SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERÍA. DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIÓN DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA PROTOCOLO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens MEDIANTE PRUEBAS BIOQUÍMICAS, ELISA Y PCR. Elaborar(n): Nombre Cargo M. en C. Adrián Mauricio García Ortega Signatario Aprobado M. en C. Humberto César Organes De Los Santos Signatario Aprobado Ing. Marina Ruiz Machuca Signatario Aprobado Firma Revisan: Autorizan: Revisión: 00 Datos de Control Laboratorios: Fecha de Elaboración: Bacteriología, Virus y Biología 29 de Marzo de 2011 Molecular (CESVBC) 1 No. de Páginas 38 ÍNDICE Página 3 Antecedentes Sinónimos; Taxonomía 3 Síntomas 4 Rango de Hospedantes 4 Importancia y Transmisión 4 Distribución Geográfica 5 Vector Biológico 5 Figuras 1-5: Sintomatología 6-7 Métodos de Diagnóstico 8 Envío/Recepción de Muestras 9 Aislamiento de la Bacteria 9 Identificación Fenotípica 10 Purificación y Caracterización 11 Figuras 6-9: Morfología colonial 12 Tabla 1. Caracterización fenotípica de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens. 13 Interpretación de Resultados 14 Destrucción de la muestra y Manejo de desechos 14 Composición de Medios de Cultivo 15-22 Detección por ELISA 23 Interpretación de Resultados 25 Detección por PCR (Punto Final) 28 Extracción de ADN genómico a partir de Tejido 28 Extracción de ADN genómico Bacteriano 30 Preparación de la reacción de PCR 32 Tabla 2. Condiciones de PCR con oligonucleótidos CF4 y CF5 32 Figura 11. Detección de Cff por PCR 33 Interpretación de Resultados 34 Bibliografía 35 2 ANTECEDENTES Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) (Hegdes) (Collins y Jones, 1983) es el agente causal de la marchitez bacteriana del frijol (también conocida como marchitez vascular o marchitez bacteriana de la soya). Esta enfermedad, se observó por primera vez en el sur de Dakota en los EE.UU. en Phaseolus vulgaris (Hedges 1922). La bacteria invade el xilema y con frecuencia mata o impide el desarrollo de plántulas de frijol. En las plantas adultas, las hojas y tallos pierden turgencia, provocando desecación y una apariencia arrugada. A veces las lesiones se desarrollan en forma irregular con áreas necróticas entre las venas principales y puede confundirse con el tizón común causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Sin. X. campestris pv. phaseoli). A menudo solo una o dos plantas laterales pueden ser afectadas y éstas pueden estar ocultas entre el follaje sano. En estado avanzado, los tallos de las plantas infectadas se rompen fácilmente con el viento (Hedges, 1926). En vainas los síntomas son poco visibles, sin embargo, el tejido vascular de las suturas (que une a las valvas) puede ser oscuro. Las semillas infectadas pueden presentar una coloración amarillenta, naranja o morado (Fahy y Persley 1983). La difusión en campo es lenta (Richard y Walker, 1965), pero la enfermedad puede alcanzar gran importancia si los niveles de infección aumentan por las semillas infectadas que se producen. La enfermedad puede controlarse mediante la utilización de semillas sanas y con la rotación de cultivos. SINÓNIMOS (Moffett y Dye, 1983; Bradbury, 1986) Corynebacterium flaccumfaciens subsp. flaccumfaciens (Hedges) (Carlson y Vidaver, 1982) Corynebacterium flaccumfaciens (Hedges) (Dowson, 1942) Bacterium flaccumfaciens (Hegdes, 1922) TAXONOMÍA Grupo: Actinobacteria Subclase: Actinobacteridae Órden: Actinomicetales Suborden: Micrococcineae Familia: Microbacteriaceae Género: Curtobacterium Especie: flaccumfaciens 3 SÍNTOMAS La enfermedad se caracteriza por el marchitamiento gradual de las hojas de las plántulas, extendiéndose hacia el interior, seguido por necrosis del parénquima. La bacteria puede invadir los haces vasculares. En algunas ocasiones se presentan combinaciones simultáneas de síntomas como: manchas, enanismo, muerte de algunos brotes jóvenes (si sobrevive la etapa de plántula). La enfermedad puede provoca la muerte en plántulas de 5-8 cm de altura. En plantas adultas los síntomas son menos pronunciados, con un desarrollo más lento de la enfermedad (EPPO⁄CABI, 1997). Las manchas consisten en tonalidades verde pálido, verde marrón a marrón rojizo que en ocasiones presenta un halo. En un principio las manchas en la hoja se observan flácidas y después adquiere una apariencia seca como papel. En ocasiones la hoja completa (incluyendo el peciolo) se seca quedando colgada del tallo, mientras que en otros casos solo parte de la hoja presenta síntomas de marchitez y clorosis. El resto de la lamina foliar permanece turgente. Alrededor del sistema vascular infectado por la bacteria, se observa un color marrón (Stapp, 1961). Las semillas también se pueden infectar por medio de los conductos vasculares. Sin embargo las semillas infectadas pueden o no presentar síntomas. Éstos se presentan con manchas a lo largo de la sutura, algunas veces extendiéndose lateralmente. Las manchas pueden ser de color amarillo, amarillo verdoso, naranja o morado con forma