Tema XII: vías metabólicas y de transferencia de energía

Tema XII: vías metabólicas y de transferencia de energía
Catabolismo y anabolismo. vías catabólicas, anabólicas y anfibólicas. Ciclo de la energía en las
células. Distribución intercelular de las enzimas y sistemas enzimáticos.
------------------------------------------El metabolismo, es definido brevemente, como la suma total de las reacciones enzimáticas que
tienen lugar en la célula. Cuatro son las funciones específicas del metabolismo:
1. Obtener energía química del entorno de los elementos orgánicos nutritivos o de la
luz solar
2. Convertir los elementos nutritivos exógenos en los precursores de los componentes
moleculares de las células.
3. Reunir los precursores para formar proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y otros
componentes celulares.
4. Formar y degradar aquellas biomoléculas necesarias para las funciones celulares
especializadas.
Las secuencias reaccionales del metabolismo son semejantes en todas las formas de vida
especialmente las que se conocen como rutas metabólicas centrales.
Catabolismo y anabolismo
El metabolismo se divide en catabolismo y anabolismo:
- El catabolismo es lo degradación enzimática, mediante reacciones de oxidación, de
moléculas nutritivas relativamente grandes (carbohidratos, lípidos y proteínas)
procedentes del entorno de la célula o de sus propios depósitos de reservas nutritivas,
hasta transformarlas en moléculas simples y menores, por ejemplo, ácido láctico, ácido
acético, CO 2 , amoníaco o urea. El catabolismo va acompañado de liberación de
energía libre, la cual se conserva en el ATP.
- El anabolismo es la síntesis enzimática de componentes celulares relativamente
grandes de la célula, ejemplo: polisacáridos, ácidos nucleicos, proteínas, lípidos a partir
de moléculas precursoras sencillas. Puesto que los procesos sintéticos provocan un
aumento en el tamaño y la complejidad de las estructuras, se necesita la energía
proporcionada por el enlace fosfato del ATP.
Tanto el catabolismo como el anabolismo son dos procesos simultáneos e interdependientes,
que pueden analizarse por separado. Cada uno de los procesos abarca la secuencia de
reacciones enzimáticas mediante las cuáles se degrada o se sintetiza el esqueleto covalente de
una determinada biomolécula. Los intermediarios químicos de este proceso se denominan
metabolitos, y este proceso metabólico: metabolismo intermediario. Acompañando a cada una
de las reacciones químicas del metabolismo intermediario; tiene efecto un cambio de energía
característico. En algunas de las etapas de las secuencias catabólicas puede conservarse la
energía química, habitualmente en forma de energía del enlace fosfato y en ciertas etapas de las
secuencias anabólicas puede utilizarse esa energía del enlace fosfato. Esta fase del
metabolismo se denomina acoplamiento energético. El metabolismo intermediario y el
acoplamiento de energía están obligatoriamente interconectados y son interdependientes. Por
ello, cuando examinamos los esquemas metabólicos deberemos analizar:.
1. Las etapas de reacción por las que la estructura covalente del precursor se altera
para formar el producto.
2. Los cambios de energía química que acompañan a esta conversión.
Transformaciones catabólicas, anabólicas y anfibólicas
El catabolismo es la degradación enzimática de cada uno de los principales elementos nutritivos
(hidratos de carbono, lípidos y proteínas) tiene lugar a través de cierto número de reacciones
enzimáticas consecutivas que se desarrollan en tres fases:
- Fase I: en esta fase las grandes moléculas de los elementos nutritivos se degradan hasta
los principales componentes. Los polisacáridos son degradados a pentosas o hexosas,
los lípidos a ácidos grasos, glicerina y otros componentes, y las proteínas a sus veinte
aminoácidos constitutivos.
- Fase II: los numerosos productos distintos de la Fase I son recogidos y convertidos en un
número pequeño de moléculas más sencillas. Así, las hexosas, las pentosas y la glicerina
se degradan en el azúcar fosforilado de tres átomos de carbono, el gliceraldehído-3fosfato y después hasta un compuesto sencillo de dos átomos de carbono, la acetilcoenzima A. Los aminoácidos diferentes son también degradados a: acetil-coenzima A,
alfa-cetoglutarato succinato, fumatato y oxalacetato.
- Fase III: Los productos formados en la fase II pasan a la fase III que es el camino común
final en el cual se oxidan a CO 2 + H 2 O .
El anabolismo tiene lugar también en tres fases, comenzando por las pequeñas moléculas
originadas en la tercera fase del catabolismo. Por ejemplo, la síntesis proteica comienza en La
Fase III, a partir de los alfa-cetoácidos que son los precursores de los aminoácidos. En la Fase II
los alfa-cetoácidos son aminados por donadores de grupos aminos y se forman los alfaaminoácidos y en la Fase I se reúnen los aminoácidos para producir cadenas peptídicas.
Aunque los caminos del catabolismo y el anabolismo no son idénticos la Fase III constituye un
camino central accesible a ambos. Esta senda central, que recibe el nombre de anfibólica,
desempeña una doble función (amphi: ambos). La ruta anfibólica puede utilizarse
catabólicamente para lograr la degradación completa de pequeñas moléculas producidas en la
Fase II del catabolismo o puede utilizarse anabólicamente como precursora de moléculas para la
Fase II del anabolismo.
Lípidos
Polisacáridos
Ácidos grasos
glicerina
Hexosas
Pentosas
Proteínas
Fase I
Aminoácidos
Gliceraldehído
3-fosfato
Fase II
Fosfoenol
piruvato
Piruvato
Acetil - C o A
citrato
oxalacetato
Fase III
isocitrato
malato
Alfa - cetoglutarato
Fumarato
Ciclo de los
ácidos tricarboxilos
succinato
CO2
LA ENERGÍA EN LA CÉLULA
Las moléculas orgánicas complejas, tales como la glucosa contienen mucha energía potencial
a causa de su elevado grado de ordenación estructural; poseen una entropía relativamente
pequeña. Cuando la molécula de glucosa se oxida y forma seis moléculas de CO 2 y
seis de H 2 O , sus átomos experimentan un aumento en el desorden. Como resultado de esta.
transformación, la molécula de glucosa experimenta una pérdida de energía libre que es energía
útil y capaz de realizar trabajo. La energía libre se conserva, como energía química,
específicamente como ATP. Dado que el ATP formado puede difundirse hacia aquellos lugares
en la célula en que se necesite su energía, constituye una forma de transportar la energía. La
energía química del ATP se libera después, durante la transferencia de su grupo o grupos
fosfatos terminales, a determinadas moléculas de un aceptor especifico, que adquiere un nivel
superior de energía y puede realizar trabajo. Un segundo camino para transportar la energía
química de las reacciones de óxido-reducción del catabolismo a las reacciones anabólicas, que
necesita de energía, es en forma de electrones. En la síntesis de algunas biomoléculas ricas en
hidrógeno, tales como los ácidos grasos y el colesterol, se requieren electrones e hidrógeno para
la reducción de los enlaces dobles a simples. En La célula los electrones son transportados
enzimáticamente desde las oxidaciones productoras de electrones tales como los dobles
enlaces carbono-carbono o carbono-oxígeno, mediante coenzimas transportadoras de
electrones, la más importante es la nicotinamida-adenin-dinucleótido fosfato (NADP). El NADP
desempeña de este modo, el panel de transportador de electrones ricos en energía desde las
reacciones catabólicas hasta las reacciones anabólicas que los necesitan.
Distribución intracelular de las enzimas y de los sistemas enzimáticos
Las diferentes enzimas y sistemas enzimáticos se hallan localizados característicamente, en una
u otra organela o estructura intracelular de las células. El sistema enzimático glicolítico está
localizado en el citoplasma mientras que las enzimas implicadas en la oxidación del piruvato, de
los ácidos grasos de cadena larga hasta el estado de ácido acético y el proceso inverso de
reducción del ácido acético para formar ácidos grasos de cadena larga. Estos procesos
químicamente incompatibles se producen en diferentes partes de la célula; la oxidación en las
mitocondrias y la reducción en el citoplasma extramitocondrial.
