PRODUCCIÓN MASIVA DE Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

PRODUCCIÓN MASIVA DE Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith) Dye
MASSIVE MULTIPLICATION OF Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith) Dye
Serafín Cruz-Izquierdo1 , Porfirio Ramírez-Vallejo1 , Bertha Tlapal-Bolaños2, Iván Ramírez-Ramírez1,
Roberto García-Espinosa2 , José Sergio Sandoval-Islas2 y Fernando Castillo-González1
Especialidad de Postgrado en Genética, IREGEP, y en 2 Fitopatología, IFIT. Colegio de Postgraduados. 56230, Montecillo. Estado de México. (sercruz@colpos.colpos.mx)
1
RESUMEN
ABSTRACT
El tizón común del frijol (Phaseolus vulgaris L.), inducido por la
bacteria Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap)
[=Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Xcp)], reduce el rendimiento de esa planta hasta en 45% y afecta la calidad de la semilla. La resistencia genética del frijol a dicha bacteria es el método
de control más económico y ambientalmente apropiado. Durante
el proceso de mejoramiento para resistencia, es necesario inocular una gran cantidad de material genético, y para ello se necesita
una cantidad alta de inóculo. Con objeto de evaluar un método
alternativo de cultivo de bacteria en medio líquido, se obtuvieron
tres aislamientos de Xap de las variedades de frijol común: Negro
Veracruzano, Canario 107 y Bayomex. El incremento del inóculo
se realizó en medio de cultivo líquido YDC (levadura-dextrosacarbonato de calcio) y sólido (levadura-dextrosa-carbonato de calcio-agar). En la primera fase se midió el patrón de crecimiento de
la bacteria. Los tres aislamientos se evaluaron a una concentración de 109 UFC mL-1 (unidades formadoras de colonias), en un
diseño de Bloques Completos al Azar con dos repeticiones, en dos
variedades altamente susceptibles, Flor de Mayo Criollo y Negro
P20, en invernadero. En una segunda fase se evaluó la severidad
de los aislamientos; 20 folíolos fueron inoculados con patógeno
proveniente del medio líquido y 20 folíolos con patógeno del medio sólido en Flor de Mayo Criollo y Negro Jamapa. Treinta días
después de la inoculación el aislamiento de Xanthomonas de la
variedad Negro Veracruzano fue el más patogénico, en invernadero y en cámara húmeda. Estos resultados demuestran que la bacteria se puede cultivar fácilmente en medio líquido sin disminuir
su patogenicidad y que es posible ajustar la concentración mediante diluciones con el uso de un espectrofotómetro. Para obtener 109 unidades formadoras de colonias se requiere una lectura
de 0.065 de absorbancia a 520 nm.
Common bacterial blight [Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
(Xap) = Xanthomonas campestris pv. phaseoli] decreases dry bean
yield up to 45%, as well as its seed quality. Bean genetic resistance
to this bacterium is the most economic and environmentally
appropriate method to control this pathogen. During the breeding
process for resistance it is required to inoculate large amounts of
genetic material; therefore, a vast amount of inoculum is needed.
With the aim of evaluating an alternative method to culture the
bacterium in liquid media, three isolates of Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli were obtained from three common bean
(Phaseolus vulgaris L.) cultivars: Negro Veracruzano, Canario 107,
and Bayomex. Inoculum culture took place in liquid (yeastdextrose-calcium carbonate) and solid (yeast-dextrose-calcium
carbonate-agar) YDC media. In the first phase the bacterial growth
pattern was measured. The three isolates were evaluated at a
concentration of 109 CFU mL-1 (colony forming units) under
greenhouse conditions in a Randomized Complete Block design
with two replications, using two highly susceptible cultivars: Flor
de Mayo Criollo and Negro P20. In the second phase sets of 20
leaflets, were inoculated using inoculum from either liquid or solid
media, in bean cultivars Flor de Mayo Criollo and Negro Jamapa.
Thirty days after inoculation, the Xanthomonas isolate from Negro
Veracruzano was the most pathogenic in greenhouse and humid
chamber conditions. These results show that the bacterium may
be easily cultured in liquid media without losing its pathogenicity,
where concentrations may be adjusted by dilution using a
spectrophotometer. To obtain 109 CFU’s a reading of 0.065 UA at
520 nm would be needed.