y tamaño irregular (EPPO⁄CABI, 1997). En vainas inmaduras presentan manchas amarillo verdoso y marchitez. En vainas maduras las lesiones son de color verde marrón mientras que el resto de la vaina es de color amarillo. Cuando se abre la vaina infectada se observa un exudado bacteriano de color amarillo (Stapp, 1961). RANGO DE HOSPEDANTES Phaseolus spp., Vigna spp., Glycine max L. y Pisum sativum L. (Dunleavy, 1963, 1983; Zaumeyer 1932; Zaumeyer y Thomas 1957). IMPORTANCIA Y TRANSMISIÓN La marchitez bacteriana del frijol causada por Cff es una plaga cuarentenaria A2 según EPPO para Europa (CABI/EPPO, 1998). Los requisitos de cuarentena de la EPPO consideran que, ya que esta bacteria se transmite por semilla se debe asegurar que las semillas deberán proceder de zonas donde Cff está ausente o cuando la cosecha de semilla se encuentre libre de la bacteria durante la última temporada de crecimiento. Cff puede sobrevivir durante 2 años en las semillas en el suelo, o más cuando las semillas son almacenadas en condiciones óptimas. Las semillas representan el vehículo para la propagación de la enfermedad a través de distancias cortas y largas (OEPP/EPPO, 1990). 4 DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Estados Unidos de Norteamérica (Thomas y Graham 1952; Coyne y Schuster 1979; Venette et al. 1995), Europe, Australia, Asia, Norte y Sudamérica, Africa (Bradbury 1986; Smith et al. 1997). VECTOR BIOLÓGICO No se reporta en literatura algún vector vinculado con la transmisión de la bacteria a plantas sanas. 5 Figura 1. Síntomas de marchitez en follaje causados por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) en frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Créditos: D. Caffier, Organización: Lab. National de la Protection des Végétaux, Francia (2008). Disponible en: www.invasive.org. Figura 2. Lesiones causadas por la infección de Cff en vainas maduras de Phaseolus vulgaris L. Créditos: Ministry of Agriculture and Regional Development Archive, Hungría. Disponible en: www.invasive.org. 6 Figura 3. Cultivo de Phaseolus vulgaris L. afectado por Cff en el estado de Colorado (EE.UU.). Créditos: Howard F. Schwartz, Colorado State University, EE.UU. (2008). Disponible en: www.invasive.org. Figura 4. Síntomas de marchitez generalizada en P. vulgaris L. en plantas adultas con vaina. Créditos: Howard F. Schwartz. Figura 5. Síntomas en tallo de P. vulgaris L. en etapa avanzada de la enfermedad en plantas adultas. Créditos: Howard F. Schwartz. 7 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Cff puede ser aislada de la planta afectada, semilla y suelo. La identificación puede realizarse a nivel fenotípico por pruebas bioquímicas para género y patovar; mediante el Ensayo Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) y a nivel molecular por técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El diagnóstico confirmatorio para los aislamientos sospechosos y positivos de ELISA se realiza por PCR. MUESTRA SEMILLA / SUELO TEJIDO ELISA AISLAMIENTO AISLAMIENTO ELISA PCR RESULTADO POSITIVO RESULTADO NEGATIVO TERMINA DIAGNÓSTICO 8 PROTOCOLO ENVÍO/RECEPCIÓN DE MUESTRAS Las muestras que se reciben para diagnóstico, primeramente se registran en la bitácora con el número de control que la acompaña. La muestra debe estar en buen estado, esto es, que no presente necrosis, hongos, que no esté deshidratada y que el tejido esté lo más fresco posible. El tejido vegetal para realizar la detección puede incluir: vainas, brotes, peciolos, hojas con síntomas y lesiones en el tallo. Para el caso de suelo y semilla, 1 Kg de muestra es suficiente para realizar el diagnóstico. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA TEJIDO 1. Utilice medios no selectivos como YDC, CPG, PDA o BK. Las partes de la planta que se pueden utilizar con frecuencia son hojas (hasta 1 cm2), tallo y peciolo (Fahy y Persley, 1983). 2. Lave el tejido tres veces con suficiente agua destilada estéril. Agite con una pinza. 3. Elimine el exceso de agua con papel secante estéril. No se recomienda desinfectar el tejido con hipoclorito de sodio al 1%. 4. Coloque el tejido sobre el agar e incube entre 23-29 °C de 3 a 6 días. Incluya un control de contaminación. 5. Selle las cajas e identifíquelas con el número de muestra y la fecha de siembra. SEMILLA BOTÁNICA 1. Desinfecte el área de trabajo con alcohol etílico o isopropílico al 70%. 2. Rotule un vaso de precipitado estéril con el número de muestra. 3. Tome una cantidad suficiente para sembrar hasta 4 cajas, colóquela en un tamiz y lave con agua corriente por 30 segundos. 4. Ponga la muestra en el vaso etiquetado y desinfecte con una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 1 minuto. Mezcle con una pinza. 9 5. Enjuague tres veces con suficiente agua destilada estéril, agite con una pinza. 6. Después de procesar cada muestra lave el tamiz y las pinzas con detergente; enjuáguelos con agua corriente. 7. Quite el exceso de agua de la semilla con papel secante estéril. 