ransporte de electrones y Fosforilación Oxidativa

IX. Transporte electrónico
Los electrones generados a partir de la oxidación de los sustratos
orgánicos en la rutas de glucólisis y ciclo de Krebs, son canalizados hacia un
aceptor final a través de una cadena de transportadores electrónicos.
Este proceso ocurre en una gran variedad de organismos tanto de
bacterias, de arkeas o de eucariotes. En los eucariotes este proceso ocurre en
las mitocondrias, una organela de la célula. Esta organela tiene un sistema de
dos membranas, una externa y otra interna. La membrana mitocondrial interna,
a diferencia de la externa, se encuentra extensamente invaginada y es
impermeable al paso de moléculas pequeñas e iones, que solo pueden
atravesarla utilizando transportadores específicos. Al espacio recubierto por la
membrana mitocondrial interna se lo conoce como matriz mitocondrial y al
espacio encerrado entre las dos membranas como espacio intermembrana.
Casi todos los transportadores electrónicos de la mitocondria se encuentran
íntimamente unidos a la membrana interna. Las enzimas que se utilizan para la
síntesis del ATP, también. En los microorganismos, arkeas o bacterias, la
membrana plasmática es equivalente a la membrana mitocondrial interna, el
citosol a la matriz mitocondrial mientras que el periplasma (el espacio externo a
la célula ubicado entre la membrana plasmática y la pared o membrana exterior
de la célula) es equivalente al espacio intermembranal. Por ello, en adelante los
procesos que describamos en la membrana mitocondrial interna de los
eucariotes tendrán su equivalencia con los que ocurren en la membrana
plasmática de los procariotes.
En los organismos aeróbicos la molécula que actúa como aceptor final de
los electrones es el oxígeno molecular, pero algunos microorganismos pueden
utilizar como aceptor final otros elementos como iones metálicos, sales
nitrogenadas o azufradas, azufre elemental o, incluso, alguna molécula
orgánica.
La cadena de transportadores electrónicos puede contener un único
complejo o varios. En los casos más complejos, se encuentran cuatro
complejos macromoleculares que son utilizados para canalizar los electrones
hacia el O2.
Estos complejos son el que contiene la NADH oxidoreductasa o complejo
I, el que contiene la succinato deshidrogenasa (u otras deshidrogenasas que
contengan el grupo prostético FAD) o complejo II, el que contiene la
Ubiquinona oxidoreductasa o complejo III, y el que contiene la citocromo
oxidasa o complejo IV. Este esquema se encuentra en los eucariotes y en
algunos microorganismos, mientras que algunas bacterias, contienen pequeñas
variaciones del mismo. Por ejemplo, en E. coli los componentes de lo que
denominamos complejos III y IV están en un único complejo de manera que el
sitio donde se reduce el O2 a H2O está dentro del mismo complejo donde se reoxida la dihidroquinona.
1
La transferencia de electrones a través de estos complejos está asociada
con la traslocación de H+ de un lado a otro de la membrana. Esta membrana
corresponde a la membrana mitocondrial interna en los organismos
eucarióticos o a la membrana plasmática de las bacterias o arkeas. La
traslocación de H+ genera, entonces, un gradiente electroquímico entre los dos
lados de la membrana. Este gradiente es una fuente energética que puede ser
utilizada por las células para realizar trabajo o para convertirla en otras formas
de energía, como la que es almacenada en forma de enlace químico en el
enlace fosfato de alta energía del ATP.
Al proceso de conversión de la energía del gradiente de concentración de
H en ATP, se lo denomina fosforilación oxidativa y se produce a nivel de una
enzima de membrana denominada ATP sintasa.
+
El esquema básico que estamos describiendo fue explicado en los
comienzos de la década del 60 por Peter Mitchell quien postuló la así
denominada hipótesis quimiosmótica. Esta hipótesis, despreciada en el
momento de su formulación, implicaba que como producto del transporte de
electrones a través de los complejos transportadores en la membrana interna
mitocondrial, se producía un intermediario de alta energía. Lo inusual del
planteo de Mitchell, fue proponer que ese intermediario no era ninguna especie
química de alta energía, como la mayoría de los científicos del momento
esperaban encontrar, sino más bien estaba conformado por el gradiente de
potencial electroquímico generado por la traslocación de iones (en este caso
H+). Para que su teoría tuviera algún respaldo experimental Mitchell propuso
tres postulados que deberían cumplirse (y que podían ser falseados
experimentalmente) si su hipótesis fuera correcta. Los postulados implicaban lo
siguiente:
1.
debería existir una conformación especial de los complejos
transportadores de electrones en la membrana de manera que se realice en
forma concomitante la traslocación de H+. Para ello, las reacciones donde se
absorben H+ deberían estar localizadas en el lado de la membrana que está en
contacto con la matriz mitocondrial (o el interior de la célula de un
microorganismo) y las reacciones donde se liberan H+ deberían estar
localizadas en el lado de la membrana que está en contacto con el espacio
intermembranal (o el exterior de la célula de un microorganismo). Este
concepto de reacciones "vectoriales" para las transformaciones realizadas en el
interior de las membranas, en contraposición a las "escalares" que se darían en
solución, fue una propuesta totalmente novedosa para la época.
