarta etapa, que no es incrementada en las posteriores. La velocidad constante se alcanza probablemente porque: a) las bacterias crecen sobre el azufre formando una monocapa (esto se ha comprobado mediante microfotografías electrónicas en biopelículas preparadas en experiencias previas) que saturan la superficie del sustrato b) la variación de la concentración de protones en el tiempo responde exclusivamente a la velocidad de difusión del oxígeno y/o del dióxido de carbono del aire. La velocidad media de producción de ácido en cada etapa puede ser expresada como la productividad global tal cual se presenta en la figura 3. El incremento en la productividad observado entre cada etapa disminuye y tenderá a anularse a medida que la producción de ácido adquiera una velocidad constante. El conteo celular al microscopio permite cuantificar solo la población libre en el medio líquido. Se asume que las bacterias adheridas a la superficie del sólido se encuentran en un equilibrio de adsorsión/desorsión con las bacterias libres en la suspensión, con lo cual el número de celulas adheridas por unidad de área superficial del sólido se correlaciona con el número de células libres por unidad de volumen (isoterma de Langmuir) [2]. La figura 4 muestra la evolución de dichas poblaciones bacterianas. En ella puede observarse que la cantidad de bacterias liberadas se incrementa en paralelo con la concentración de protones en 28 Jornadas SAM 2000 - IV Coloquio Latinoamericano de Fractura y Fatiga cada etapa. La correlación entre el aumento de la población celular y la concentración de protones indicaría que probablemente, la superficie del azufre no está totalmente cubierta antes del quinto paso. Esto es consistente con la productividad de ácido calculada. En la figura 5 se presentan micrografías de gotas del liquido del biorreactor secadas al aire en las que se aprecia la morfología característica de las células de T. thiooxidans. La figura 6 muestra que en la primera experiencia de biolixiviación por metodología directa la extracción de cobre fue muy pobre (<1%) y acorde con el escaso desarrollo celular y el comportamiento del pH del medio. Esto podría deberse a que la producción inicial de ácido por acción bacteriana no compensa el consumo ocasionado por la reacción de las especies oxidadas; esto provoca un rápido incremento del pH y la consecuente inhibición del crecimiento de las bacterias. Por ese motivo, se realizó nuevamente la experiencia pero a pH inicial 3 manteniéndolo constante durante el tiempo suficiente como para permitir el crecimiento celular. Sin embargo, tampoco hubo desarrollo de biomasa. Pruebas realizadas con otra especie bacteriana del mismo género, T. ferrooxidans, arrojaron resultados similares en cuanto a la evolución del pH y a la extracción de cobre aunque el crecimiento bacteriano fue ligeramente superior. Este incremento en la biomasa podría deberse a la interacción de T. ferrooxidans con los sulfuros insolubles presentes en baja proporción en el mineral (esta acción no es posible para T. thiooxidans). Para explicar los resultados observados en la experiencia en la cual se inoculó con células de T. thiooxidans deben considerarse al menos dos posibilidades (aun no resueltas): a) una gran adherencia bacteriana sobre el mineral que disminuye el número de células realmente en contacto con el azufre. El contacto entre células y azufre es esencial para la oxidación de ese sustrato. b) la liberación por acción ácida de alguna especie minoritaria presente en el mineral y de acción tóxica sobre las bacterias siendo ésta la causa más probable. En la metodología de lixiviación indirecta, realizada transfiriendo sucesivamente medio generado en un biorreactor con células de T. thiooxidans inmovilizadas al mineral, se observa una disolución muy superior a la alcanzada en la metodología con inoculación directa (ver figura 7). En la misma figura se observa que el pH crece más lentamente en la última carga lo que puede interpretarse como una disminución significativa de las especies que pueden ser extraídas directamente por acción ácida. No obstante, la creciente extracción de cobre acumulada en las diferentes etapas (figura 8) indicaría que sería posible aún obtener una mayor recuperación en etapas posteriores, la cual estaría limitada por la solubilidad de las especies de cobre a pH cercano a 1. El porcentaje de cobre recuperado al final del ensayo es aproximadamente el 60 % del contenido originalmente en el mineral. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran la posibilidad de generar en forma continua ácido sulfúrico, utilizando células de T. thiooxidans inmovilizadas sobre azufre y la factibilidad de utilizar este ácido para lixiviar minerales que contengan especies fácilmente atacables por lixiviación ácida. También demuestra que la metodología de biorreactores supera a la metodología de inoculación “in situ”, especialmente cuando se trata de minerales que al solubilizarse elevan demasiado su pH o liberan especies tóxicas que inhiben el crecimiento bacteriano. 29 Giaveno, Lavalle y Donati AGRADECIMIENTOS Agradecemos a la Universidad Nacional del Comahue por el soporte económico, a la Dra. Gisela Pettinari (CIMAR-UNC) por los ensayos de difracción de rayos X, al Lic. Jorge Venaruzzo y al Geol. Francisco Caro (Asentamiento Universitario Zapala-UNC) por la consecución de las muestras de mineral y al Lic. Carlos Cotaro (Centro Atómico Bariloche) por las microscopías electrónicas de barrido. REFERENCIAS 1. D.E. Rawlings. Biomining: Theory, Microbes and Industrial Processes, Springer-Verlag, Berlín, 1997. 2. R. Gourdon, N. Funtowicz. Kinetic model of elemental sulfur oxidation by Thiobacillus thiooxidans in batch slurry reactors, Bioproc. Eng., 18, 241-249, 1998. 3. Y. Konishi, S. Asai, N. Yoshida. Growth kinetics of Thiobacillus thiooxidans on the surface of elemental sulfur. Appl. Env. Microbiol., 61, 3617-3622, 1995. 4. T.M. Bhatti, A. Vuorinen, M.K. Lehtinen, O. Tuovinen. Acid dissolution of uranophane and carnotite, J. Env. Sc. Health, A32, 1827-1835, 1997. 5. E. Donati, L. Lavalle, V. de la Fuente, P. Chiacchiarini, A. Giaveno, P. Tedesco. Leaching of a copper ore by microbiological production of acid and oxidant media. Proceedings of the International Biohytdrometallurgical Symposium, Universidad de Chile, Santiago, Chile, Vol.1, 293-300, 1995. 6. A. Pich Otero, G. Curutchet, E. 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