8. Siembre en los medios B de King, YDC, PDA o CPG. Distribuya las semillas en la caja. Incluya un control de contaminación. 9. Flamee las pinzas entre cada caja. 10. Selle las cajas e identifíquelas con el número de muestra y la fecha de siembra. 11. Incube las cajas a una temperatura entre 23 y 29 ºC por 3 días. Descarte aquellas colonias de bacterias saprófitas que aparezcan en las 24-36 horas. 12. Para semilla mantenga el resto de la muestra original cerrada y consérvela a temperatura ambiente. Para material perecedero conserve en refrigeración. SUELO 1. Pese 1 gramo de muestra y coloquelo en 9 mL de solución fisiológica estéril (NaCl 0.85%). 2. Prepare diluciones de hasta 1 x 10-5 (Madigan et al., 2008). 3. Coloque asépticamente 100 µL de la dilución en agar BK, CGP y YDC. Realice por duplicado. 4. Siembre por estría cruzada. 5. Selle las cajas e identifíquelas con el número de muestra y la fecha de siembra. 6. Incube a una temperatura entre 24 a 29°C por 2 a 6 días. Descarte las colonias de bacterias saprófitas que aparezcan en las primeras 24 horas. 7. Conserve el resto de la muestra a temperatura ambiente. IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA Género Curtobacterium. Bacilos pequeños, cortos e irregulares en cultivos jóvenes, 0.4-0.6 x 0.6-3.0 µm, agrupados en forma de “V”, “Y” o sencillos. Gram positivos, móviles por flagelos perítricos. No formadores de espora, aerobios obligados. En medios nutritivos producen colonias amarillas o naranja con consistencia suave y ligeramente convexas. Quimioorganótrofos con metabolismo respiratorio. Producen bajas cantidades 10 de ácido a partir de D-glucosa y otros carbohidratos. Catalasa positivo. Temperatura óptima de crecimiento de 25-30°C (Yamada y Komagata, 1972; Holt et al., 1994). Patovar flaccumfaciens (Cff). En medio CPG la pigmentación de las colonias puede variar. Las cepas silvestres producen pigmentos extracelulares de color rosa pálido a salmón. Respecto a las características de las colonias, varían de opacas a brillantes, translucidas, con bordes regulares, con elevación que va desde planas a ligeramente convexas. Temperatura óptima de crecimiento de 30°C (Hedges, 1922; Stapp, 1961; Schaad et al., 2001). La licuefacción de gelatina es lenta (15 días), así como la hidrólisis de almidón (28 días) (Stapp, 1961). En los medios BK y CPG produce colonias circulares y ovales de >3 mm de diámetro (48-72 hrs) con consistencia suave. En medio LB enriquecido con leche descremada produce colonias amarillas o naranjas con consistencia mucoide de >3 mm de diámetro (48-72 hrs). PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN 1. Seleccione aquellas colonias bacterianas con características similares a Cff y siembre por el método de estría cruzada. 2. Observe y registre la morfología colonial. Revise las colonias bajo el estereoscopio y continúe purificando cuando se observen mezclas de bacterias. 3. Determine el tipo de bacteria (Gram positiva o Gram negativa) con la prueba de Ryu (KOH 3%). 4. Determine el género con las pruebas de citocromo oxidasa y catalasa; así como el tipo de metabolismo con la prueba de Oxidación/Fermentación. 5. Realice las pruebas de utilización de carbohidratos, aminoácidos y sustratos siguiendo las indicaciones de la literatura. 6. Realice cada prueba cuando sea posible por duplicado. Utilice un testigo sin inocular (negativo) y de preferencia un testigo positivo. 7. Identifique los aislamientos con el número de muestra de la que se obtuvieron. 8. Aquellos aislamientos identificados como C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, se envían al laboratorio de Biología Molecular para su corroboración por la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). 9. Los cultivos puros de los aislamientos confirmados pueden preservarse por congelación de -20°C a -80ºC en medio NBY adicionado con glicerol al 30% (Sly LI, 1983; Schaad et al., 2001). 11 5 6 7 9 8 Morfología colonial de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (García-Ortega A.M. y Ruiz-Machuca M., 2011). Figuras 5 y 6) Prueba de degradación de caseína en agar LB adicionado con leche descremada al 1.6% a las 48 horas de incubación a 27°C, donde se observan zonas de aclaramiento en el medio; 7) Cepa con pigmentación salmón en medio B de King; 8) Colonias color naranja, brillantes, ligeramente convexas en agar YDC; 9) Variante color crema en medio B de King donde produce colonias brillantes, con bordes enteros y ligeramente convexas con consistencia suave. Esta cepa produce colonias color amarillo en medios enriquecidos como YDC o NBY. Ver Tabla 1. 