Regulación celular de las sendas metabólicas
La velocidad del catabolismo de una célula no es controlada por la concentración de los
elementos nutritivos del entorno, sino más bien por sus necesidades energéticas en forma de
ATP. La regulación de una ruta metabólica puede llevarse a cabo a varios niveles. El tipo de
regulación más sencilla implica los parámetros que afectan a las velocidades de las reacciones
enzimáticas (pH, concentración de enzima, concentración de cada intermediario, concentración
de iones metálicos y coenzimas esenciales, etc.). El segundo mecanismo genera de regulación
consiste en la acción de enzimas reguladoras que se hallan localizadas, habitualmente, en el
comienzo o en proximidades de una secuencia multienzimática. El tercer nivel en que se ejerce
la regulación metabólica es a través del control genético de la velocidad de la síntesis
enzimática. En organismos multicelulares superiores el control se ejerce a través de sistemas
endocrinos. Las hormonas elaboradas por una glándula endocrina son mensajeros químicos que
estimulan o inhiben actividades metabólicas específicas en otros tejidos u órganos.
TEMA XIII: PRINCIPIOS DE BIOENERGETICA Y CICLO DEL ATP
Localización y propiedades del ATP y del ADP. Variación de energía libre. estándar de las
reacciones químicas. Energía libre estándar de la hidrólisis del ATP. Compuesto con enlace
fosfato de bajo y alto nivel energético. Vías enzimáticas de la transferencia de fosfato. Principio
del intermediario común. Otros ribonucleótidos que participan en la transferencia de energía en
la célula 5' difosfato y 5' trifosfato. Papel del AMP y del pirofosfato.
------------------------------------------------El sistema ATP - ADP actúa como transportador de energía química, ya que el ADP es capaz de
aceptar un grupo fosfato en las reacciones acopladas productoras de energía del catabolismo, y
el ATP así formado puede ceder su grupo fosfato terminal, en otras reacciones acopladas que
requieren energía.
En este capítulo examinaremos los principios químicos y termodinámicos en que se basa el
funcionamiento del sistema ATP - ADP.
LOCALIZACION Y PROPIEDADES DEL ATP Y EL ADP
El ATP fue aislado por primera vez, en 1929 por Fiske y Subbarow, de los extractos ácidos de
músculo. Su estructura se dedujo algunos años después, mediante experimentos degradación y
fue definitivamente confirmada por síntesis química total realizada por Todd y sus colegas en
1948. Desde los inicios del descubrimiento, se sospechó que el ATP desempeñaba un papel en
la transferencia de energía celular pero recién en 1939-1941 Lipmann propuso que actuaba
como medio principal de transferencia de la energía química en la célula. El ATP, el ADP y el
AMP no son sustancias que existen solo en trazas; la suma de sus concentraciones en la fase
acuosa de los diversos tipos de células intactas oscila entre 2 y 15 mM. La concentración de
ATP es por lo común muy superior a la suma de las otras dos concentraciones del AMP,
habitualmente es la menor de las tres. Estos nucleótidos están presentes no sólo en el
citoplasma sino también en organelas tales como mitocondrias y núcleo. La compartimentación
intracelular del sistema ATP constituye una característica importante en la regulación celular del
metabolismo. A pH 7,0 tanto ATP como ADP son aniones muy cargados, el ATP posee cuatro
protones ionizables en su grupo de ácido trifosfórico. Tres de los protones poseen valores de pK
(K = constante de disociación) bajo entre 2 y3; por lo tanto a pH 7,0 están completamente
disociados; el cuarto protón tiene un pK' de 6,5; por consiguiente a pH 7,0 se halla disociado en
un 75%.
NH2
N
N
O
HO
P
OH
O
O
P
OH
ATP
O
P
N
N
O
OH2
C
O
OH
H
H
H
H : hidrógenos que cede en su disociación
OH
OH
El ADP posee tres protones ionizables, dos de ellos están completamente disociados a pH 7,0 y
el tercero que posee un pK' de 7,2 a pH 7,0 se halla disociado alrededor del 39%. La elevada
concentración de cargas negativas en torno al grupo trifosfato del ATP constituye un factor
importante en su naturaleza de compuesto de alto contenido energético. En la célula intacta
existen muy pocas cantidades de ATP y de ADP en forma de aniones libres, se hallan presentes
en su mayor parte en forma de complejos Mg ATP y Mg ADP a causa de la gran afinidad de los
grupos pirofosfato para enlazar cationes divalentes y de la elevada concentración de ión Mg + +
en el fluido intracelular. La afinidad del ATP por el Mg + + es unas diez veces mayor que la del
ADP.
mg
O
Adenina
Ribosa O
-
P
O
O
O
P
O
O
O
P
O
-
mg-ATP
O
mg
O
Adenina
Ribosa O
P
O
O
O
P
O
-
mg-ADP
O
En muchas de las reacciones enzimáticas en que participa el ATP como dador de fosfato, su
forma activa es la del complejo mg-ATP. El ADP y el ATP pueden separarse y medirse con
facilidad mediante electroforesis o por cromatografía en capa fina.
PRINCIPIOS DE TERMODINAMICA QUIMICA
Una descripción de las bases físico-químicas de la función del ATP en el ciclo energético de la
célula, requiere un breve repaso de algunos principios de la termodinámica. El análisis
termodinámico de los intercambios energéticos se realiza por las siguientes definiciones:
a. Sistema: es el conjunto de materia que es objeto de nuestro estudio
b. Entorno: toda materia del universo, aparte del sistema que se considera. En el
transcurso del proceso en estudio la energía puede pasar del sistema al entorno, o
viceversa.
c. Estado inicial: es el contenido de energía del sistema y del entorno, al iniciar el
proceso que se analiza.
d. Estado final: contenido de energía de sistema y entorno una vez que se ha
alcanzado el equilibrio.
El contenido de energía de cada estado es una función de diversas magnitudes medibles
(temperatura, presión, volumen, masa, etc.) que se formulan mediante una ecuación de estado.
A partir de las medidas de los cambios de contenido de energía del sistema y el entorno, a
medida que el sistema evoluciona desde su estado inicial hasta su estado final, puede realizarse
un balance de energía.
(Bloques de cobre)
caliente
frio
Estado inicial
Estado de equilibrio
La primera ley de termodinámica es el principio de conservación de la energía. La energía no se
crea ni se destruye, sino que se transforma en una u otra forma (ej. calorífica, química,
mecánica, etc.).
La segunda ley establece algunas limitaciones en los tipos de transformaciones energéticas que
ocurren en los procesos físicos-químicos, y predice la dirección en que es probable que ocurra
un proceso determinado. Establece que todos los procesos tienden a evolucionar en una
dirección tal que la entropía del sistema más la del entorno, aumenta hasta alcanzar un estado
de equilibrio.
- entropía: se define como el grado de desorden.
- equilibrio: se define como aquel estado en que no ocurre ningún cambio físico o químico
ulterior, y en el que la temperatura, la presión y la concentración son uniformes en todo el
sistema.
UN SISTEMA DE EQUILIBRIO
1. Ha agotado su capacidad de realizar trabajo sobre su entorno,
2. El proceso no puede invertirse de modo espontáneo y volver a su estado inicial, lo cual
requerirá una disminución de entropía. Un sistema desordenado al azar no se reordena por
si mismo espontáneamente.
Los procesos que se realizan con aumento de entropía se denominan irreversibles. Los procesos
que tienen lugar sin cambio de entropía son reversibles.
Ejemplo: si tenemos bloques de piedra dispuestos al azar y queremos disponerlos de tal modo
que formen un arco la entropía o sea el grado de organización disminuye y es reversible porque
espontáneamente sin cambio de entropía puede pasar del orden al desorden (arco a bloques al
azar).
entropía (∆S) elevada (desorden)
(∆S) disminuye
reversible
endotérmico
irreversible
espontáneo
exotérmico
∆S disminuye (orden)
∆S aumenta
En reacciones químicas los cambios de entropía ( ∆S ) no siempre pueden medirse o calcularse
con facilidad. Sin embargo, el cambio de entropía durante un proceso está relacionado
cuantitativamente con los cambios de la energía total del sistema por una tercera función,
llamada energía libre, mediante una ecuación que combina la primera y la segunda ley de
termodinámica. Puesto que los cambios de la energía libro de las reacciones químicas pueden
medirse con relativa facilidad, esta ecuación resulta muy útil para predecir la dirección y el
equilibrio de la reacciones químicas. El cambio de energía libre ( ∆G ) cuando la temperatura y
presión son constantes se define del siguiente modo:
∆G = ∆H - T.∆S
(1)
En la que ∆H es la variación de entalpía, T la temperatura absoluta y ∆S variación de entropía.