2.
Para que exista como tal el gradiente electroquímico de H+ como
una forma de acumulación de energía en la célula, debería existir un sistema
de membranas intacto. Además este sistema de membranas debería ser
impermeable a los iones (en este caso H+) que forman el gradiente
electroquímico.
2
3.
Deberían existir enzimas embebidas en el mismo sistema de
membranas cuya actividad se encuentre asociada a la utilización de la energía
aportada por el gradiente electroquímico. Para ello estas enzimas deberían
poseer un canal específico para lo iones que posibilite que estos sean
transportados a favor del gradiente generado. Además, asociado a este
transporte de iones, la enzima debería cambiar su conformación o la del
sustrato de forma de favorecer la reacción que está catalizando.
Cada uno de estos postulados fue ensayado en sistemas libres de
células.
Primero se utilizaron mitocondrias aisladas para demostrar que, en
presencia de un aceptor de electrones como el O2, estas preparaciones eran
capaces de cambiar el pH de la suspensión únicamente si se agregaba al
medio un dador de electrones, como el succinato. Alternativamente se
demostró que la cadena de transporte electrónico estaba funcionando cuando
se utilizó en lugar de un aceptor electrónico natural, como el O2, un aceptor
electrónico artificial, como el colorante azul de metileno. Este colorante es
capaz de recibir electrones aportados por el complejo III, y al reducirse se
transforma desde su forma coloreada a una incolora, lo que permite seguir la
cantidad de electrones transferidos. Por otra parte, si estas mitocondrias eran
tratadas con un detergente débil, el cambio de pH no se observaba en ninguna
condición. El detergente induce la formación de poros y roturas en la
membrana mitocondrial, de manera que este experimento demuestra el
requerimiento de la integridad del sistema de membranas.
Además, se demostró la impermeabilidad de la membrana mitocondrial a
los H , incubando las mitocondrias aisladas a pH= 9 hasta que el pH interno y
el externo se equilibren, y luego pasándolas a una solución de pH = 7. En esta
nueva solución se midieron los cambios de pH y se determinó que las
mitocondrias podían mantener el pH interno durante un tiempo suficientemente
largo.
+
Para ensayar el tercer postulado se utilizaron liposomas reconstituidos in
vitro en presencia de uno o varios de los componentes proteicos de la
membrana de transporte. En el experimento crucial, se armaron vesículas
lipídicas que solo contenían los dos componentes de la ATP sintasa (F0 y F1) y
una proteína extraída del microorganismo Halobacterium halobium. Esta
proteína es la bacteriorodopsina, que actúa como una bomba impulsora de H+
en presencia de luz.
Los investigadores pudieron demostrar que el ATP era sintetizado
únicamente cuando estas vesículas eran iluminadas, o sea únicamente cuando
se había generado un gradiente de H+ a través de la membrana.
Además este experimento permitió mostrar que la síntesis de ATP no
requería en forma directa de la cadena de transporte electrónico, pero si de la
presencia de un gradiente de H+, no importa como fuera este generado.
3
Sin embargo, en las mitocondrias intactas los procesos de transporte
electrónico y de fosforilación oxidativa se encuentran íntimamente acoplados.
De hecho si uno de los dos es detenido por la presencia de un inhibidor
específico, el otro también se frena.
X. Mecanismos de transporte electrónico y traslocación de H+.
Lado P (++++)
2H
4 H+
4H
QH2
QH.
Q
QH2
QH2
2Q
(red)
2Q
bL
bH
(Fe-S)n
+
H
+
4H
NADH + H
FMNH.
NAD
+
(Fe-S)3
QH2
FMN
QH
H+
H+
H+
FADH.
.
Q
H+
(Fe-S)
(ox)
2 QH2
Cit c1
Succinato
hemo
½ O2
a
a3
CuB
hemo
QH2
2 H+
2H
H
FAD
CuA
2 Cit c
+
H+
Q
FMNH2
+
+
2 Cit c
+
+
½ H 2O
2 H+
FADH2
H+
Lado N (----)
Complejo I
Fumarato
Complejo II
Complejo III
Complejo IV
En la figura se muestra la estructura de los cuatro complejos de transporte electrónico
de la membrana mitocondrial interna..