12 PRUEBAa RESULTADOb Género Curtobacterium Prueba de Ryu (KOH 3%) Citocromo Oxidasa Catalasa Movilidad en medio líquido a las 12 horas (observado a 40X) + + Patovar flaccumfaciens Pigmentos en agar NBY Pigmentos en agar YDC y LB-SMd Pigmentos en agar CPG Pigmentos en agar B de King Crecimiento en CNS Crecimiento en TTC Crecimiento a 4, 30, 37 y 40°Cc Hidrólisis de Almidónc Licuefacción de Gelatinac,f Hidrólisis de Caseínad Hidrólisis de Esculina Reducción de Nitratos a Nitritos Tolerancia a NaCl 5-9% Producción de Indol a partir de L-Triptófano Producción de H2S a partir de L-Cisteína Producción de Ureasa Amarillo, naranja, rosa Amarillo, naranja Crema, rosa, salmón Crema, naranja, rosa, salmón V + + +DT +T + + + + - Producción de ácido (débil, sin gas) a partir de: e L-Arabinosac, D-Fructosa, D-Xilosa D-Ribosa D-Glucosa, D-Galactosa, D-Manosa, L-Ramnosa D-Maltosa, D-Lactosa, Sacarosac,f, D-Celobiosa, Rafinosa D-Melezitosa, Adonitol, D-Manitol Glicerol, myo-Inositol D-Sorbitol Inulina + +T + + V + - Utilización de: Acetato, Fumarato, Gluconato Formato + - Tabla 1. Caracterización fenotípica de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens. Citas: aPruebas realizadas en este estudio de 12 cepas aisladas de semilla de frijol, provenientes de los EE.UU. (2010). Las pruebas bioquímicas se incubaron a 27°C ± 1°C por triplicado. Abreviaturas: V, variable; D, débil; T, tardía; bInterpretación de resultados según Schaad et al., 2001: +, 80% o más aislamientos son positivos después de 5 días; V, entre 21-79% son positivos; -, 80% o más son negativos. Holt et al., 1994: +, 90% o más son positivos; V, entre 11-89% son positivos; -, 90% o más son negativos; cStapp (1961); dEn agar LB adicionado con leche descremada al 1.6%; eEn medio C (Dye y Kemp; 1977); fHolt et al., 1994 reporta como negativo. 13 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 1. La presencia de una bacteria fitopatógena de interés cuarentenado se indica como POSITIVO y su ausencia como NEGATIVO. 2. Si el control positivo utilizado no presenta ninguna reacción en las diferentes pruebas se invalida el resultado del diagnóstico y se repite el ensayo. 3. En el control negativo no deberá observarse ningún crecimiento. Si esto ocurre se invalida el resultado del diagnóstico y se repite el ensayo. DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA Y MANEJO DE DESECHOS 1. En caso de que el diagnóstico resulte positivo y concluido el tiempo de almacenamiento reglamentario, la muestra es esterilizada por calor húmedo o calcinada. En caso contrario, únicamente se almacena en refrigeración para ser desechadas posteriormente. 2. Las semillas lavadas con hipoclorito que no se sembraron, los medios con las semillas o con aislamientos de bacterias y pruebas bioquímicas (sin reactivos) se esterilizan antes de ser desechados. 3. Los restos de reactivos utilizados para la interpretación de pruebas bioquímicas son colocados en un recipiente con tapa de rosca para ser recolectados por un proveedor autorizado. 14 COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO AGAR B DE KING (BK) Peptona 20 g K2HPO4 1.5 g MgSO4 • 7H2O 1.5 g Agar 15 g Glicerol 15 mL Agua destilada 985 mL Preparación: Disuelva los reactivos y esterilice a 121°C por 15 minutos. Volumen final: 1000 mL. Vacíe en cajas Petri. EXTRACTO DE LEVADURA-DEXTROSA-CARBONATO DE CALCIO (YDC) Extracto de levadura 10 g Glucosa 20 g CaCO3 20 g Agar 15 Agua destilada 900 mL Preparación: Disuelva los reactivos, excepto la glucosa. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Para 1 litro de medio, esterilice la glucosa por separado en 100 mL de agua destilada a 121°C por 5 minutos. Adicione la glucosa asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 L. Mezcle y vacíe en cajas Petri. 15 AGAR CASAMINOÁCIDOS-PEPTONA-GLUCOSA (CPG) Casaminoácidos (BD®, Oxoid®) 1g (Hidrolizado ácido de Caseína) Peptona 10 g Glucosa 10 g Agar 15 g Agua destilada 900 mL Preparación: Disuelva los reactivos, excepto la glucosa. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Disuelva la glucosa en 100 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione asépticamente al medio. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en cajas Petri. MEDIO PARA MOVILIDAD Triptona 10 g Cloruro de Sodio 5g Agua destilada 1000 mL Preparación: Disuelva los reactivos y ajuste a un pH de 6.8-7. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Vacíe en tubos estériles. MEDIO DE HUGH-LEIFSON (O/F) Peptona 2g NaCl 5g KH2PO4 0.3 g Azul de bromotimol al 1% (En agua destilada) 3 mL Agar 3g Glucosa 10 g Agua destilada 900 mL Preparación: Disuelva los reactivos, excepto la glucosa. Ajuste a un pH de 6.8-7.0 y esterilice a 121°C por 15 minutos. Disuelva 10 g de glucosa en 100 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 L. Mezcle y vacíe en tubos. 16 AGAR CALDO NUTRITIVO-EXTRACTO DE LEVADURA (NBY) K2HPO4 2g KH2PO4 0.5 g MgSO4 • 7H2O 0.246 g Caldo Nutritivo 8g Extracto de levadura 2g Glucosa 2.5 g Agar 15 g Agua destilada 980 mL Preparación: Disuelva los reactivos, excepto el sulfato de magnesio y la glucosa. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Disuelva por separado la glucosa y el sulfato de magnesio en 10 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione asépticamente al medio. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en cajas Petri. MEDIO C PARA CARBOHIDRATOS NH4H2PO4 1g KCl 0.2 g MgSO4 • 7H2O 0.2 g Peptona 10 g Carbohidratos 10 g Azul de bromotimol al 1% 3 mL (En etanol al 50%) Agar 10 g Agua destilada 900 mL Preparación: Disuelva los reactivos, excepto el carbohidrato. Ajuste a un pH de 7.1 y esterilice a 121°C por 15 minutos. Disuelva el carbohidrato en 100 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Añada asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en tubos estériles. 17 AGAR CNS (MODIFICADO) K2HPO4 1g KH2PO4 0.25 g Caldo Nutritivo 4g Extracto de Levadura 1g Agar 7.5 g Glucosa 2.5 g MgSO4 • 7H2O 0.062 g Cicloheximida (10 mg/mL) 2 mL Ácido Nalidíxico (10 mg/mL) 1.25 mL Sulfato de Polimixina B 1.6 mL 6,000 Unidades USP/mg (10 mg/mL) Agua destilada 500 mL Preparación: Disuelva los reactivos, excepto el sulfato de magnesio y la glucosa. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Esterilice la glucosa y el sulfato de magnesio por filtración y adicione junto con los antibióticos al medio basal. Mezcle y vacíe en cajas Petri. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO A PARTIR DE CISTEÍNA NH4H2PO4 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 • 7H2O 0.2 g NaCl 5g Extracto de levadura 5g L-Cisteína 0.1 g Agua destilada 990 mL Preparación: Disuelva los reactivos excepto la cisteína. Esterilice el medio a 121°C por 15 minutos. Disuelva el aminoácido en 10 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione asépticamente al medio. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en tubos estériles. 18 PRODUCCIÓN DE INDOL A PARTIR DE TRIPTÓFANO Triptona 10 g L-Triptófano 1g Agua destilada 990 mL Preparación: Disuelva los reactivos excepto el triptófano. Esterilice el medio a 121°C por 15 minutos. Disuelva el aminoácido en 10 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione asépticamente al medio. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en tubos estériles. REDUCCIÓN DE NITRATOS Nitrato de potasio 1g Peptona 5g Extracto de levadura 3g Agua destilada 1000 mL Preparación: Disuelva los reactivos. Regule el pH a 7-7.2 y esterilice a 121°C por 15 minutos. Vacíe en tubos estériles. MEDIO CON CLORURO DE TETRAZOLIO Peptona 10 g Casaminoácidos (BD®, Oxoid®) 1g (Hidrolizado ácido de Caseína) Glucosa 5g Agar 12 g Cloruro de 2,3,5-Trifenil tetrazolio (TTC) 0.05 g Agua destilada 990 mL Preparación: Disuelva los reactivos, excepto el TTC. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Disuelva el TTC en 10 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione el TTC asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en cajas Petri. 19 HIDRÓLISIS DE ESCULINA NH4H2PO4 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 • 7H2O 0.2 g NaCl 5g Extracto de levadura 5g Esculina 1g (6,7-Dihidroxicumarina 6-Glucósido) Citrato de amonio férrico 0.5 g Agua destilada 1000 mL Preparación: Disuelva los reactivos y ajuste a un pH 6.8. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Vacíe en tubos estériles. PRODUCCIÓN DE UREASA NH4H2PO4 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 • 7H2O 0.2 g NaCl 5g Extracto de levadura 1g Rojo de cresol 0.016 g Urea 20 g* Agua destilada 800 mL* Preparación: Disuelva los reactivos excepto la urea. Esterilice a 121°C por 15 minutos. *Disuelva 20 g de urea en 180 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione la urea asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en tubos estériles. 20 HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN Agar Nutritivo 8g Almidón soluble de papa 10 g Agua destilada 1000 mL Preparación: Disuelva los reactivos y esterilice a 121°C por 10 minutos. Vacíe en cajas Petri. HIDRÓLISIS DE GELATINA Extracto de carne 3g Peptona 5g Gelatina 120 g Agua destilada 1000 mL Preparación: Disuelva en agua caliente. Ajuste a un pH de 7. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Vacíe en tubos estériles. TOLERANCIA A CLORURO DE SODIO Extracto de carne 3g Peptona 5g Glucosa 2.5 g Agua destilada 1000 mL Preparación: Adicione NaCl para obtener concentraciones de 1-10%. Esterilice a 121°C por 15 minutos. Vacíe en tubos estériles. 21 AGAR LURIA-BETANI + SKIM MILK 1.6% AGAR LB (Lennox) Triptona 10 g Extracto de levadura 5g NaCl 5g Agar 15 g Agua destilada 900 mL Preparación: Disuelva los reactivos y esterilice a 121°C por 15 minutos. SKIM MILK Leche descremada 16 g Agua destilada 100 mL Preparación: Esterilice la leche descremada por separado a 121°C por 15 minutos. Adicione la leche asépticamente al medio LB. Volumen final: 1litro. Mezcle y vacَíe en cajas de Petri. 