Palabras clave: Phaseolus, métodos de inoculación, resistencia
genética, tizón común, unidades formadoras de colonias.
INTRODUCTION
Keywords: Phaseolus, inoculation methods, genetic resistance,
common bacterial blight, colony forming units.
C
ommon bean (Phaseolus vulgaris L.) blight in
duced by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
(Xap) (=Xanthomonas campestris pv. phaseoli
(Xcp) (Vauterin et al., 1995) is one of the most damaging
diseases in bean production areas (Cardona et al., 1994),
particularly in tropical and subtropical regions. Damage
can be severe, with grain production losses of up to 45%,
since high temperature and frequent precipitation favor
Recibido: Mayo, 2000. Aprobado: Octubre, 2001.
Publicado como ENSAYO en Agrociencia 35: 575-581. 2001.
575
576
AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 5, SEPTIEMBRE-OCTUBRE 2001
INTRODUCCIÓN
L
a bacteriosis o tizón común del frijol (Phaseolus
vulgaris L.) inducida por Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli (Xap) (=Xanthomonas
campestris pv. phaseoli (Xcp) (Vauterin et al., 1995) es
una de las enfermedades más importantes en las áreas de
producción de frijol (Cardona et al., 1994), especialmente
en las regiones tropicales y subtropicales. En éstas el daño
puede ser severo, con pérdidas mayores a 45% de la producción de grano, debido a que la presencia de altas temperaturas y lluvias frecuentes favorecen el desarrollo del
patógeno (Yoshii, 1980). Ante la baja eficiencia del control químico, además de su costo ambiental y económico, la resistencia genética se presenta como un método
más efectivo y barato (Zapata et al., 1985; Yu et al., 1998).
Los programas de mejoramiento genético de
Phaseolus enfatizan la identificación de germoplasma
como fuente de resistencia a X. axonopodis pv. phaseoli
(Saettler, 1977; Valladares-Sanchez et al., 1979; Yoshii,
1980; Ramírez et al., 1996) y se han desarrollado variedades tolerantes a esta bacteria (Freytag et al., 1982;
Rosas et al., 1997; Kelly et al., 1998; Miklas et al., 1999).
Esto requiere aplicar diferentes técnicas de inoculación
de bacterias fitopatógenas en cultivos vegetales (Coyne
y Schuster, 1983; Aggour et al., 1989); la base de algunas es la forma en que las plantas permiten el acceso de
líquidos a su sistema vascular. Así, las bacterias en suspensión de 10 6 a 10 10 UFC mL-1 (unidades formadoras
de colonias) se aplican a los sitios de infección e inducen
la penetración a través de los estomas, hidatodos o heridas (Aggour et al., 1989).
La eficiencia de las técnicas de inoculación depende
de factores ambientales (temperatura, humedad y luz),
de la planta (hábito de crecimiento y variedad, etapa
fenológica, apertura estomatal, nutrición, manejo después
de la inoculación y condiciones fisiológicas) y del patógeno (concentración, edad del inóculo y variación
genética) (Coyne et al., 1973). La interacción múltiple
de estos factores complica la evaluación de genotipos a
gran escala, sobre todo por la variación o pérdida de
patogenicidad durante el manejo de la bacteria en el laboratorio.
Generalmente el aislamiento, incremento e identificación de la colonia bacteriana se realiza en medio de cultivo YDC (levadura, dextrosa, carbonato de calcio) a base
de extracto de levadura (10 g), dextrosa (20 g), carbonato
de calcio (20 g) y agar (15 g) en un litro de agua destilada,
selectivo para Xanthomonas (Gilchrist-Saavedra et al.,
1995). La bacteria es Gram negativa (0.4 a 0.9 µ diámetro; 0.6 a 2.6 µ de longitud), móvil con un solo flagelo
polar y aeróbica, y las colonias son convexas, de color
amarillo brillante, con actividad lipolítica e hidrolizan
gelatina, caseína y almidón (Schaad y Stall, 1980).
pathogen development (Yoshii, 1980). Given the low
efficiency of chemical control, besides its environmental
and economic costs, genetic resistance would be a cheaper
and more effective method for controlling Xanthomonas
(Zapata et al., 1985; Yu et al., 1998).