La variación de entalpía ( ∆H ) que también se denomina cambio calorífico, se define mediante la
ecuación:
∆H = ∆E + ∆PV
(2)
∆E = variación de le energía total del sistema.
P = presión
V = volumen
En los sistemas biológicos las reacciones químicas tienen lugar en disoluciones acuosas
diluidas, en las que la temperatura, presión y volumen permanecen constantes. En estas
condiciones, ∆PV es cero, por lo tanto:
∆H = ∆E
Si sustituimos en la ecuación (1)
∆G = ∆E - T.∆S
reordenamos la ecuación:
∆E = ∆G + T.∆S
Con esta ecuación vemos que a temperatura y presión constantes la variación de energía total
del sistema ( ∆E ) (que es equivalente al cambio calórico ∆H ) es la suma de T.∆. más la
variación de la energía libre.
La variación de energía libre puede definirse corro aquella fracción del cambio de energía total
del sistema disponible para realizar trabajo a medida que el sistema evoluciona hacia su estado
de equilibrio, a T y P constantes. Mientras el sistema se aproxima al equilibrio, la energía libre
disminuye hasta un valor mínimo.
VARIACION DE LA ENERGIA LIBRE ESTANDAR EN LAS REACCIONES QUIIMICAS
El cambio de energía libre que tiene lugar durante las reacciones químicas se calcula empleando
una ecuación que puede derivarse de la ley de equilibrio químico. Para una reacción general del
tipo:
aA + bB
cC + dD
(3)
en la que a, b, c y d son el número de moléculas de A, B, C, y D que participan en la reacción. El
cambio de energía libre ( ∆G ) está dado por la ecuación:
 [C]c .[D]d
∆G = ∆Gº + RT ln
a
b
 [A ] .[B]



(4)
en la que los términos A, B, C y D son las concentraciones molares de A, B, C, y D y a, b, c y d
son ahora los exponentes de sus concentraciones. R es la constante de los gases (1,987 cal
mol-1 grado-1); T la temperatura absoluta y ∆Gº la variación de energía libre estándar. Cuando la
reacción (3) se halla en equilibrio, independientemente de las concentraciones iniciales de A, B,
C y D prevalece la condición que la energía libre es mínima y no es posible ningún cambio
ulterior; por tanto ∆G = 0 . Entonces:
 [C]c .[D]d 

0 = ∆Gº + RT ln
a
b 
 [A ] .[B] 
(5)
De donde:
 [C]c .[D]d 
∆Gº = − RT ln a b 
 [A ] .[B] 
(6)
Puesto que la constante de equilibrio K'eq para la ecuación (3) es:
 [C]c .[D]d 
K' eq =  a b 
 [A ] .[B] 
(7 )
Podemos sustituir K'eq en la ecuación (6) y obtener la ecuación general:
∆Gº = − RT ln (K' eq)
O bien:
∆Gº = −2.303 RT log10 (K' eq)
(8)
Esta ecuación nos muestra que ∆Gº , la variación de energía libre estándar de una reacción
química, puede calcularse a partir de su constante de equilibrio. La ∆Gº constituye, por lo tanto,
una constante termodinámica para una reacción química dada. Puede definirse de otro modo,
que indica claramente su verdadero significado. La variación de energía libre estándar de una
reacción constituye, en realidad, la diferencia existente entre la energía libre estándar de los
reactivos y la energía libre estándar de los productos, hallándose cada término ajustado a la
estequiometría de la ecuación de reacción:
∆Gº =
∑ Gº productos − ∑ Gº reaccionantes
Para la reacción (3) será:
∆Gº = (c G º C + d G º D ) − (a G º A + b G º B )
La energía libre estándar de un compuesto constituye la medida de la cantidad total de energía
libre que puede proporcionar por descomposición completa. Es importante comprender la
diferencia que hay entre ∆Gº , que es la variación de energía libre estándar, y ∆G que es la
variación de energía libre medida o real. Esta diferencia puede explicarse mejor utilizando una
analogía. ∆Gº es un valor constante para una determinada reacción a una temperatura también
determinada. Por otra arte, ∆G varía con las concentraciones de los reaccionantes y de los
productos. El valor de ∆Gº únicamente es igual al de ∆G cuando todos los reactivos y todos los
productos están presentes a concentración 1,0M. El valor de ∆G es el que determina si una
reacción química ocurrirá en la dirección escrita, partiendo de unas concentraciones de
reaccionantes determinadas.
Reacuérdese que una reacción química solamente ocurrirá si ∆G es negativo, es decir, si la
energía libre del sistema disminuye. Las reacciones químicas con un ∆Gº negativo reciben el
nombre de exergónicas; se realizan espontáneamente en la dirección en que están escritas. Si
recordamos el ejemplo de los bloques:
ordenado
∆Gº disminuye, es negativo
exergónica o exotérmica
espontánea
irreversible
desordenado
Las reacciones con un cambio de energía libre estándar positivo reciben el nombre de
endergónicas o endotérmicas, no se realizan de modo espontáneo en la dirección en que se
escriben. Volviendo al ejemplo:
desordenado
∆Gº aumenta, es postivo
endergónica o endotérmica
no es espontánea
reversible
ordenado
Ahora podemos exponer un ejemplo de la ∆Gº a partir de la siguiente reacción:
glucosa_1_fosfato
glucosa_6_fosfato
∆Gº = −R T ln(K' eq)
∆Gº = −1.987 x 298 x 2.303 log19 = −1745 cal = − 1.745 Kcal
Puesto que ∆Gº es negativo, la conversión de glucosa_1_fosfato en glucosa_6_fosfato es
exergónico. El análisis químico muestra que parte de una concentración 0,020 M de
glucosa_1_fosfato con un exceso de enzima y permitimos que la reacción ocurra en sentido
directo, o si partimos de la concentración 0,020 M de glucosa_6_fosfato y la reacción transcurre
en sentido inverso, las concentraciones de la mezcla final en equilibrio son, en ambos casos,
0.001 M de glucosa_1_fosfato y 0,019 de glucosa _6_ fosfato a 25º C y pH 7,0. Hay dos tipos de
reacciones que tienen lugar con disminuciones especialmente grandes de ∆Gº , son la hidrólisis
de los anhídridos y las reacciones de oxidación.
∆Gº de la hidrólisis del ATP
El camino mas sencillo para determinar ∆Gº para la reacción:
ATP
+
H2O
ADP
+
fosfato
(10)
es determinar la constante de equilibrio y calcular ∆Gº empleando la relación dada por la
ecuación (8):
∆Gº = -2.303 R T log10 (K' eq)
La medida directa de la constante de equilibrio de la hidrólisis del ATP no es práctico. Una de las
razones, y la más importante, es que los métodos analíticos que se disponen no son lo
suficientemente precisos o sensibles para determinar con exactitud las concentraciones de
equilibrio de ATP, ADP y el ión fosfato, porque en el estado de equilibrio el ATP se encuentra
casi completamente hidrolizado en ADP y en ión fosfato. En realidad, esto constituye un
problema serio para muchas reacciones que poseen grandes valores negativos de ∆Gº .