22 DETECCIÓN POR PTA-ELISA Para la detección de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens se utiliza la técnica serológica de ELISA que está basada en la habilidad de las proteínas, conocidas como anticuerpos, para reconocer y enlazar un antígeno específico asociado con el patógeno. Es una técnica confiable y rápida para la detección de fitopatógenos (Machmud y Suryadi, 2008). Se han desarrollado algunas variantes de la técnica de ELISA. La variante PTA-ELISA (Plate Trapped Antigen, por sus siglas en inglés) que a continuación se describe es la desarrollada por la compañía NEOGEN EUROPE LTD. Consiste en la adsorción inicial del patógeno (A) a una placa de poliestireno, en la que después de un periodo de incubación se lava la placa. En seguida se bloquea cualquier sitio libre con un amortiguador de bloqueo con alto contenido proteico. Posteriormente se lava y se añade el anticuerpo sonda (IgG) que reacciona con los antígenos adheridos a la placa. Se lava y se complementa con la adición de un conjugado enzimático (E) (anticuerpo conjugado con una enzima, que en este caso es Fosfatasa Alcalina) para formar el complejo antígeno-anticuerpo sonda-conjugado enzimático. Después de lavar se adiciona el sustrato (S). Si se formó el complejo mencionado, se desarrollará color indicando la presencia del fitopatógeno (Machmud y Suryadi, 2008). Procedimiento: 1. Macere 0.5 g de cada muestra con 2 mL de amortiguador de cobertura (Apéndice 1). Nota 1: En algunos casos será recomendable incrementar la cantidad de amortiguador de cobertura según la viscosidad del macerado. Nota 2: De acuerdo al fabricante, el set de reactivos esta diseñado también para poder realizar el análisis directamente de la cepa aislada. Sin embargo, no tiene disponible la información 23 sobre los límites de detección. No obstante, es posible detectar a Cff directamente de la cepa aislada probando varias diluciones de la misma. 2. Considerando el formato de distribución de las muestras, adicione a la placa 100 µL de cada muestra, control positivo y control negativo con su repetición respectiva. 3. Coloque la placa en cámara húmeda e incube a 4°C durante toda la noche. 4. Lave la placa de 6 a 8 veces con PBS-T 1X 1 (Apéndice 1) y seque completamente. Nota: En algunos casos podrá ser necesario lavar la placa 3 a 4 veces, dejar reposar durante 1-2 minutos y continuar con otros 3 a 4 lavados. 5. Adicione 200 µl de amortiguador de bloqueo (Apéndice 1) a cada pozo de prueba. 6. Coloque la placa en cámara húmeda e incube a 37º C por 1 hora. 7. Lave la placa 3 veces con PBS-T 1X (Apéndice 1) y seque completamente. 8. Diluya el anticuerpo sonda según la recomendación del fabricante en amortiguador de dilución de anticuerpo (Ab) (Apéndice 1) en la cantidad suficiente para el número de muestras a analizar y adicione 100 µl a cada pozo de prueba. 9. Coloque la placa en cámara húmeda e incube a 37°C por 2 horas. 10. Lave la placa de 4 a 6 veces con PBS-T 1X (Apéndice 1) y seque completamente. 11. Diluya el conjugado enzimático según la recomendación del fabricante en amortiguador de conjugado (Apéndice 1) en la cantidad suficiente para el número de muestras a analizar y adicione 100 µl a cada pozo de prueba. 12. Coloque la placa en cámara húmeda e incube a 37°C por 1 hora. 13. Lave la placa de 4 a 6 veces con PBS-T 1X (Apéndice 1) y seque completamente. 14. Prepare la solución de sustrato de para-nitrofenil fosfato (pNPP) a una concentración de 1mg/ml en amortiguador de sustrato (Apéndice 1). Nota: una pastilla de 5 mg en 5 ml de amortiguador de sustrato. 15. Adicione 100 µl de la solución de sustrato a cada pozo de prueba incluyendo el blanco. 16. Incube en cámara oscura a temperatura ambiente por 1 hora (ver Nota en punto 17). 17. Lea la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm en el lector de placas de ELISA. Nota: Se pueden realizar lecturas de absorbancia cada 15 minutos después de haber adicionado el sustrato a la placa. Sin embargo, los resultados se podrán interpretar después de transcurrida 1 hora. 24 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 18. Los resultados se podrán interpretar de acuerdo a los siguientes criterios (Cruz y Frías, 1997): a) La muestra se considera positiva si la lectura de densidad óptica es mayor o igual a tres veces la media del testigo negativo. b) Si el testigo negativo presenta en promedio valores de densidad óptica menores de 0.03, sólo se consideran positivas aquellas muestras con densidades ópticas mayores a 0.1. c) Cuando sólo una de las muestras es positiva y/o si la diferencia con su repetición es mayor o igual al 50% de su valor, la muestra debe procesarse nuevamente para determinar la presencia del fitopatógeno. 19. Las muestras que resulten positivas deberán corroborarse por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para confirmar la presencia del fitopatógeno. 20. Los resultados se anotan en los registros de laboratorio correspondientes indicando la fecha de emisión del resultado. Nota: En el caso de que el lector de placas de ELISA cuente con impresora térmica interna, será necesario incluir a dichos registros las lecturas de absorbancia que se hayan impreso. APÉNDICE I SOLUCIONES AMORTIGUADORAS a. Solución amortiguadora de cobertura (Amortiguador de Carbonatos) Disuelva en 1000 mL de agua destilada: Carbonato de Sodio (anhidro) 1.59 g Bicarbonato de Sodio 2.93 g Azida de sodio 0.2 g 25 Ajuste el pH a 9.6 (+/- 0.2). Almacene a 4° C (en refrigeración). b. Solución amortiguadora salina de Fosfatos (PBS) 10X (Concentrada 10 veces) Disuelva en 1000 mL de agua destilada: Cloruro de sodio 80 g Fosfato de Sodio, dibásico (anhidro) 11.5 g Fosfato de Potasio, monobásico (anhidro) 2g Cloruro de Potasio 2g