Genetic breeding programs of Phaseolus emphasize
identification of germplasm as a source of resistance to
X. axonopodis pv. phaseoli (Saettle, 1997; ValladaresSanchez et al., 1979; Yoshii, 1990; Ramírez et al., 1996).
Tolerant varieties to this bacteria have also been developed
(Freytag et al., 1982; Rosas et al., 1997; Kelly et al., 1998;
Miklas et al., 1999). For this purpose, different plantpathogenic bacteria inoculation techniques in crops are
required (Coyne y Schuster, 1983; Aggour et al., 1989).
Some techniques allow the entrance of liquids to the
plant’s vascular system. Bacterial suspensions of 106 to
10 9 CFU’s (colony forming units) per mL are applied to
infection sites, inducing penetration through stomata or
wounds (Aggour et al., 1989).
Efficiency of inoculation techniques depends on
environmental conditions (temperature, humidity, and
light), plant (growth habit, cultivar, phenological stage,
stomata opening, nutrition, handling after inoculation, and
physiological conditions), and pathogen (concentration,
inoculum age, and genetic variation) species (Coyne et
al., 1973). Multiple interactions among these factors
complicate genotype evaluation on a big scale, mainly
due to pathogenicity loss or variation when handling
bacteria in the laboratory.
In general, isolation, production, and identification
of the bacterial colony occurs in solid YDC culture media
prepared from yeast extract (10 g), dextrose (20 g),
calcium carbonate (20 g), and agar (15 g) in 1 L of distilled
water. This medium is selective for Xanthomonas
(Gilchrist-Saavedra et al., 1995). The bacteria is aerobic,
Gram negative (0.4 to 0.9 µ diameter; 0.6 to 2.6 µ length),
and mobile, with a polar flagella. Bacterial colonies are
bright yellow, convex shaped, with lypolitic activity, and
they hydrolize gelatin, casein, and starch (Schaad and
Stall, 1980).
To apply Koch’s postulates to Xap susceptible
germplasm is required (a few individuals) and conditions
that ease bacteria development in the plant. Field
evaluations become difficult due to the increase in the
number of individuals, and inoculation techniques are
important (Valladares-Sanchez et al., 1983).
Once Xap -resistant or -tolerant germplasm is detected,
breeding methods are applied to increase tolerance levels
(Coyne and Schuster, 1983; Ramírez et al., 1996; Yu et
al., 1998) either in improved germplasm or when creating
new cultivars. Evaluation of large numbers of potential
individuals, in controlled or field conditions, requires fast
and optimum production of inoculum volumes (106 to
10 10 CFU mL-1) since inoculation must be carried out
CRUZ-IZQUIERDO et al.: PRODUCCIÓN MASIVA DE Xanthomas axonopodis
Para aplicar los postulados de Koch a la bacteria, se
requiere germoplasma susceptible (pocos individuos) y
condiciones que faciliten el desarrollo de la epidemia en
la planta; el proceso se complica en campo, ya que el
número de individuos a evaluar se incrementa e influye
la técnica de inoculación (Valladares-Sanchez et al.,
1983).
Una vez detectado el germoplasma como fuente de
resistencia o tolerancia a Xap, se aplican métodos de mejoramiento para incrementar los niveles (Coyne y
Schuster, 1983; Ramírez et al., 1996; Yu et al., 1998), ya
sea en germoplasma mejorado o en la generación de nuevas variedades. Para evaluar el amplio número de individuos potenciales, en condiciones controladas y en campo, es necesario producir inóculo (106 a 10 10 UFC mL-1),
en poco tiempo y volúmenes óptimos, pues la inoculación debe hacerse con cultivo bacteriano joven (máximo
48 h), libre de contaminantes como bacterias saprófitas
o no patógenas.