Para poder medir el ∆Gº de la hidrólisis del ATP, se descompone en cierto número de etapas
menores, las cuáles pueden medirse más fácilmente. Veremos un ejemplo: en primer lugar, se
deja reaccionar al ATP con la glucosa, en presencia de hexoquinasa para formar ADP y
glucosa_6_fosfato. Se mide la constante de equilibrio, y a partir de ella se calcula ∆Gº .
hexoquinasa
ATP
+
glucosa
ADP
+
glucosa_6_fosfato
K'eq = 661
∆Gº = - 4.00 kcal
(11)
Se continúa después con la medida de la K'eq y la ∆Gº de la reacción de hidrólisis de la
glucosa_6_ fosfato catalizada por una fosfatasa.
fosfatasa
glucosa_6_fosfato
+
H2O
glucosa
+
fosfato Pi
K'eq = 171
∆Gº = - 3.30 kcal
(12)
La suma de las reacciones (11) y (12) es la ecuación de hidrólisis del ATP.
hexoquinasa
ATP
+
glucosa
ADP
+
glucosa_6_fosfato
+
H2O
glucosa
+
fosfato Pi
+
H2O
ADP
+
fosfato
fosfatasa
glucosa_6_fosfato
ATP
Puesto que los valores de ∆Gº de las dos reacciones son aditivas, la ∆Gº de la hidrólisis del
ATP puede calcularse a partir de ellos:
∆Gº = ∆Gº + ∆Gº = - 4.00 + (-3.30) = - 7.30 kcal
ATP
1
2
Es importante hacer notar que este valor está basado en que pH = 7,0; T = 37º C, en presencia
de exceso de ion Mg + + y concentraciones 1,0 M de los reaccionantes y de los productos. El
grupo fosfato terminal del ADP también posee una ∆Gº de hidrólisis relativamente grande. Es
igual a -7,30 kcal.
ADP
+
H2O
AMP
+
∆Gº = -7.3 kcal
Pi
Sin embargo el único grupo fosfato del AMP tiene un valor mucho menor:
AMP
+
H2O
adenosina
+
Pi
∆Gº = -3.40 kcal
Lo que sucede es que los enlaces entre grupos fosfatos adyacentes son enlaces del tipo de
anhídrido, mientras que el enlace entre el fosfato y la ribosa en el AMP es un enlace éster.
COMPUESTOS CON ENLACES FOSFATO DE ALTO Y DE BAJO NIVEL ENERGÉTICO
En la escala termodinámica de ∆Gº , el ATP es el único que posee un valor de ∆Gº , intermedio.
Daremos el ∆Gº de algunos compuestos fosforilados.
∆Gº (kcal)
Fosfoenol piruvato ………………………. - 14.80
1-3 difosfoglicerato ……………………... - 11.80
Fosfocreatina …………………………….. - 10.30
∆Gº = > ATP
Fosfoarginina …………………………….. - 7.70
ATP
………………………………. - 7.30
Glucosa_1_ fosfato ……………………... - 5.00
Fructosa_6_fosfato ……………………... - 3.80
Glucosa_6_fosfato ……………………... - 3.30
∆Gº = < ATP
Gliceril_1_fosfato ………………………… - 2.20
O sea que la función del sistema ATP-ADP, consiste en servir como transportador obligatorio
intermedio de grupos fosfato desde los compuestos con enlaces fosfato de elevado nivel
energético, situados por encima del ATP en la escala termodinámica, hasta las moléculas
aceptoras que forman compuestos con enlaces fosfato de bajo nivel energético situados en la
escala por debajo del ATP.
COMPUESTOS FOSFATO DE ALTO NIVEL ENERGETICO
Hay dos clases de compuestos fosforilados que poseen una ∆Gº de hidrólisis más negativa que
la del ATP:
1. Los compuestos fosfato que se forman durante la ruptura enzimática de moléculas
combustibles.
2. Los compuestos fosfato utilizados como almacenadores de la energía del enlace fosfato.
Los dos miembros más importantes de la primera clase son el 1-3 difosfoglicerato y el fosfoenol
piruvato, los cuales se forman durante la fermentación anaerobia de la glucosa (glucólisis).
1-3 difosfoglicerato
+
ADP
3 fosfoglicerato
ATP
+
H2O
ADP
+
+
∆Gº = -4.5 kcal
ATP
∆Gº = -7.3 kcal
Pi
Total = -11.80 kcal
Los compuestos fosfato de elevado nivel energético, que actúan como reservorio de la energía
de enlaces fosfato, reciben con frecuencia el nombre de fosfágenos. Los dos fosfágenos
principales son la fosfocreatina hallada en muchos vertebrados, y la fosfoarginina, presente en
muchos invertebrados. Ambos se forman a partir de la. creatina y de la arginina por transferencia
de grupos fosfato desde el ATP en reacciones catalizadas por la creatin-fosfoquinasa y la
arginin-fosfoquinasa, respectivamente. Ambas reacciones son reversibles pero el equilibrio se
halla desplazado hacia la formación de ATP.
fosfocreatina
+
ADP
creatina
+
ATP
ATP COMPUESTOS FOSFATO DE BAJO NIVEL ENERGETICO
La mayoría de los compuestos fosfato pobres en energía son ésteres fosfóricos de alcoholes. Se
conocen muchas enzimas que catalizan la transferencia de grupos fosfato desde el ATP a
aceptores de fosfato específicos, para formar compuestos fosfato pobres en energía; entre las
enzimas mencionadas se hallan la glicero quinasa y la hexoquinasa, que catalizan la
transferencia de fosfato desde el ATP a la glicerina y desde el ATP a la D-glucosa,
respectivamente.
ATP
+
glicerina
ADP
+
glicerol_3_fosfato
∆Gº = -4.5 kcal
ATP
+
D-glucosa
ADP
+
D.glucosa_6_fosfato
∆Gº = -7.3 kcal
RUTAS ENZIMATICAS DE LA TRANSFERENCIA DE FOSFATO
Fosfoenol piruvato
Dadores de P de alta energía
P
Reservorio de fosfocreatina
1-3 difosfoglicerato
P
P
ATP
Aceptores de P
de baja energía
P
P
Glucosa_6_fosfato
Glicerol_3_fosfato
La figura es un esquema de las reacciones enzimáticas de transferencia de fosfato en la célula.
Constituye un rasgo importante que el sistema ATP-ADP sea el nexo de unión obligado entre los
compuestos fosfato de elevado y de bajo nivel energético. Los grupos fosfato se transfieren, en
primer lugar, mediante la acción de fosfotransferasas específicas, desde compuestos de alto
nivel energético al ADP, como en el ejemplo:
fosfoenol piruvato
+
ADP
piruvato -
piruvato
+
ATP
quinasa
El ATP así formado se transforma entonces en el dador de fosfato específico de una segunda
reacción enzimática, para formar compuestos fosfato de baja energía.
hexoquinasa
ATP
+
D-glucosa
ADP
+
D-glucosa_6_fosfato
la reacción global es la siguiente:
fosfoenol piruvato
+
D-glucosa
piruvato
+
D-glucosa_6_fosfato
El resultado final es la transferencia de un grupo fosfato desde un donador de energía elevado a
un aceptor de bajo nivel energético, a través del sistema ATP-ADP, que actúa como
intermediario. El contenido de energía de la D-glucosa se ha elevado al fosforilarse, la
glucosa_6_fosfato puede considerarse una forma de glucosa que ha recibido energía en el flujo
principal de reacciones transferidoras de energía de la célula, la transferencia del fosfato nunca
se produce directamente desde un compuesto de elevado nivel energético como el 1-3
difosfoglicerato a un aceptor de fosfato de bajo nivel energético, como por ejemplo, la glicerina,
no se han encontrado enzimas capaces de catalizar tales transferencias directas de fosfato.
Esencialmente, todas las reacciones de transferencia de fosfato en la célula tienen que
efectuarse a través del sistema ATP-ADP. La figura también muestra el papel de reservorio
desempeñado por la fosfocreatina, que se forma por transferencia enzimática directa de un
grupo fosfato desde el ATP a la creatina; no existe ningún otro camino para su formación.
Además, la única ruta principal conocida para su desfoforilación es la inversa de la reacción por
la que se forma. El sistema reservorio de la fosfocreatina es muy importante en el músculo
esqueletal. También se encuentra en el músculo liso y en las células nerviosas, y en pequeñas
cantidades en el hígado, riñón y otros tejidos de mamíferos.