Aclarar lado N y lado P
Complejo I
Este complejo esta formado por un core 14 subunidades conservadas en
procariotas y eucariotas, pero su estructura terciara aun no has sido dilucidada.
Sin embargo este complejo adopta una forma de L invertida, en donde se
distinguen dos módulo, uno hidrofóbico asociado a la membrana con capacidad
de translocación de protones y otro hidrofílico que se extiende hacia el espacio
matriz mitocondrial y que presenta actividad NADH oxireductasa.
4
En el complejo I los electrones del NADH son transferidos a una proteína
integral del complejo, la NADH oxidoreductasa, que tiene un grupo de FMN
fuertemente unido. El FMN recibe un par de electrones del NADH, su H+ y toma
un H+ de la matriz mitocondrial para convertirse en FMNH2. Los nucleótidos de
flavina (FMN o FAD) así como la coenzima Q que veremos más adelante, son
capaces de intervenir en transferencias electrónicas de a dos electrones al
mismo tiempo o de sólo un electrón por vez. En este último caso se genera un
intermediario (que incluso puede tener una carga negativa como en el caso de
la CoQ) que contiene un electrón desapareado. Estos intermediarios del FAD,
FMN o de la CoQ, son semiquinonas que, a diferencia de las formas totalmente
oxidadas o totalmente reducidas de las coenzimas, son normalmente
incapaces de moverse libremente a través de la membrana. Generalmente,
estas semiquinonas tienen sitios de anclaje a una proteína, perteneciente a
alguno de los complejos donde actúan, siempre en un sitio adyacente a una de
las soluciones acuosas en contacto con la membrana, ya sea la matriz o el
espacio intermembrana.
El FMNH2, cede un electrón a una proteína de Fe-S, la cual convierte un
Fe+3 en Fe+2, reduciéndose en el proceso. En forma concomitante un H+
proveniente del FMNH2 es liberado a la matriz mitocondrial y se genera el
.
intermediario radicalario FMNH .
Para que el proceso continúe, la proteína de Fe-S transfiere su electrón
hacia adelante, convirtiendo su Fe+2 en Fe+3, oxidándose, y preparándose para
.
recibir el otro electrón que queda en el intermediario FMNH .
A
N
5
C
C
C
H3C
1
N
H3C
N
C
5
C
1
N
O
C
O
O
H
N
5
H
OH
HC
OH
HC
OH
H
N
O
O
+
H3C
P
O
O
CH2
N
O
C H
CH
H3C
H
N
H3C
N
5
H
H
OH
OH
FMN (en negro) o FAD (en negro y azul)
los átomos reactivos están en rojo
NH
C
N
N
O
N
H C
1
R
Flavosemiquinona
(FMN. o FAD.)
N
HC
C
C
C
NH2
CH2
O
O
e-
H3C
HC
P
+
NH
C
CH2
-O
H
R
Flavoquinona
(FMN o FAD)
NH
N
N
H3C
C
O
H3C
B
O
C
C
C
1
NH
C
N
H
R
O
e-
H
+
Flavohidroquinona
(FMNH2 o FADH2)
A continuación, la proteína Fe-S cede sus electrones a una cadena de
centros Fe-S localizada en el brazo hidrofílico del complejo I. Finamente, los
5
O
electrones son trasportados a una coenzima Q oxidada la que se transforma en
.
el intermediario de semiquinona, Q , proceso que ocurre en este brazo
hidrofílico.
.
El siguiente electrón es entonces transferido desde el FMNH hacia la
primer proteína de Fe-S, que vuelve a convertir su Fe+3 en Fe+2, de esta a la
siguiente proteína de Fe-S y así sucesivamente hacia la semiquinona de la
coenzima Q. Esta última se transforma en coenzima Q totalmente reducida,
capta 2 H+ de la matriz y se libera hacia la membrana donde es soluble
pasando a formar parte de todo el conjunto de coenzimas Q reducidas (también
denominadas dihidroquinonas) que existe en la membrana mitocondrial interna.
Hasta aquí se han tomado de la matriz 1 H+ para la reducción del FMN y
2 H para la reducción de la quinona, pero se han liberado 2 H+ a la matriz
producto de la oxidación del FMNH2. De forma neta estos procesos consumen
1 H+ de la matriz por cada dos electrones transferidos del NADH a la quinona.
+
Por otra parte, además de los protones involucrados en la reducción de la
quinona, cuatro protones se toman de la matriz mitocondrial y se liberan en el
espacio intermembrana.