Caroline et al. (1996) evaluaron la presencia de tizón común en Phaseolus en poblaciones segregantes
de dos genotipos, resistente (BAT 41) y susceptible
(OAC 88-1), y desarrollaron un método basado en la
prueba de 32 P y de análisis densitométrico para cuantificar Xanthomonas campestris pv. phaseoli en tejido
infectado. La cuantificación de la población bacteriana
presentó una alta correlación (r=0.98) con el número de
UFC de la misma muestra de hoja.
En relación con las técnicas para inocular a gran escala Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, no existe información suficiente que permita a los fitomejoradores
mayor avance y eficiencia en la selección de germoplasma con resistencia a este patógeno, sobre todo en la metodología para incrementar y lograr la concentración adecuada del inóculo. El objetivo de este trabajo fue evaluar
un método para incrementar bacterias en medio líquido
sin perder su patogenicidad.
MATERIALES
Y
MÉTODOS
Aislamiento de Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli
En el ciclo de cultivo primavera-verano de 1999 se colectó tejido
vivo de frijol con síntomas característicos de tizón común, en el campo experimental de la Universidad Autónoma Chapingo. De las muestras tomadas se aisló la bacteria en el laboratorio de Fitopatología del
Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados con base en la
metodología de Schaad y Stall (1980) y Gilchrist-Saavedra et al. (1995).
Se obtuvieron tres aislamientos identificados de acuerdo con el germoplasma de procedencia: de Negro Veracruzano, de Canario 107, y
de Bayomex. Los aislamientos se mantuvieron en un medio de cultivo
a base de YDC agar, a − 4 o C, el tiempo necesario para inocular plántulas
de frijol (30 días).
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with young bacteria (48 h maximum age) free of
contaminants such as saprophyte or non-pathogenic
individuals.
Caroline et al. (1996) evaluated the presence of
common blight in segregant populations of resistant
(BAT 41) and susceptible (OAC 88-1) genotypes of
Phaseolus. They also developed a method based on a
32 P test and densitometric analysis to quantify
Xanthomonas campestris pv. phaseoli in infected tissue.
Quantification of the bacterial population showed a high
correlation (r=0.98) with number of CFU’s from the
same leaf sample.
There is little information on mass inoculation
techniques for Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli that
allow plant breeders to make greater and more efficient
advances in selecting germplasm resistant to this
pathogen; mainly on methodology to produce inoculum
in adequate concentrations. The objective of this study
was to evaluate a method to increase bacteria in liquid
medium without losing the organism’s pathogenicity.
MATERIALS
AND
METHODS
Xanthomonas axonopodis
pv. phaseoli isolation
In the 1999 spring-summer crop cycle, live bean tissue showing
common blight symptoms was collected from fields of the
Universidad Autónoma Chapingo Experiment Station. Bacteria were
isolated from collected samples in the Plant Pathology Laboratory
at the Instituto de Fitosanidad of the Colegio de Postgraduados.
Schaad and Stall’s (1980) and Gilchrist-Saavedra et al. (1995)
isolation methodologies were used. Three isolates were obtained and
identified according to their germplasm of origin: Negro Veracruzano,
Canario 107, and Bayomex. The isolates were kept in solid YDC
growth media, at − 4 oC, for a 30 d period, needed before inoculation
of bean seedlings.
Increase and concentration of the inoculum
To increase bacteria using liquid YDC growth media (without
agar), a growth speed and a calibration curve was established to
determine inoculum concentration at 109 CFU mL-1.
Bacterial cells from the three isolates were increased in
Xanthomonas-selective YDC media (Gilchrist-Saavedra et al., 1995).
Five Petri dishes with YDC-solid and 100 mL of YDC-liquid media
were used for bacterial growth. Both cultures were incubated for 48 h;
Petri dishes were kept between 27 and 30 o C, while the liquid culture
stayed in an orbital agitation bath at 30 o C, agitated at 275 rpm.
Inoculum at 109 CFU mL-1 was later obtained by proper dilution in
saline solution.
A 1% saline solution (1 L of sterile distilled water and 9 g of
NaCl) was prepared and used for dilution. The bacterial growth curve
was built by direct count of colonies after 24 h in the Petri dishes and
AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 5, SEPTIEMBRE-OCTUBRE 2001
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Incremento y concentración del inóculo
Para incrementar la bacteria mediante YDC líquido (sin agar),
se estableció la velocidad de crecimiento y se obtuvo la curva patrón, mediante la cual se determinó la concentración del inóculo a
10 9 UFC mL-1.