PRINCIPIO DEL INTERMEDIARIO COMÚN
En dos reacciones consecutivas en que un producto de la primera es un sustrato de la segunda,
como ocurre en las siguientes reacciones:
A
+
B
C
+
D
D
+
E
F
+
G
ambas reacciones están ligadas por un intermediario común, en este caso el componente D. El
único camino mediante el cual la energía química puede ser transferida desde una reacción a
otra en condiciones isotérmicas es el de que ambas reacciones posean un intermediario de
reacción común. Casi todas la reacciones metabólicas de la célula se realizan mediante
secuencias de esta clase. En las reacciones consecutivas, responsables de la transferencia de
energía a través del ATP, la energía química se transfiere desde un dador fosfato de elevada
energía hasta el ADP, y se conserva en forma de ATP como producto de reacción. En la
reacción subsiguiente, el ATP se comporta como un sustrato, y cuando pierde su grupo fosfato
terminal, que cede a la molécula del aceptor, ésta última aumenta su contenido energético. Por
lo tanto, el ATP es el intermediario común. En realidad, la transferencia de intermediarios
comunes constituye un atributo general de las reacciones químicas y no necesita por fuerza, ni
grupos fosfatos, ni ATP. En efecto, veremos que muchos grupos funcionales distintos del fosfato,
por ejemplo, átomos de hidrógeno, grupos acetilo, se transfieren enzimáticamente mediante
reacciones consecutivas que poseen intermediarios comunes, tales reacciones pueden
analizarse termodinámicamente por los mismos métodos que se han desarrollado para el caso
especial de las transferencias del grupo fosfato.
CANALIZACION DE GRUPOS FOSFATO POR LA VIA DE OTROS NUCLEOSIDOS 5'
TRIFOSFATO
Aunque el sistema ATP-ADP constituye el transportador obligado de fosfato en el flujo principal
de transferencia de energía en la célula, también participan en dichas transferencias los 5' di y
trifosfatos de otros ribonucleósidos y los 2 desoxirribonucleótidos. Los 5' di y trifosfatos de
diversos ribonucleósidos no solamente actúan como precursores en la síntesis de ARN, sino
también canalizan los grupos fosfato de alto contenido en energía hacia reacciones biosintéticas
específicas.
P
ATP
P
UTP
ATP
P
GTP
ATP
P
Polisacáridos
Proteínas
CTP
ATP
P
CTP
P
GTP
P
UTP
Lípidos
ARN
ATP
P
d ATP
P
d GTP
P
d TTP
P
d CTP
ADN
Todas estas canalizaciones conectan con el ATP mediante la enzima nucleósidos difosfoquinasa
presente en las mitocondrias y en el citoplasma de la célula, cataliza las reacciones del tipo
mostrado en el esquema. Cada tipo de nucleósido trifosfato posee una función especializada.
Por ejemplo: el UTP es el dador de fosfato inmediato, y por lo tanto el donador de energía de
reacciones que conducen a la síntesis de polisacáridos.
PAPEL DEL AMP Y DEL PIROFOSFATO
Aunque el ADP constituye el producto de muchas reacciones celulares que emplean el ATP, y el
ADP es el aceptor directo del fosfato en las reacciones productoras de energía de la glicólisis y
de la fosforilación oxidativa de la mitocondria; en muchas de las reacciones que utilizan el ATP
en la célula los dos grupos fosfato terminales de éste se separan conjuntamente en forma de
pirofosfato y se libera AMP como producto.
AMP
ATP
+
PPi
El pirofosfato inorgánico es un compuesto fosfato de nivel energético elevado que posee un ∆Gº
de hidrólisis comparable al fosfato terminal del ATP. ara regenerar el ATP a partir de PPi y AMP
intervienen dos enzimas auxiliares: la pirofosfatasa inorgánica y la adenilato-quinasa. La primera
cataliza la hidrólisis del pirofosfato inorgánico (PPi).
PPi
+
H2O
2 Pi
Esta hidrólisis secundaria del pirofosfato constituye una etapa valiosa de liberación de energía, la
cual se utiliza para asegurar que ciertas reacciones biosintéticas se realicen por completo. El Pi
formado se utiliza para la regeneración del ATP a partir de ADP. La adenilato-quinasa cataliza la
refosforilación del AMP a ADP.
ATP
+
AMP
ADP
+
ADP
El ATP, el ADP y el AMP de la célula existen en concentraciones constantes.
TEMA XIV: GLUCOLISIS
Vamos a considerar los mecanismos por los que las moléculas combustibles se degradan y su
energía se conserva en forma de energía de enlace fosfato ATP. Se estudiarán los procesos
conocidos como fermentación; mediante el cual muchos organismos extraen energía química de
la glucosa y otros combustibles en ausencia de oxigeno molecular. Nos referimos primeramente
el proceso de fermentación para luego poder hablar de respiración y fotosíntesis.
FERMENTACION Y RESPIRACION
Los organismos inferiores que viven en condiciones anaerobias (ciertas bacterias, invertebrados
inferiores) obtienen su energía de la fermentación de la glucosa. Los organismos que viven en
condiciones aerobias (hongos, bacterias, mayoría de los animales y plantas superiores)
degradan sus combustibles por la ruta anaerobia pero después oxidan los productos de la
fermentación utilizando el oxigeno molecular. En esta fermentación el oxidante final o aceptor
final es una molécula orgánica producida en el proceso fermentativo. En los organismos
superiores la ruta anaerobia es una primera etapa de la fase aerobia de la respiración.
Utilización de la glucosa por los organismos inferiores superiores: la ruta de la
fermentación es común tanto en la utilización anaerobia de la glucosa como en la aerobia.
Anaerobios
Aerobios
glucosa
sin O2
glucosa
fermentación
productos de la fermentación
sin O2
fermentación
productos de la fermentación
sin O2
fermentación
CO2 + H2O
Entre las clases de fermentación nombraremos la fermentación homoláctica y la alcohólica.
1. La fermentación homoláctica: la molécula de glucosa de 6 átomos de carbono se
degrada a dos moléculas de ácido láctico de tres átomos de carbono. Este proceso se
denomina glucólisis que significa lisis de la glucosa.
2. La fermentación alcohólica: la molécula de glucosa de 6 átomos de carbono se
degrada a dos moléculas de etanol de 2 átomos de carbono y 2 de CO 2 .
1. Glucosa
C
C
C
C
2. Glucosa
C
C
C
C
C
triosas
C
C
C
C
C
C
C
triosas
C
C
ácido
láctico
ácido
láctico
CH3
CH3
CH OH
CH OH
COOH
COOH
C
C
C
C
C
C
etanol
etanol
CH3
CH3
CH2 OH
CH2 OH
+
+
CO2
CO2
En estas reacciones tenemos que hablar de las reacciones de óxido reducción que se producen
en todo organismo donde el agente oxidante recibe los electrones y el agente reductor entrega
electrones. En este caso de la fermentación alcohólica el etanol es una molécula relativamente
reducida rica en H 2 , pobre en O 2 . La molécula de CO 2 es relativamente oxidada, pobre en H 2 .
En el caso de la fermentación homoláctica el grupo metilo se halla más reducido que el grupo
carbonilo. Veamos la reacción completa:
Ácido láctico
1. Glucosa
O
C
H
CH3
HC OH
HO C
H
+
2 Pi
+ 2 ADP
CH OH
2
HC OH
+ 2 ATP + 2 H2O
COOH
HC OH
CH2 OH
2. Glucosa + 2 Pi + 2 ADP
2 CH3
+
2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O
CH2 OH
ANALIZAREMOS LA REACCION ENERGETICA DE LA GLUCOLISIS
La conversión de glucosa en lactato es exergónica y la formación de ATP a partir de ADP y de Pi
es endergónica.
glucosa
2 lactato
∆Gº = - 47.0 kcal
2 Pi + 2 ADP
2 ATP + 2 H2O
∆Gº = + 16.6 kcal
sumando
GLUCOSA + 2 Pi + 2 ADP
2 lactato + 2 ATP + 2 H2O
∆Gº = - 32.4 kcal
Se deduce de estos datos que la transformación de glucosa en lactato proporciona energía para
producir la fosforilación de 2 moléculas de ADP a ATP. Esta reacción es irreversible. Lo
demuestra el ∆Gº negativo.