Diluya 1:10 para utilizar el PBS a una concentración de 1X. c. Solución amortiguadora de Lavado (PBS+Tween 20; PBS-T) PBS 1X 1L Tween 20 0.5 mL Ajuste el pH a 7.4 (+/- 0.2). d. Solución amortiguadora de Bloqueo (PBST-M) PBS-T 1X 100 mL Leche en polvo baja en grasa 5g e. Solución amortiguadora de Dilución de Anticuerpo (Ab)/Conjugado PBS-T 1X 100 mL Albúmina de Suero Bovino 0.2 g 26 f. Solución amortiguadora para sustrato pNPP (Amortiguador de Dietanolamina 1 M). Disuelva en 800 mL de agua destilada: Dietanolamina 90.39 g Dietanolamina-HCl 19.82 g Cloruro de Magnesio hexahidratado 0.1 g Azida de Sodio 0.2 g Ajuste el volumen final a 1000 mL con agua destilada estéril. Ajustar el pH a 9.8. Almacene a 4° C en refrigeración en frasco ámbar o envolver con aluminio para proteger de la luz. El sustrato pNPP se prepara a una concentracion de 1 mg/ml (1 tableta de 5 mg en 5 ml de amortiguador de sustrato). NOTA: La Dietanolamina y Dietanolamina-HCl son líquidos extremadamente viscosos. Sin embargo, es más sencillo pesarlos que medir su volumen. 27 DETECCIÓN POR LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PUNTO FINAL) 1. DESCRIPCIÓN Los iniciadores publicados por Guimaraes et al., (2001) amplifican un fragmento de aproximadamente 148 pb, siendo específicos para el patovar flaccumfaciens. Iniciador sentido CF4: 5’-CACAGCCACCTACATGC-3’, iniciador antisentido CF5: 5’GATCGGGAGTCCGAG-3’. Sensibilidad del método: 100 UFC/mL. Otros iniciadores reportados por Tegli et al., (2002) amplifican un fragmento de 306 pb. Iniciador CffFOR2 5’-GTTATGACTGAACTTCACTCC-3’ y CffREV4 5’GATGTTCCCGGTGTTCAG-3’. Sensibilidad del método: 100 UFC/mL y 5 pg de ADN genómico. 5’CACAGCCACCTACATGCCGATCAGCGCCGATCAGGCCGCCCGGCAGCTTCCGA ACCTGCAGAAGGTCAGCGCCAAGACCGCCGGGTGGCTGCTCGAGGACCTCACCTC GAGCGCCACTGCAACCGGCGCCGAGCTCGGACTCCCGATCGTCACCGCCGCACGC CCCACGACAGAGGCGCAGGTTATCGAGATCCGGA 3' Figura 10. Sitos de unión de los iniciadores CF4 y CF5 (Producto de 148 pb), la cual corresponde a un fragmento desconocido (198 pb) del genoma de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens cepa de referencia NCPPB 559. Número de acceso GenBank AF277098.1. Tomado de Guimaraes et al., 2001. 2. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO TOTAL A PARTIR DE TEJIDO VEGETAL (Chomczynski et al., 1997) 2.1 Tome 200 mg de tejido, colóquelo en un tubo de 2 mL y macere en 500 µl amortiguador TE estéril (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). 2.2 Adicione 500 µL del reactivo DNAzol-ES® (MRC Inc, EE.UU). 2.3 Mezcle con vórtex y mantenga en agitación mecánica por 15 minutos. 2.4 Incube en baño María a 70 °C por 10 min. 2.5 Centrifugue a 12,000 r.p.m. por 1 min. 2.6 Transfiera el sobrenadante a otro tubo estéril. 2.7 Adicione 500 µL de cloroformo 99.8% (4°C) y mezcle con vórtex. 28 2.8 Deje reposar 5 minutos a temperatura ambiente. 2.9 Centrifugue a 12,000 r.p.m. por 10 min. 2.10 Transfiera la fase acuosa a otro tubo y adicione 0.75 volúmenes de etanol absoluto (-20°C). 2.11 Mezcle manualmente por inversión de 6 a 8 veces y deje reposar por 5 minutos en el congelador. 2.12 Posteriormente centrifugue a 14,000 r.p.m. por 10 min. 2.13 Elimine el etanol por decantación. 2.14 Lave con 500 µL de etanol 70% (-20°C) y aplique vórtex. 2.15 Centrifugue a 14,000 r.p.m. por 5 min. 2.16 Elimine el etanol por decantación e invierta los tubos sobre papel secante estéril. 2.17 Evapore los restos de etanol a 37°C por 10 min. 2.18 Resuspenda el ADN en 50-100 µL de amortiguador TE estéril. 2.19 Tome 5 µL para detectar por electroforesis y almacene el resto en el congelador. 3. DETECCIÓN DE ADN GENÓMICO 3.1 Prepare un gel de agarosa al 1.2-1.5% en amortiguador TBE 0.5X y adicione bromuro de etidio (10 mg/mL) a una concentración de 0.5 mg/mL (Maniatis et al., 1982). 3.2 Utilice 5 µL de ADN para cargar al gel y mezcle con 1 µL de amortiguador de carga 5x (xilencianol 0.1%, azul de bromofenol 0.1%, naranja G 0.1%, glicerol al 50% en amortiguador TBE 0.5x) (Davis et al., 1994). 3.3 Utilice como referencia 5 µL del marcador de peso molecular de 0.1 a 2 Kpb (0.51 µg/µl). 3.4 Aplique una carga de 100 voltios por 30 minutos. 3.5 Coloque el gel sobre el transiluminador UV y fotografíe los resultados. 29 4. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO BACTERIANO (Ausubel et al., 2002; Maniatis et al., 1982). Enzimas: Proteinasa K (20 mg/mL) Lisozima (10 mg/mL) Reactivos: Amortiguador TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) Dodecilsulfato de sodio al 10% NaCl 5M Cloroformo / alcohol isoamílico 24:1 Fenol (Tris-HCl, EDTA 1mM, pH 8) / cloroformo / alcohol isoamílico 25:24:1 Isopropanol al 99% (-20°C) Etanol al 70% (-20°C) CTAB 10%-NaCl 0.7 M PROCEDIMIENTO 1. Tome una colonia y resuspéndala en 1 mL de NaCl 0.85%, centrifugue a 12,000 r.p.m. durante 2 minutos. Elimine el sobrenadante en un recipiente con hipoclorito de sodio al 1%. 2. Resuspenda el paquete celular en 567 µL de amortiguador TE. Agregue 8 µL de lisozima, mezcle e incube 25 minutos a 37°C. 3. Adicione 30 µL de SDS, 3 µL de proteinasa K y mezcle por inversión. 