Las células bacterianas de los tres aislamientos se incrementaron
en YDC selectivo para Xanthomonas, (Gilchrist-Saavedra et al., 1995).
Se utilizaron cinco cajas de Petri para hacer crecer las bacterias en
YDC sólido y 100 mL de YDC líquido. Ambos cultivos se incubaron
durante 48 h; las cajas de Petri se mantuvieron entre 27 y 30 o C y el
cultivo líquido permaneció en una incubadora (Shaker Bath orbital) a
30 o C con agitación a 275 rpm. Luego se obtuvo un concentrado de
inóculo a 109 UFC mL-1.
Se preparó una solución biológica a 1 % (1 L de agua estéril
más 9 g de NaCl), utilizada como diluyente y se calculó la curva de
velocidad de crecimiento de la bacteria, mediante el recuento directo de colonias después de 24 h en cajas de Petri con agar; además, se
midió la absorbancia mediante un espectrofotómetro (Spectronic20) a 520 nm. Una vez que la concentración fue establecida, se preparó la suspensión de inóculo con agua esterilizada en una relación
v/v del cultivo concentrado después de 48 h de incubado.
Prueba de patogenicidad
Invernadero
En invernadero se sembraron dos variedades susceptibles a Xap
(Flor de Mayo Criollo y Negro P20) en 14 macetas con cinco plantas
de cada genotipo. Se generaron 14 tratamientos (Cuadro 1) en un diseño de Bloques Completos al Azar con dos repeticiones. La unidad
experimental fue una maceta con cinco plantas por tratamiento, y como
testigo dos macetas de cada genotipo sin inocular (T7 y T 14). A los 25
días después de la siembra (etapa fenológica V3), se inocularon las
plantas a las 18:00 h (el tiempo promedio para diluir el cultivo
bacteriano hasta el término de la inoculación no fue mayor a 1.5 h),
mediante aspersión con atomizador (Pastor, 1991), bañando completamente la planta con el inóculo. El invernadero se mantuvo a una
humedad relativa mayor a 80% y temperatura entre 25 y 30 o C.
Cámara de crecimiento
En cámara de crecimiento se evaluaron dos variedades susceptibles: Flor de Mayo Criollo y Negro Jamapa. Se utilizaron cincuenta
folíolos de cada variedad colectados por la mañana y guardados en
bolsas de polietileno para evitar deshidratación en su transporte al
laboratorio donde se lavaron con agua corriente. La base del folíolo se
sumergió por un minuto en solución de hipoclorito de sodio a 3%, y
se colocó un folíolo en cada tubo de ensayo de 25 mL con agua esterilizada. En la tarde del mismo día se inocularon con un atomizador
manual: 20 folíolos con la solución 1, y otros 20 con la solución 2; se
dejaron 10 folíolos sin inocular de cada genotipo. El aislamiento de
Xap fue del tipo Negro Veracruzano. Durante las siguientes 24 h los
folíolos se mantuvieron con alta humedad relativa, mediante un
by measuring absorbance using a spectrophotometer (Spectronic 20)
at 520 nm. Once the concentration of inoculum was established,
inoculum suspensions were prepared using sterilized water at a v/v
ratio of concentrated culture after 48 h of incubation.
Pathogenicity test
Greenhouse
Two Xap-susceptible cultivars (Flor de Mayo Criollo and Negro
P20) were seeded in 14 pots (7+7), each pot containing five plants.
Fourteen treatments were generated (Table 1) and evaluated in a
Randomized Complete Block Design with two replications. The
experimental unit was a pot containing five plants per treatment. The
control treatments consisted of two pots, each one containing one of
the genotypes without inoculation (T7 and T14). Twenty-five days
after planting (phenological stage V3), plants were inoculated at 18:00
(the average time between diluting the bacterial culture and finishing
inoculation was not greater than 1.5 h) by spraying the inoculum with
an atomizer (Pastor, 1991), completely covering the plant with the
solution. The greenhouse was kept at a relative humidity greater than
80% and a temperature between 25 and 30 o C.