ETAPA DE LA GLUCOLISIS:
La glucólisis es catalizada por la acción de un grupo de 11 enzimas. Se cree que están
localizadas en la porción soluble del citoplasma. Se pueden considerar dos etapas o fases. En la
primera fase la glucosa se fosforila y se esciende pare formar gliceraldehído 3 P; y en la
segunda fase éste se convierte en ácido láctico.
- LA FASE I: constituye un proceso preparativo o de congregación en el que cierto número
de hexosas penetran en el esquema, después de fosforilarse a expensas del ATP, y dan
un producto común, el gliceraldehído 3 P.
- LA FASE II: es la ruta común para todos los azúcares, se produce la fosforilación del
ADP y se llevan a cabo las reacciones de óxido reducción, obteniéndose el lactato.
En este proceso hay tres tipos de transformaciones interconectadas.
1º.- La ruta de los átomos de carbono: o sea degradación de la glucosa para formar ácido
láctico.
2º.- La ruta del fosfato: o sea que el Pi (fósforo inorgánico) se transforma en P del ATP.
3º.- La ruta de los electrones: o sea las reacciones del óxido-reducción.
glucosa
almidón
glucogeno
ATP
Pi
glucosa-1-P
FASE I
Congregación de azúcares sencillos y
su
conversión
en
fosfato
ADP
galactosa
manosa
pentosa
glucosa-6-P
de
gliceraldehído; entrada de ATP
fructosa-6-P
ATP
ADP
fructosa-1-6-di P
glicealdehído-3-P (2)
2 NAD+
Pi
1,3 difosfoglicerato (2)
FASE II
2 NADH
2 ADP
2 ATP
3 difosfoglicerato (2)
Oxidación - reducción y formación
acoplada de ATP; salida de lactato
2 difosfoglicerato (2)
fosfoenolpiruvato (2)
2 ADP
2 ATP
piruvato (2)
2 NAD+
2 lactato
1. Fosforilación de glucosa por el ATP: catalizada por dos enzimas: la hexoquinasa y
glucoquinasa.
ATP
+
Mg++
glucosa
ADP
+
∆Gº = −4 kcal
glucosa-6-P
Es una reacción irreversible. La hexoquinasa es de mayor afinidad que la glucoquinasa por la
glucosa. La glucoquinasa solo actúa cuando hay alta concentración de glucosa en sangre; las
dos enzimas necesitan del catión Mg + + ó Mn + + para formar el verdadero sustrato que es
Mg − Mn − ATP . La hexoquinasa actúa también; fosforilando otras hexosas. La reacción es
irreversible.
CH2
CH2 OH
OPO 3=
O
O
H
H
H
+
OH
ATP
ADP
OH
H
OH
OH
OH
OH
∆Gº = -4 kcal
+
H
H
H
H
H
H
OH
glucosa
OH
glucosa-6-fosfato
2. Conversión de glucosa-6-P a fructosa-6-P: Catalizada por la fosfoglucoisomerasa.
CH2
OPO3=
CH2
O
H
OPO 3=
O
CH2
H
H
OH
OH
OH
OH
H
OH
H
H
OH
H
OH
glucosa-6-P
OH
∆Gº = +0.4 kcal
(reacción reversible)
OH
fructosa-6-P
3. Fosforilación de la fructosa-6-fosfato a fructosa 1-6 difosfato. Interviene una segunda
molécula de ATP. Esta reacción es catalizada por la fosfofructoquinasa.
CH2
OPO 3=
O
CH2
CH2
+
OH
OH
H
OH
ATP
CH2
ADP
OH
OH
H
OH
OH
H
OH
OPO 3=
∆Gº = -3.4 kcal
+
H
OH
OPO 3=
O
(reacción irreversible)
4. Escisión de la fructosa 1 - 6 difosfato por una aldosa (la fructosa-1-6-difosfato
gliceraldehído 3-liasa) dando fosfato de dihidroxiacetona + gliceraldehído-3-fosfato.
1.
CH2
2.
C
OPO 3=
H
O
1. CH2
OPO 3=
4.
C
O
3. HO CH
2. C
O
+
∆Gº = + 5.73 kcal
5. H COH
4. H COH
3. CH2
6.
OH
CH2
OPO 3=
5. H COH
6.
CH2
OPO 3=
fructosa 1-6-di P
(cadena abierta)
fosfato de
dihidroxiacetona
gliceraldehído 3-P
INTERCONVERSION DE LOS FOSFATOS DE TRIOSA
Solamente uno de los dos fosfatos de triosa, el gliceraldehído 3-fosfato, puede ser directamente
degradado en las reacciones posteriores de la glucólisis. El otro, el fosfato de dihidroxiacetona,
se convierte reversiblemente en gliceraldehído-3-fosfato por acción de la enzima triosa fosfato
isomerasa.
O
CH2 OPO 3=
C
O
CH2 OH
C
H
H C OH
∆Gº = 1.83 kcal
CH2 OPO 3=
Así en la primera fase una molécula de glucosa da dos moléculas de gliceraldehído 3 P.
SEGUNDA FASE
1. Oxidación del gliceraldehído 3 P a 1-3 difosfoglicerato. La enzima que actúa es
G_3_fosfato deshidrogenasa, o gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa.
2 gliceraldehído-3-P + 2 NAD+ + 2 Pi
(2) 1,3 di-fosfoglicerato + 2 NADH + 2 H+
O
O
C
PO 3=
H
C
HC
O
+ NAD+ + Pi
2 H COH
OH
2 CH2
O
∆Gº = 1.5 kcal
+
PO 3= + NADH + H
CH2 OPO 3=
El NAD y el NADH transportan los electrones.
2. Transferencia de fosfato desde el 1-3 difosfoglicerato al ADP. El 1-3 difosfoglicerato +
ADP da 3-fosfoglicerato + 2 ATP; es catalizada la reacción por la enzima
fosfogliceratoquinasa.
O
1. C
3.
O
PO 3=
2. H COH
CH2 OPO 3=
2. H COH
+ ADP
+ ATP
∆Gº = − 4.50 kcal
(reacción irreversible)
3. CH2
1.
OPO 3=
COO
-
3. Conversión del 3-fosfoglicerato dando 2-fosfoglicerato. Actúa la fosfoglicera tomutasa.
CH2 OH
CH2 OPO 3=
COO
∆Gº = 1.06 kcal
H COPO 3=
H COH
-
COO
3-fosfoglicerato
-
2-fosfoglicerato
4. El 2-fosfoglicerato da fosfoenolpiruvato + H20 por medio de una enzima, la enolasa, en
un proceso de deshidratación.
CH2 OH
CH2
enolasa
H COPO 3=
COO
-
2-fosfoglicerato
C
COO
O
PO 3=
-
fosfoenolpiruvato
+ H2O
∆Gº = + 0.44 kcal
5. Transferencia de fosfato desde el fosfoenolpiruvato al ADP. El fosfoenolpiruvato da
piruvato por una enzima piruvato quinasa en presencia de ADP y Mg + + .
CH3
CH2
C
O
COO
PO 3=
+ ADP
ATP +
C
-
O
COO
fosfoenolpiruvato
∆Gº = − 7.5 kcal
(reacción irreversible)
-
piruvato
6. Reducción de piruvato a lactato. Piruvato da lactato por medio de lactato deshidrogenasa.
CH3
C
CH3
O
COO
∆Gº = − 6.0 kcal
+
H COH + NAD
+ NADH + H+
COO
-
piruvato
-
lactato
En condiciones anaerobias el lactato es producto final de la glucólisis el cual difunde a través de
la membrana plasmática de la célula hacia el entorno como producto de deshecho. Cuando las
células musculares de los animales superiores actúan de manera anaerobia durante cortos
esfuerzos de actividad vigorosa (excepcionalmente) el lactato escapa desde las células
musculares a la sangre y es transformado nuevamente en glucosa en el hígado.