El mecanismo de esta translocación de protones no esta totalmente
establecido, pero probablemente intervenga un antiportador H+/Na+ ubicado
en el módulo de membrana. El mismo parece estar acoplado a cambios
conformacionales en la estructura del complejo I debido a la reacción de
oxidación de NADH.
La ecuación neta que describe los procesos que acontecen en el
complejo I se muestra a continuación:
NADH + Q + 5H+N => NAD+ + QH2+ 4H+P
Complejo II
Se denomina complejo II a una familia de complejos diferentes que son
capaces de extraer una par de átomos de H de una variedad de sustratos
diferentes. Todos estos complejos se diferencian en la enzima que comienza el
sistema de captura de los átomos de H, y son idénticos en el resto de los
componentes que transfieren estos átomos a la coenzima Q. En estos
complejos no hay mecanismos asociados de translocación de H+. El más
conocido de estos complejos es el que contiene como primer enzima a la
succinato deshidrogenasa. En este complejo los electrones del succinato son
transferidos a la enzima succinato deshidrogenasa, una proteína integral del
complejo, que tiene un grupo FAD fuertemente unido. El FAD recibe un par de
6
electrones del succinato, juntamente con su par de H+ para convertirse en
FADH2. El FADH2, cede sus electrones, de a uno a la vez, a una proteína de
Fe-S, la cual convierte un Fe+3 en Fe+2, reduciéndose en el proceso. En forma
concomitante, los 2 H+ provenientes del FADH2 son liberados a la matriz
mitocondria. Los electrones son transportados, de a uno a la vez, a través de
tres centros Fe-S en el interior del complejo. El aceptor final de estos
electrones, es la coenzima Q oxidada que se transforma en QH2 tomando dos
H+ de la matriz mitocondrial. Este complejo no genera una translocación neta
de protones.
La ecuación global de este complejo se muestra aquí:
Succinato+ Q => Fumarato + QH2
Complejo III
Los electrones transportados por la QH2 son cedidos de uno a la vez
hacia el citocromo C para producir dos moléculas de citocromo C reducidas. De
esta manera las quinonas son las coenzimas solubles que hacen de nexo entre
dos complejos. Uno de ellos, el dador de electrones, puede ser el complejo I o
el II y el otro, el aceptor de electrones, es, en este caso, el complejo III.
En el esquema mostrado más abajo se indica cómo es la ruta de
transferencia electrónica y de translocación de H+ en el complejo III. Como se
ve, el complejo puede dividirse en dos partes, una conformada por las
proteínas de Fe-S y los citocromos de tipo C, que se encuentra anclada a la
membrana adyacente al exterior de la célula o al espacio intermembranal, y la
otra, conformada por los citocromos de tipo b, que es un complejo proteico
integral a la membrana que tiene dos sitios de unión a la Coenzima Q, cada
uno situado en un sitio de la membrana adyacente a una solución acuosa y
ubicados en puntos opuestos de la misma.
O
O
H3C
H3C
O
H3C
CH3
CH3
H
CH2C
O
C CH2 H
O
Ubiquinona
(Coenzima Q)
O
H3C
O
H3C
O
CH3
H3C
6-10
e-
CH3
C CH2 H
6-10
O
Plastoquinona
O
e-
R
O
H
CH2C
H3C
O
H3C
O
CH3
e-
2 H+
OH
H3C
O
H3C
O
CH3
R
O
2 H+
e-
R
OH
Cambios en los estados de oxidación de la Ubiquinona
7
El sistema implica una ruta de reoxidación de la dihidroquinona en forma
cíclica que se denomina ciclo Q y que es análogo a uno que se encuentra en la
cadena de transporte de la membrana tilacoidal de los organismos
fotosintéticos.