Growth chamber
Two susceptible cultivars were evaluated in the growth chamber:
Flor de Mayo Criollo and Negro Jamapa. Fifty leaflets were collected
from each cultivar in the morning and set aside in polyethylene bags,
to avoid dehydration during transport to the lab, where they were
washed with running water. The leaflet’s base was submerged for one
minute in a 3% sodium hypochlorite solution, and each leaflet was
Cuadro 1. Tratamientos para la prueba de patogenicidad en invernadero y origen de tres aislamientos de Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli en dos genotipos susceptibles
de frijol.
Table 1. Treatments for the pathogenicity test in the greenhouse,
and origin of three Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
isolates in two susceptible bean genotypes.
Genotipo
Flor de Mayo
Criollo
Aislamiento
Negro Veracruzano
Canario 107
Bayomex
Negro P20
Negro Veracruzano
Canario 107
Bayomex
Inóculo†
Tratamiento
1
T1
2
T2
1
T3
2
T4
1
T5
2
T6
0 (sin inóculo) T7 (Testigo)
1
T8
2
T9
1
T10
2
T11
1
T12
2
T13
0 (sin inóculo) T14 (Testigo)
† 1 y 2; medio YDC sólido y YDC líquido, respectivamente v 1 and 2;
solid and liquid YDC media, respectively.
CRUZ-IZQUIERDO et al.: PRODUCCIÓN MASIVA DE Xanthomas axonopodis
humificador eléctrico a 25 o C. Se repuso el agua esterilizada en los
tubos de ensayo y el humificador fue activado sólo por las noches,
suspendiéndolo 15 días después de inocular.
A los 30 días se evaluó la severidad (SEV), usando la escala de
James (1971) modificada por Gilberston et al. (1988), de acuerdo
con el grado de amarillamiento y necrosis de las plantas inoculadas:
0 = Ausencia de síntomas; 1 = De 1 a 12.5% de área dañada; 2 = De
13 a 25.5%; 3 = De 26 a 38.5%; 4 = De 39 a 51.5%; 5 = De 52 a
64.5%; 6 = De 65 a 77.5%; 7 = De 78 a 90.5%; 8 = De 91 a 100% de
área foliar dañada. Esta variable se transformó mediante la función
(grado de severidad)1/2 y se analizó estadísticamente con base en el
modelo del diseño descrito para comparar los efectos de los tratamientos, medio de cultivo y la interacción (nivel de probabilidad
p=0.05). Las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05)
con los valores transformados. Sin embargo, los resultados se presentan en grados de severidad, para facilitar la interpretación de la
información.
RESULTADOS
Y
DISCUSIÓN
La velocidad de crecimiento de Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli establecida como la curva patrón in vitro, permitió obtener la concentración celular
deseada de tizón común (Figura 1). Este método contrasta con el usado por Aggour et al. (1989), porque la concentración de 108 células mL-1 se obtiene mediante conteo
en placa. Después de 48 y 72 h se realizaron conteos para
obtener una aproximación de la densidad de bacterias por
volumen. El análisis de densidad o el conteo en placa se
usa para estimar poblaciones bacterianas en germoplasma de frijol sometido a presión de selección para evaluar
la resistencia a tizón común (Caroline et al., 1996); sin
0.300
Abso rban cia (52 0 nm)
0.250
0.200
y=0.0006x
109 UFC/mL
0.150
0.100
0.050
0.000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Concentración (UFC/mL)x107
Figura 1. Tasa de crecimiento in vitro de Xanthonomas axonopodis
pv. phaseoli en medio de cultivo YDC líquido.
Figure 1. In vitro growth rate of Xanthomonas axonopodis pv.
phaseoli in liquid YDC culture medium.
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placed in a test tube filled with 25 mL of distilled water. On the same
day, at the afternoon, leaflets were inoculated using a hand atomizer:
20 leaflets with solution obtained from Petri dishes and 20 with solution
from liquid media. The Xap isolate used was Negro Veracruzano.