BALANCE GLOBAL
2 ADP
glucosa + 2 ATP + 2 NAD+ + 2 Pi + 4 ADP + 2 NADH+ + 2 H+
2 lactato + 2 ADP +
+ 2 ATP + 2 NADH + 4 ATP + 2 H2O + 2 H+ + 2NAD+
glucosa + 2 Pi + 2 ADP
2 lactato + 2 ATP + 2 H2O
ENTRADA DE LOS OTROS HIDRATOS DE CARBONO
Los polisacáridos de reserva el glucógeno, almidón, azúcares sencillos distintos de la glucosa
penetran en la primera fase de la glucólisis. El glucógeno y el almidón penetran por la acción de
dos enzimas que actúan sobre los extremos terminales no reductores de la molécula,
escindiendo los enlaces alfa (1-4). Otra enzima actúa sobre las ramificaciones alfa (1-6) dando
glucosa-1-fosfato para luego dar glucosa-6-fosfato. Los azúcares sencillos una vez fosforilados,
por ej. : manosa-6-P, fructosa-6-P recién penetran al ciclo.
manosa + ATP
manosa-6-P + ADP
fructosa + ATP
fructosa-6-P + ADP
TRABAJO PRACTICO Nº 12
METABOLISMO HIDROCARBONADO
I.
OBJETIVOS
Al finalizar el trabajo práctico el alumno estará en condiciones de:
1. Dosar glucosa en sangre realizando en forma práctica una curva de tolerancia a la
glucosa.
2. Interpretar una curva de tolerancia a la glucosa en condiciones normales.
3. Establecer si en el organismo existen o no trastornos o alteraciones en el metabolismo de
los Hidratas de Carbono.
II. INTRODUCCIÓN
Los principales Hidratos de Carbono del organismo animal son la glucosa y el glucógeno.
La glucosa existe libre en los tejidos y en la sangre en aproximadamente la misma
concentración.
El glucógeno representa el hidrato de carbono de reserva y se encuentra en todos los tejidos
en concentración muy variable.
Los hidratos de carbono que se ingieren, se absorben y son utilizados por el organismo
previa conversión en glucosa y glucógeno.
En el individuo normal la concentración de glucosa en sangre muestra valores constantes si
se la determina después de varias horas de ayuno y reposo. Estos valores oscilan entre 75 y
100 mg. por 100 ml de sangre (glucemia normal).
La ingestión de alimentos hidrocarbonados produce una elevación de la glucemia que
alcanza su máximo valor entre la media y una hora siguiente a la ingesta. Los mecanismos
de regulación que se ponen en juego ante el ingreso en el torrente sanguíneo de la glucosa
absorbida en intestino, consiguen sustraer sus. excesos de la circulación y restablecer los
valores a sus límites previos al cabo de 2 a 3 horas.
Los tejidos, en especial hígado y músculo esquelético, contribuyen en esa acción oxidando
más glucosa y/o depositándola en forma de glucógeno.
El estudio de la evolución de la glucemia después de la administración de glucosa puede
indicar la eficiencia de los procesos mediante los cuales el organismo utiliza la glucosa. Ello
permite obtener la llamada curva de tolerancia a la glucosa.
El tipo de curva obtenido puede revelar ciertos trastornos del metabolismo hidrocarbonado.
III. PARTE EXPERIMENTAL: CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA
En este práctico se determinará la curva de tolerancia a la glucosa en un voluntario
administrando 100 gr de glucosa por vía oral.
Después de un ayuno de más de 4 horas se toma una muestra de sangre por punción
venosa. Extraiga 2 ml de sangre, viértalos en un tubo seco de hemólisis para determinar
glucosa por el método de 0.toluidina, al mismo tiempo coloque una gota en tiras de dextrotix
para determinar glucosa por el método de la glucosa-oxidasa. Recoja también en ese
momento orina hasta desocupar la vejiga. Luego se da de tomar la solución que contiene 100
gr de glucosa (2 gr de glucosa por kg de peso).
Vuelva a extraer sangre a la media, una y dos horas siguientes a la ingestión, juntamente con
cada extracción recoja orina. Se tendrán así cuatro muestras de sangre y cuatro de orina. Se
determinará la concentración de glucosa por los métodos que se detallan a continuación:
a. Método de 0-toluidina
Fundamento: la glucosa reacciona específicamente con la 0-toluidina, una amina
aromática primaria en medio acético y por acción del calor da lugar a una mezcla en
equilibrio de una glicosil-amina y la correspondiente base de Schiff.
Técnica: en tres tubos marcar B (blanco), T (testigo) y U (desconocido).
B
Agua destilada
0.05 ml
T
-----------
D
-----------
Testigo
0.05 ml
-----------
-----------
Muestra
---------------------
Reactivo
5 ml.
5 ml
5 ml
0.05 ml
Llevar los tubos a B. M. hirviente de 4 1/2 a 5 minutos. Retirar y colocar en agua fría de
2 a 5 minutos. Leer en espectrofotómetro a 630 mm llevando a cero el aparato con el
blanco. El color es estable 45 minutos.
b. Método de la glucosa oxidasa
Fundamento: la glucosa es oxidada por le glucosa oxidaba a ácido glucónico y
peróxido de hidrógeno. Por la peroxidasa, el peróxido de hidrógeno oxida el sistema
cromógeno para producir distintos tonos violetas que dependerán de la concentración
de glucosa.
Técnica: coloque una gota sobre la tira reactiva, deje actuar un minuto, lavar bajo el
chorro de agua. Secar con hojas de papel de filtro y comparar el color en escala.
c. Método de Benedict (reacción cualitativa):
Fundamento: el sulfato de cobre en medio alcalino y por ebullición, se reduce a óxido
cuproso por la acción del azúcar en orina.
Técnica: en un tubo de ensayo se colocan 5 ml del reactivo y 8-10 gotas de orina y se
lleva a ebullición durante 3 minutos.
La presencia de glucosa producirá un precipitado rojo o amarillo, si la cantidad es muy
pequeña puede aparecer una coloración verde después del enfriamiento.
IV. INFORME
1. Escriba el fundamento de los métodos empleados para determinar glucosa en sangre y
orina.
2. Realizar una curva colocando en las abscisas los miligramos por ciento de glucosa en
sangre y en las ordenadas los tiempos.
V. REACTIVOS
Cinta de Dextrotix
Reactivo Cromogénico: solución 990 mmol/l de acetato de 0-toluidina y 10 mmol/l de
tiocarbamida en ácido acético al 88% como catalizador.
Standard o testigo: solución estabilizada de glucosa (concentración 1 gr/litro).
Reactivo de Benedict:
Sulfato de cobre 17,3 gr
Citrato de sodio 173 gr
Carbonato de sodio anhidro 100 gr
Carbonato de sodio cristal 270 gr
Agua destilada hasta 1000 ml
Disolver en caliente el citrato y el carbonato en 800 ml de agua, se enfría y se filtra si es
necesario. Disolver el sulfato en 150 ml de agua y añadir en la solución anterior por
pequeñas porciones, agitando constantemente. Completar con agua destilada hasta 1000 ml.
VI. BIBLIOGRAFÍA
- AIQUIEL, V. Manual de Análisis Clínicos, 1969
- BLANCO, A. Guía de Trabajos Prácticos de la Facultad de Ciencias de la Universidad
Nacional de Córdoba, 1972.
TEMA XV: CICLO DE LOS ACIDOS TRICARBOXILICOS Y VIA DEL FOSFOGLUCONATO
Energética de la fermentación y respiración. Plan de organización de la respiración. Oxidación
del piruvato a acetil CoA. Ciclo de Krebs. Vías del fosfogluconato.
---------------------------------------------------Las células aerobias obtienen la mayor parte de su energía de respiración, esto es, gracias a
una transferencia de electrones desde les moléculas orgánicas combustibles hasta el oxigeno
molecular. La respiración es mucho más compleja que la glicólisis.
En este tema se esboza el plan general de le respiración y después se considera con
detenimiento el ciclo del ácido tricarboxílico de Krebs, que es la ruta catabólica común por la que
finalmente se degradan todas las moléculas combustibles de la célula (carbohidratos, ácidos
grasos y aminoácidos).
También se describe la ruta del fosfogluconato de oxidación de la glucosa, mecanismo que
genera potencial de reducción para las reacciones biosintéticas.