1ª Etapa
Q
Q.-
e-
cred
Espacio intermembrana
o exterior celular
2H+
e-
Fe-S
b566
c
e- c1 e
QH2
e-
Membrana mitocondrial interna
o membrana plasmática
b560
e-
Q
Q.Matriz mitocondrial
o citosol
cred
2ª Etapa
2H+
Q
Q.-
e-
Espacio intermembrana
o exterior celular
e-
Fe-S
b566
e-
c
c1 e-
QH2
e-
Membrana mitocondrial interna
o membrana plasmática
b560
eQ.-
QH2
Matriz mitocondrial
o citosol
2H+
2x cred
Reacción global
Q
2Q
2x 1e-
4H+
2
Q.-
Espacio intermembrana
o exterior celular
2x 1e-
b566
Fe-S
2x 1e-
c
c1 2x 1e-
QH2+ QH2
2x 1e-
Membrana mitocondrial interna
o membrana plasmática
b560
Q
e-
eQ.2H+
QH2
Matriz mitocondrial
o citosol
Gracias a este ciclo, como puede observarse en la reacción global, un par
más de H+ son transportados de un lado al otro de la membrana comparado
con lo que se obtendría de una transferencia lineal de los electrones. En
síntesis, una QH2 cede sus dos electrones (de a uno por vez) a la proteína de
8
Fe-S y esta al citocromo C1, que termina reduciendo al citocromo C. Cómo dos
electrones son transportados en este sistema, dos moléculas de citocromo C
terminan reducidas (de Fe+3 a Fe+2), pueden liberarse de la membrana y
transportar los electrones hacia el siguiente complejo. El citocromo C es una
molécula soluble en solución acuosa que se une débilmente a la membrana
plasmática y de esta manera está ubicado estratégicamente para transferir
electrones entre los complejos III y IV.
Este complejo toma 2 H+ de la matriz mitocondrial y libera 4 H+ al espacio
intermembrana por cada par de electrones transportados hacia el aceptor final.
Para este complejo, la ecuación global se indica a continuación:
2 Cit Cox + QH2 + 2 H+N => 2 Cit Cred + Q + 4 H+P
Complejo IV
En el complejo IV los electrones transportados por el citocromo C son
transferidos al aceptor final. En los eucariotes, este complejo tiene dos
citocromos de tipo a y tres átomos de Cu firmemente unidos a las proteínas del
complejo. Los citocromos, tal como todos los componentes de esta familia de
proteínas, pueden convertirse entre los estados Fe+3 y Fe+2 mientras que los
átomos de Cu pasan por los estados de oxidación Cu+2 y Cu+1 en las
reacciones de reducción u oxidación.
Los electrones cedidos por el Citocromo C reducido son inicialmente
captados por un centro binuclear de átomos de cobre llamado CuA, luego son
transferidos a un grupo hemo llamado Hemo a. De allí los electrones se
transfieren a un centro binuclear compuesto por un átomo de Cobre (CuB) y
otro grupo hemo (Hemo a3).
En el caso de que el aceptor final sea el O2, como sucede en eucariotas y
algunas bacterias, este es reducido en etapas que involucran la transferencia
de cuatro electrones. Para reducir un átomo de O2 y formar dos moléculas de
H2O se requiere la transferencia de cuatro electrones a través de este
complejo, además cuatro protones son tomados desde la matriz mitocondrial.
Todo esto acontece en el centro binuclear Hemo a3 - CuB. Además, acoplado a
este proceso otros cuatro protones son translocados desde la matriz al espacio
intermembrana, mediante un mecanismo no conocido.
B
B
En eucariotas este complejo consume 2 H+ de la matriz y transloca otros 2
H+ al espacio intermembrana por cada par de electrones transportados hacia el
aceptor final, la ecuación neta se muestra aquí abajo.
9
2 cyt C ox + 1/2 O2 + 4 H
+
N
+
P
=> 2 cyt C red + H2O + 2 H
En bacterias existe un complejo de transferencia de electrones a un
aceptor final (a veces diferente del O2) que guarda semejanza con el complejo
IV de eucariotes. Algunos de estos complejos poseen, incluso la misma
estequiometría de transporte de H+ que el complejo IV de eucariotes, pero en
algunos casos es el doble. Otros sin embargo, no tienen el mecanismo
asociado de translocación de H+ y, únicamente aportan a la formación del
gradiente mediante la captura de un par de H+ durante la formación de la
molécula de H2O o del aceptor final reducido hidrogenado. Otros, en los que el
aceptor final no se hidrogena, solamente poseen un mecanismo de
translocación. En particular en E. coli existen dos ubiquinol oxidasas (en lugar
de Citocromo C oxidasa). Ambas reducen al O2 pero difieren en la afinidad por
el mismo y en la estequiometría de translocación de protones. En un caso es
de 1H+/e- y en el otro es el doble.
Ecuación global
Finalmente de acuerdo a lo expresado anteriormente la ecuación global
para el transporte de dos electrones a través de la cadena de transporte en una
mitocondria eucariota es la siguiente:
+
NADH + 1/2 O2 + 11 H
N
+
+
P
=> NAD + H2O + 10 H
XI. Fosforilación oxidativa
El mecanismo de la fosforilación mediada por un gradiente de iones H+
ocurre en una proteína integral de la membrana mitocondrial interna o de la
membrana citosólica de los microorganismos. Esta proteína es la ATP sintasa.