Leaflets were kept at high relative humidity for the following 24 h,
using an electric humidifier at 25 o C. Sterile water was replenished in
the test tubes. The humidifier was active only at night, and it was used
no more than 15 days after inoculation.
Severity (SEV) was evaluated 30 days after inoculation using
James’ scale (1971), modified by Gilberston et al. (1988), according
to degree of yellowing and necrosis in inoculated plants in terms of
percentage of damaged leaf area: 0 = Lack of symptoms; 1 = 1 to
12.5%; 2 = 13 to 25.5% ; 3 = 26 to 38.5%; 4 = 39 to 51.5%; 5 = 52 to
64.5%; 6 = 65 to 77.5%; 7 = 78 to 90.5%; 8 = 91 to 100%. This
variable was transformed with the function: (degree of severity)1/2,
and it was analyzed statistically with the design model described to
compare treatment, culture media, and interaction effects (probability
level p=0.05). Means were compared employing Tukey’s test (p≤0.05)
using transformed values. Results are shown in terms of degree of
severity, to facilitate interpretation of the information obtained.
RESULTS AND DISCUSION
Growth rate of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli,
set up as a calibration curve in vitro, allowed to obtain
the desired cell concentration of common blight (Figure
1). This method contrasts with that used by Aggour et al.
(1989), because a concentration of 108 cells mL-1 is
obtained by the plaque count method. After 48 and 72 h,
counts were made to obtain an approximation of
volumetric bacterial density. Density analysis, or plaque
counts, is used to estimate bacterial populations in bean
germplasm undergoing selection pressure to evaluate
resistance to common blight (Caroline et al., 1996);
however, this analysis does not establish a pattern that
facilitates the obtention of a given cell concentration level.
With this method one only needs to esablish the
culture, wait 48 h, take a sample, and adjust absorbance
to 0.065 UA with the aid of a spectrophotometer at 520 nm.
Using this adjustment, one should obtain a solution with
10 9 CFU mL-1. Valladares-Sanchez et al. (1979) found
similar results: 0.05 AU for a solution with a cell
concentration between 108 and 10 9 CFU mL-1.
The isolate form Negro Veracruzano Xap was more
damaging (p≤0.01) in cultivars Flor de Mayo Criollo and
Negro P20; both susceptible genotypes showed a different
response to Xanthomonas isolates from Canario 107 and
Bayomex (Figure 2). The control treatment did not show
any disease symptoms. Isolate pathogenic levels were
confirmed by our results; Negro Veracruzano was the most
aggressive, with a severity level of 5.
The pathogenic test in the greenhouse showed that
the Negro Veracruzano isolate was the most aggressive
with the highest bacteria severity damage average
AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 5, SEPTIEMBRE-OCTUBRE 2001
580
embargo, no se establece un patrón que facilite obtener
con mayor eficiencia y precisión el nivel de concentración celular.
Con este patrón sólo es necesario establecer el cultivo, esperar 48 h, tomar una muestra y ajustar la
absorbancia a 0.065 en un espectrofotómetro a 520 nm.
Con este ajuste se tiene una solución con 10 9 UFC/mL.
Valladares-Sanchez et al. (1979), encontraron resultados
similares, 0.05 de lectura de absorbancia para una solución de concentración con10 8 y 10 9 UFC mL-1.
La severidad del aislamiento de Xap del Negro
Veracruzano fue mayor (p≤0.01) en las variedades Flor
de Mayo Criollo y Negro P20. Ambos genotipos susceptibles presentaron una respuesta diferencial a los aislamientos de Xap de las variedades Canario 107 y
Bayomex de Xanthomonas (Figura 2); el testigo no presentó síntomas de la enfermedad. Los resultados confirmaron el nivel de patogenicidad de los aislamientos;
el Negro Veracruzano fue el más agresivo, con nivel de
severidad 5.
En la prueba de patogenicidad en invernadero, el aislamiento Negro Veracruzano fue el más agresivo, pues
presentó el promedio más alto de severidad del daño por
la bacteria (Figura 2), en el medio de cultivo líquido y
sólido. Por tanto, fue seleccionado para la prueba de
patogenicidad en la cámara de crecimiento.