4. Incube a 37°C por 25 minutos. 5. Adicione 100 µL de NaCl 5M y mezcle por vórtex. 6. Agregue 80 µL de solución CTAB/NaCl. Mezcle e incube 10 minutos a 65°C en baño María. 7. Adicione 0.7 mL de cloroformo/alcohol isoamílico, mezcle por vórtex y centrifugue 5 minutos a 12,000 r.p.m. 30 8. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo. Agregue un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, mezcle por vórtex y centrifugue 5 minutos a 12,000 r.p.m. 9. Transfiera la fase superior a un tubo nuevo. Agregue 0.6 volúmenes de isopropanol y mezcle por inversión. 10. Centrifugue 10 minutos a 14,000 r.p.m. Elimine el isopropanol por decantación. 11. Lave con 1 mL de etanol al 70%. Centrifugue por 5 minutos a 14,000 r.p.m. 12. Elimine el etanol por decantación y coloque el tubo invertido sobre papel secante estéril. 13. Evapore el etanol a temperatura ambiente ó a 37°C por 5 minutos. 14. Disuelva el ADN en 100 µL de amortiguador TE. 15. Detecte por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1-1.2%. 16. Almacene el ADN resuspendido a -20°C. 31 5. PREPARACIÓN DE LA REACCIÓN DE PCR: 5.1 Utilice material estéril y guantes durante la preparación de la reacción. Mantenga los reactivos, controles e iniciadores en hielo mientras prepara la reacción. 5.2 Utilice como control positivo ADN genómico de la cepa Cff (Fuente: Colección de laboratorio). 5.3 Como control negativo utilice agua. 5.4 Dependiendo del número de muestras prepare un coctel (excepto ADN) y calcule la cantidad total de cada componente según la siguiente tabla: Componente Cantidad µL Agua grado PCR Iniciador CF4 (0.1 µg/µL) Iniciador CF5 (0.1 µg/µL) Master Mix 2X (Promega®) 4.25 0.5 0.5 6.25 ADN genómico (cepa aislada) Volumen final 1 12.5 Concentración final N/A 4 ng/µL 4 ng/µL Taq polimerasa 0.025 U/µL; ATP, dCTP, dGTP, dTTP 200 µM; MgCl2 1.5 mM; amortiguador pH 8.5 20 ng por reacción - 5.5 Mezcle con vórtex ligero y recupere la mezcla en el fondo del tubo con un pulso en la centrífuga. 5.7 Adicione a cada tubo 11.5 µL de la mezcla de PCR. 5.8 Adicione 1 µl de ADN o agua. El volumen de la reacción es de 12.5 µL para un PCR de la cepa aislada y de 25 µL para ADN genómico total de tejido. 5.9 Mezcle con vórtex ligero y recupere la mezcla con un pulso en la centrífuga. 5.10 Coloque los tubos en el termociclador y ejecute el siguiente programa: Temperatura °C Tiempo Evento Ciclos 94 94 55 72 72 4 min./5 min. 30 seg. 20 seg./25 seg. 45 seg. 5 min. Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineamiento de los iniciadores Extensión Extensión final 1 30 1 Tabla 2. Condiciones de PCR con los oligonucleótidos CF4 y CF5 (Guimaraes et al., 2001). Para ADN genómico de la cepa aislada utilice un tiempo de desnaturalización de 4 minutos y un tiempo de alineamiento de 20 segundos. Para ADN genómico total de tejido, use un tiempo de desnaturalización de 5 minutos y 25 segundos para el alineamiento. 32 5.11 Detecte mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Utilice amortiguador TBE 0.5x (Tris[hidroximetil]aminometano 44.5 mM, ácido bórico 44.5 mM, EDTA 0.5 mM, pH 8.3). 5.12 Para 12.5 µL de producto de PCR, adicione 2.5 µL de amortiguador de carga 5x y mezcle por vórtex. 5.13 Recupere la mezcla en el fondo del tubo con un pulso en la centrífuga y utilice 10 µL para cargar al gel. 5.14 Utilice como referencia un marcador de peso molecular de 0.1 a 2 Kpb. 5.15 Aplique una carga de 100 voltios por 30 minutos. 5.16 Coloque el gel sobre el transiluminador UV y fotografíe los resultados. Ver Figura 11. 5.17 Los productos de PCR pueden almacenarse a 4°C hasta que sean detectados. 1 2 3 4 5 6 7 2 Kb 0.6 0.3 0.2 0.1 Figura 11. Detección de Cff por PCR de punto final (iniciadores CF4/CF5) de cepas aisladas de semilla de frijol procedentes de los EE.UU. (2010). Carriles: 1) Marcador 0.1-2 Kpb, 2) CP, 3) CN, 4) Cff (variante color crema en agar B de King), 5) Cff (pigmentación rosa pálido), 6) Cff (pigmentación rosa) y 7) Cff (pigmentación salmón). De las 12 cepas aisladas y analizadas en este estudio, solo se muestran las más representativas. 33 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DETECCIÓN POR LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PUNTO FINAL) 1. La presencia de una bacteria fitopatógena se indica como POSITIVO y su ausencia como NEGATIVO. 2. Si en el control positivo no se observa amplificación se invalida el resultado del diagnóstico y se tendrá que repetir el ensayo de PCR. 3. En el control negativo no deberá observarse amplificación alguna. Si esto ocurre, se invalida el resultado del diagnóstico. Es recomendable preparar de nuevo los reactivos e iniciadores con agua recién esterilizada. MANEJO DE RESIDUOS QUÍMICOS Los restos de reactivos químicos peligrosos para el medio ambiente, corrosivos e inflamables son separados y almacenados en contenedores adecuados para que sean recolectados por un proveedor autorizado. 34 BIBLIOGRAFÍA Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. 2002. 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