10
Las ATP sintasas conocidas, constan de al menos dos componentes. Uno
de ellos es el que forma el canal de transporte de H+ a través de la membrana y
se denomina FO debido a que el transporte mencionado puede ser bloqueado
por el inhibidor oligomicina. El otro componente, está débilmente unido a la
Matriz
Mitocondrial
Membrana
Interna
Espacio
Intermembranal
Citosol
+
H
+
H
+
H
ADP + Pi
+
+
H
ATP
H
+
H
+
H
ATP sintasa
H
+
H
F1
+
+
+
H
+
H
H
Fo
+
H
+
H
+
H
+
H
H
+
+
H
+
H
+
H
ATP
ATP
ADP
H
Transportadores
H
+
H
ADP
+
Metabolismo
Celular
+
H
+
+
H
+
H
Pi
Pi
+
H
+
H
membrana por interacciones con el FO y cuando es aislado y separado de la
otra subunidad se comporta como una activa ATPasa. En este componente,
denominado F1, se realiza la síntesis de ATP en la membrana. FO está
constituido por una serie de proteínas con estructura de hélices α que cruzan la
membrana ida y vuelta formando un canal. F1, en cambio está formado por
varias subunidades proteicas que le dan una conformación globular. Las
proteínas que forman a F1 toman una simetría ternaria de manera que en todo
momento hay tres sitios catalíticos. Estos sitios pueden pasar por tres
conformaciones posibles cada uno con respecto a su afinidad hacia los
nucleótidos. Estas conformaciones reciben el nombre de abierta, que libera el
ATP; débil, que se une débilmente al ADP y al Pi; y fuerte, donde el ADP y el
Pi se convierten a ATP. Vista en un momento determinado, F1 tiene un
oligómero en cada uno de los estados mencionados. Cuando 3 iones H+
atraviesan el poro de FO, cada uno de los confórmeros de F1 cambia su
estructura de manera que la conformación abierta se convierte en débil, débil
en fuerte y fuerte en abierta. Termodinámicamente el último cambio
mencionado (fuerte en abierta) es el que requiere de más energía, por lo que la
11
reacción que posee un ΔG muy positivo en esta enzima no es la síntesis de
ATP 1 sino la liberación del mismo.
Si intentamos calcular el rendimiento de ATP sintetizado por cada una de
las moléculas de sustrato que fueron oxidadas en un organismo determinado,
hay que tomar en cuenta las características peculiares de su metabolismo. En
general, en la literatura vamos a encontrar diferentes estequiometrías con
respecto al rendimiento energético del metabolismo aeróbico de la glucosa.
Esto se debe a que distintos autores realizan diferentes consideraciones y
aproximaciones 2 para acercarse a la resolución del tema.
Para responder correctamente a esta cuestión hay que tener en cuenta
que el número de moléculas de ATP que se producirán durante la degradación
oxidativa completa de un sustrato, hasta CO2 + H2O, dependerá de una serie
de consideraciones, entre ellas:
i.
El rendimiento en moléculas de ATP (u otras que contengan enlaces de alta
energía) en reacciones de fosforilación a nivel de sustrato.
ii.
La cantidad y calidad de coenzimas reducidas generadas en la oxidación completa
del sustrato.
iii.
El número de los transportadores electrónicos con capacidad de translocar H+ del
organismo.
iv.
La equivalencia de número de H+ translocados por cada par de electrones que
atraviesan a cada uno de los complejos de transporte electrónico del organismo
considerado.
v.
El número de H+ requeridos en la ATP sintasa para sintetizar una molécula de
ATP
vi.
El consumo de energía adicional, en reacciones de transporte intracelular,
necesario para llevar al ATP hasta su sitio de utilización mayoritaria en la célula.
De esta manera, es posible diferenciar el rendimiento de ATP/glucosa
oxidada en los diferentes tipos celulares, bacterias y arkeas por un lado, y
eucariotas por el otro.
En las consideraciones de los puntos i., ii., y v., hay un acuerdo general
en la bibliografía y, además, los resultados son equivalentes en los tres tipos de
células. La oxidación completa de una molécula de glucosa rinde 2 moléculas
de ATP mediante la glucólisis junto con 2 moléculas de Acetil-CoA y una
molécula de ATP (o GTP) en el ciclo de Krebs por cada Acetil-CoA degradado
hasta CO2. En total la recuperación de energía en reacciones de fosforilación a
nivel de sustrato es equivalente a la síntesis de 4 moléculas de ATP por cada
molécula de glucosa oxidada completamente.