Después de 30 días de la inoculación no hubo diferencia entre los dos métodos de preparación del medio
de cultivo para incrementar el inóculo en las dos variedades con base en el nivel de severidad. En ambos casos el
nivel de severidad fue alto, con grado 5 en las variedades
7
Escala de severid ad
6
YDC sólido
YDC líquido
Flor de Mayo Criollo
(Figure 2) in both liquid and solid growth media.
Therefore, this isolate was selected for growth chamber
pathogenicity tests.
Thirty days after inoculation, based on severity levels,
no differences were visible between the two growth
methods on either cultivar. In both cases, severity level
was high, up to 5 in Flor de Mayo Criollo and Negro P20
(Figure 2), indicating that genotypes had a high
susceptibility to common blight (Gilberston et al., 1988).
Growth media type, solid or liquid, did not affect
degree of severity; however, the solid media requires many
Petri dishes to obtain the desired inoculum concentration;
bacterial growth is slow; contamination risks are higher,
and production costs increase sharply. Four Petri dishes,
after 48 h, yield approximately 1 L of inoculum with 5 x
10 CFU mL-1 (Pastor, 1991).
Inoculum increase using liquid media implies culture
establishment, incubation and waiting for 48 h to make a
dilution series, and adjusting to 0.065 UA at 520 nm using
a previously calibrated density curve for a concentration
of 1 x 10 9 CFU mL-1. A volume of 3.75 L of bacterial
culture, after 48 h of incubation, is diluted in 150 L of
sterilized water using a concentration of 109 UFC mL-1,
which is enough volume for inoculating 0.5 ha of bean.
CONCLUSIONS
The use of liquid growth media for mass production
of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli at a
concentration of 109 colony forming units per mL
concentration did not affect pathogenicity levels of
isolates included in this study. The Xanthomonas isolate
from the bean cultivar Negro Veracruzano was the most
pathogenic (severity level = 5) in the greenhouse.
Negro P20
—End of the English version—
5
4
pppvPPP
3
2
1
Bay o-mex
Canario 10 7
Negro
Veracru zano
Bay o-mex
Canario 10 7
Negro
Veracru zano
0
Aislamientos
Figura 2. Severidad de tres aislamientos de Xanthonomas
axonopodis pv. phaseoli incrementados en dos medios de
cultivo en dos genotipos susceptibles de frijol común.
Figure 2. Severity of three Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
isolates, grown in two culture media, in two susceptible
common bean genotypes.
Flor de Mayo Criollo y Negro P20 (Figura 2), lo que indica que los genotipos poseen alta susceptibilidad al tizón común (Gilberston et al., 1988).
El medio de cultivo, líquido o sólido, no afectó el grado de severidad; sin embargo, para el medio sólido, se
usan muchas cajas de Petri para obtener la cantidad de
inóculo deseado; el crecimiento bacteriano es lento, la
mano de obra es mayor, aumenta el riesgo de contaminación, y se incrementan los costos en la producción
bacteriana. Así, cuatro cajas de Petri con crecimiento de
48 h rinden, aproximadamente 1 L de inóculo con 5 x 10
UFC mL-1 (Pastor, 1991).
El incremento del inóculo en medio líquido implica establecer el cultivo, incubar y esperar 48 h para realizar diluciones en serie, y ajustar a 0.065 de absorbancia óptica a
CRUZ-IZQUIERDO et al.: PRODUCCIÓN MASIVA DE Xanthomas axonopodis
520 nm mediante la curva de densidades previamente calibrada para una concentración de 1 x 109 UFC mL-1. Un
volumen de 3.75 L de cultivo bacteriano después de 48 h, se
diluye en 150 L de agua esterilizada con una concentración
de 10 9 UFC mL-1, que es el volumen necesario para inocular 0.5 ha-1 de cultivo de frijol.
CONCLUSIONES
El uso de medio líquido en la producción masiva de
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli a la concentración de 10 9 unidades formadoras de colonias, no afectó
el nivel de patogenicidad de los aislamientos empleados.
El aislado de Xanthomonas de la variedad de frijol Negro Veracruzano fue el más patogénico (Severidad 5) en
invernadero.
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