1
por medidas realizadas en los últimos años se estima que la reacción entre el ADP y el Pi para dar ATP
se encuentra prácticamente en el equilibrio en el seno de esta enzima.
2
generalmente no enunciadas en forma explícita
12
El rendimiento en coenzimas reducidas producidas por cada molécula de
glucosa que fue oxidada, es de 2 moléculas de NADH en la glucólisis hasta
piruvato, 2 moléculas de NADH en la conversión de 2 moléculas de piruvato en
2 de Acetil-CoA y, finalmente, 6 moléculas de NADH y 2 de coenzima QH2 por
cada par de moléculas de Acetil-CoA degradadas hasta 4 CO2.
Además, existe la convicción que se requiere del pasaje de 3 H+ a través
del canal de la ATP sintasa, para la síntesis de una molécula de ATP.
Hasta aquí todos de acuerdo, con la pequeña salvedad que algunos
consideran al FADH2 en lugar de la coenzima QH2 como producto del ciclo de
Krebs, lo que a los efectos prácticos del cálculo estequiométrico es indistinto.
La reacción catalizada por la enzima succinato deshidrogenasa provoca la
eliminación de un par de H de un par adyacente de átomos de carbono internos
de la molécula de succinato para generar un doble enlace entre esos carbonos
en la molécula de fumarato. Es verdad que el primer aceptor de los electrones
puestos en juego en esta reacción es el FADH2. Sin embargo, la molécula de
FADH2 se encuentra firmemente unida al centro activo de la enzima succinato
deshidrogenasa y en la práctica es parte de ella. Por lo mismo el FADH2 en
esta reacción no puede ser considerado la coenzima producto de la misma
porque para que la enzima vuelva a ser útil y cumplir otro ciclo catalítico el
FADH2 debe ser reoxidado a FAD cediendo los electrones a la coenzima Q
para producir la coenzima Q reducida (QH2). El FADH2 es en realidad un grupo
prostético en esta reacción. Esta reacción ocurre en el seno de la membrana
(plasmática en el caso de los microorganismos o mitocondrial interna en el
caso de los eucariotes) y el producto, Coenzima Q, es capaz de moverse
dentro de la misma para transportar los electrones de un sitio catalítico hasta
otro, la misma función que el NADH realiza en solución. En definitiva,
considerar al FADH2 el producto de la succinato deshidrogenasa, es lo mismo
que considerar al FMNH2 como producto de la piruvato deshidrogenasa.
De aquí en adelante hay distintas interpretaciones acerca del rendimiento
global. En principio la mayoría de los libros de texto consideran solamente la
situación de las mitocondrias eucariotas. En realidad, el número de
transportadores electrónicos con capacidad de translocar H+ es variable y
depende de la conformación de la cadena de transporte particular de un
organismo determinado. En las mitocondrias eucariotas se encuentran cuatro
complejos de transporte, tres de los cuales pueden translocar protones. En
otros organismos 3 el número puede variar entre 1 y 4.
Algunos libros de texto, no consideran exactamente el número total de H+
que se translocan por cada par de electrones transportados a través de cada
uno de los complejos. En la bibliografía más moderna se reconoce que por
cada molécula de NADH que transfiere sus electrones al O2 por medio de la
cadena de transporte de electrones se translocan, de un lado al otro de la
membrana, un total de 10 H+ para generar el gradiente electroquímico, y que
3
u organelas como el hidrogenosoma de algunos protistas.
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por cada molécula de QH2 (o FADH2) que hace lo mismo se translocan un total
de 6 H+.
De esta manera el cálculo estequiométrico daría 3,3 (y no 3) moléculas de
ATP por cada NADH que cede sus electrones al O2 y 2 moléculas de ATP por
cada QH2 que hace lo mismo.
Este cálculo es real solamente para las bacterias y las arkeas que
contienen una cadena de transporte formada por 4 complejos equivalentes a
los mitocondriales. En estos organismos entonces una molécula de glucosa
rinde 4 ATP por fosforilación a nivel de sustrato, 10 NADH y 2 QH2 a través de
su oxidación completa hasta CO2 y H2O, lo que resulta equivalente a un total de
41 moléculas de ATP sintetizadas por cada molécula de glucosa oxidada.
En los eucariotes hay que hacer otras consideraciones. Principalmente, la
síntesis del ATP se realiza en la matriz mitocondrial mientras que su utilización
mayoritaria es en el citosol celular. Además ni el ATP ni el NADH son capaces
de atravesar la membrana mitocondrial interna sin gasto energético.
Por ello, las moléculas de NADH generadas por glucólisis (en el citosol)
deben ser incorporadas en la mitocondria. Esto no ocurre nunca en la realidad.
Sin embargo si es posible transportar los electrones del NADH desde el exterior
hasta el interior de la mitocondria. En algunos organismos, esto se realiza por
mecanismos denominados de lanzaderas en los que están involucrados
reacciones redox en ambos lados de la membrana mitocondrial interna, junto
con una enzima ubicada en el interior de dicha membrana. Hay dos tipos de
lanzaderas conocidas. En uno de ellos el producto es NADH en el interior de la
mitocondria mientras que en el otro el producto es coenzima QH2, en la
membrana mitocondrial. En este último caso habría que realizar una corrección
estequiométrica cuando se considera el rendimiento en ATP a partir de los
electrones del NADH citosólico.
Sin embargo, la corrección más importante y que pocos realizan,
corresponde al gasto asociado al transporte del ATP de la mitocondria al citosol
y a la incorporación concomitante del ADP y el fosfato desde el citosol a la
matriz mitocondrial.
Como está ilustrado en la figura más arriba, debido al funcionamiento de
la cadena de transporte electrónico a través de la membrana interna, los H+ son
acumulados en el espacio intermembranal de la mitocondria.
Como mencionamos antes, se requiere del pasaje de 3 de estos protones
de nuevo hacia la matriz mitocondrial a través del poro de la subunidad Fo de
la ATP sintasa anclada en la membrana interna, para que se sintetice una
molécula de ATP. Esta reacción ocurre en el sitio específico dentro de la
subunidad F1 de la ATP sintasa que utiliza al ADP y al Pi como sustratos. La
síntesis de ATP consume los sustratos de la ATP sintasa, el ADP y el Pi.
Como la síntesis de ATP y el transporte electrónico están acoplados, para
que el transporte continúe, el ATP debe ser consumido, para regenerar el ADP
y el Pi. El ATP es consumido mayoritariamente en el citosol por el metabolismo
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celular, generando como productos ADP y Pi. Por lo mismo, para que el
transporte electrónico (y el metabolismo celular asociado) continúe
funcionando, el ATP debe ser exportado de la mitocondria y el ADP y el Pi
deben ser importados desde el citosol.
Esto ocurre a través de proteínas transportadoras específicas de la
membrana mitocondrial interna. Una de estas proteínas es un intercambiador
de ATP por ADP. El ATP sale de la mitocondria y el ADP entra en ella, ambos a
favor de un gradiente de concentración por lo que el transporte en este caso
parece pasivo. Sin embargo, el transporte consume energía del gradiente
electroquímico ya que la carga neta del ATP es aproximadamente una unidad
más negativa que la del ADP. Por lo mismo, este transporte implica la entrada
de una carga negativa hacia el sitio donde más concentradas están estas
cargas. Por otro lado, el Pi es incorporado a la mitocondria cotransoportado con
un ion H+. Este segundo transportador utiliza la parte química del gradiente
electroquímico de H+, para incorporar a la mitocondria un Pi necesario para la
síntesis del ATP.
De esta manera por cada molécula de ATP que es sintetizada en una
célula eucariota y transportada hacia el citosol se consumen un total de 4 iones
H+ (3 en la síntesis y 1 en el transporte).
Como habíamos dicho antes, por cada molécula de NADH que transfiere
sus electrones al O2 por medio de la cadena de transporte de electrones se
translocan, de un lado al otro de la membrana, un total de 10 H+ para generar
el gradiente electroquímico, y que por cada molécula de QH2 (o FADH2) que
hace lo mismo se translocan, de un lado al otro de la membrana, un total de 6
H+. Cómo en este caso, se requieren del pasaje de 4 H+ para la síntesis de una
molécula de ATP, el cálculo estequiométrico daría 2,5 (y no 3) moléculas de
ATP por cada NADH que cede sus electrones al O2 y 1,5 moléculas de ATP por
cada QH2 que cede sus electrones al O2.
En los eucariotes, entonces una molécula de glucosa rinde 4 ATP por
fosforilación a nivel de sustrato, 10 NADH (2 en el citosol y 8 en la mitocondria)
y 2 QH2 a través de su oxidación completa hasta CO2 y H2O. En definitiva, este
cálculo es equivalente a un total de 32 moléculas de ATP por cada molécula de
glucosa si se utiliza la lanzadera que rinde NADH en el interior mitocondrial y
30 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa si se utiliza la lanzadera
que rinde QH2 en el interior mitocondrial.
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