ENERGETICA DE LA FERMENTACION Y LA RESPIRACION
En la glicólisis se libere solamente una fracción muy pequeña de la energía química
potencialmente asequible en la estructura de la molécula de glucosa. be libera más energía
cuando ésta se oxida completamente a CO 2 y H 2 O como se pone de manifiesto al comparar
las variaciones de energía libre estándar de la conversión anaerobia de la glucosa en lactato y
de su oxidación a CO 2 y H 2 O .
glucosa
glucosa + 6 O2
2 lactato
∆Gº = − 47 kcal
6 CO2 + 6 H2O
∆Gº = − 686 kcal
Cuando las células fermentan a la glucosa anaerobiamente, los productos que ya no son
susceptibles de ulterior empleo, y por ello abandonan la célula, todavía contienen la mayor parte
de la energía de la molécula de glucosa original. Por esta razón, las células que viven
anaerobiamente, para obtener una misma cantidad de energía utilizable tienen que consumir
mucho más cosa que cuando viven en condiciones aerobias.
¿Porqué rinde la respiración mucho más energía que la glicólisis?
En primer lugar, el producto de la glicólisis, el ácido láctico, es una molécula casi tan compleja
como la de glucosa y sus átomos de carbono todavía se hallan en un mismo estado de
oxidación. El CO 2 , producto de la respiración, es una molécula mucho más sencilla y pequeña
que la glucosa, y su átomo de carbono está completamente oxidado. En segundo lugar, la
cantidad de energía que se libera en la transferencia de un par de electrones desde una
molécula combustible determinada a un aceptor electrónico, varía con la naturaleza del aceptor.
Puede liberarse mucho más energía cuando el aceptor electrónico el oxígeno molecular, como
ocurre en la respiración, que cuando es el piruvato el que actúa como aceptor, que es el caso de
la glicólisis.
ORGANIGRAMA RESPIRATORIO
En la figura se muestra un diagrama de la respiración. Los grupos acetilo procedentes de los
carbohidratos, de los lípidos y de los aminoácidos en la fase II del catabolismo, en la siguiente
fase III se incorporan al ciclo de Krebs, que en las aerobias constituye la ruta común final del
catabolismo oxidativo de todas las moléculas combustibles. En este ciclo los grupos acetilo se
desintegran para formar CO 2 y átomos de hidrógeno. Estos últimos (o sus electrones
equivalentes) posteriormente se incorporan a la cadena respiratoria constituida por una serie de
transportadores electrónicos. El proceso subsiguiente de transporte de electrones hasta el
oxígeno molecular se realiza con un descenso muy grande de energía libre, gran parte de la cual
se conserve en forma de ATP, gracias a la fosforilación oxidativa acoplada del ATP. La reacción
global catalizada por el ciclo de Krebs es la siguiente:
CH3COOH + 2 H2O
2 CO2 + 8 H
Como puede verse en la ecuación, no participan en el ciclo ni el oxígeno molecular, ni el fosfato
inorgánico, ni el ATP.
Su función primaria consiste en la deshidrogenación del ácido acético para formar, en último
término, dos moléculas de CO 2 y cuatro pares de átomos de hidrógeno. Este proceso es
catalizado en una serie cíclica de reacciones consecutivas, en contraste con la secuencia
glicolítica, que es lineal.
En cada vuelta del ciclo de Krebs se incorpora una molécula de ”ácido acético” (dos átomos de
carbono) por condensación con una molécula del compuesto de cuatro carbonos, el ácido oxal
acético, para formar el ácido cítrico de seis átomos de carbono. Posteriormente, el ácido cítrico
se degrada con producción de "dos moléculas de CO2 y ácido succínico", compuesto de cuatro
átomos de carbono. Finalmente, este último se oxida a "ácido oxalacético", con lo que puede
iniciarse de nuevo una vuelta del ciclo. En cada una de las vueltas se incorpora una molécula de
ácido acético y se eliminan dos moléculas de CO 2 en cada giro completo se emplea también
una molécula de oxal acetato para formar citrato, pero aquel se regenera al final del ciclo.
Por tanto, cuando el ciclo funciona no hay pérdida neta de oxalacetato, basta con una molécula
para llevar a cabo la oxidación de un número infinito de moléculas de acetato.
Las reacciones enzimáticas del ciclo de Krebs tienen lugar en el compartimiento interno de la
mitocondria (a diferencia de la glucolisis que tiene lugar en el citoplasma celular).
Carbohidrato
Movilización del
Aminoacidos
Ácidos
grasos
Piruvato
acetil CoA
2H
CO2
Acetil-CoA
oxalacetato
Ciclo del ácido
citrato
cis-aconitato
malato
tricarboxilo
isocitrato
CO2
-oxoglutarato
CO2
succinato
fumarato
2H
2H
2H
2H
NAD
flavoproteina
ADP + Pi
ATP
coenzima Q
Transporte electrónico
y fosforilación
oxidativa
citocromo c
ADP + Pi
ATP
citocromo b
citocromo a + a3
+
ADP A Pi
2 H+ + 1/2 O2
ATP
H2O
Oxidación del Piruvato a acetil CoA
O
Piruvato
NAD+
CH3
NADH2
COOH
O
CO2
HS-CoA
C
CH3
C
S
CoA + CO 2
Acetil-CoA
La ecuación global es:
Piruvato + NAD+ + HS + CoA
acetil - S - CoA + NADH2 + CO2
∆Gº = −8.0 kcal
La oxidación de piruvato a acetil-SCoA, catalizada por el sistema piruvato-deshidrogenasa, en
realidad constituye un proceso muy complejo. A causa del gran descenso de energía libre
estándar, la reacción es esencialmente irreversible. Aunque en si misma no forma parte del ciclo
del ácido tricarboxílico, constituye una etapa obligatoria, mediante le cual los hidratos de carbono
se incorporan al ciclo. En este proceso participan dos coenzimas importantes: CoA y ácido
lipoico.
- CoA: actúa como transportador de grupos acilo, efectuando una función análoga a la que
desempeña el ATP como transportador de grupos fosfato. La forma acetilada de la coenzima
A (acetil CoA) es un tioéster del ácido acético. El tioéster es un enlace de elevado contenido
energético; es decir posee un ∆Gº fuertemente negativo.
acetil-S-CoA + H2O
acetato + CoA - SH
∆Gº = −7.52 kcal
- Ácido lipoico: es un factor de crecimiento para algunos microorganismos, un ácido graso
saturado de 8 átomos de carbono, en el que los carbonos 6 y 8 están unidos por un grupo
disulfuro formando un anillo de cinco términos.
CH2
S
CH2
S
CH
(CH2)4
COOH
La decarboxilación oxidante del piruvato a acetil CoA + CO 2 necesita tres enzimas diferentes y 5
coenzimas que constituyen el:
enzimas
Piruvato-deshidrogenasa
dihidrolipoil-transacetilasa
dihidrolipoil-deshidrogenasa
coenzimas
Coenzima A
ácido lipoico
Pirofosfato de tiamina (TPP)
NAD
FAD
Sistema de la
piruvato-deshidrogenasa
REACCIONES INDIVIDUALES DEL CICLO DEL ACIDO TRICARBOXILICO
La acetil-CoA formada como producto final de la piruvato-deshidrogenasa se encuentra ahora
dispuesta para incorporarse al ciclo de Krebs.
1. Se produce la condensación de la acetil-CoA con el oxalacetato, para formar citrato. La
reacción es catalizada por la citrato-sintetasa.
O
CH3
C
S
CoA
CoA
SH
COOH
COOH
Acetil-CoA
oxalacetato
C
CH2
O
HO
C
COOH
CH2
CH2
COOH
COOH
citrato
En esta reacción el grupo metilo (CH3 − ) de la acetil CoA se condensa con el átomo de
carbono carbonílico del oxalacetato con la hidrólisis del enlace tioéster y formación de la
CoA − SH libre.
O
C
2. Actúa una enzima, la aconitasa que cataliza la formación de isocitrato con formación de un
compuesto intermedio el cis-aconitato. En esta reacción se produce pérdida, y posterior
adición de agua.
H2O
OH
COOH
CH2
C
CH2
COOH
COOH
CH2
C
COOH
COOH
COOH
citrato
H2O
CH
cis-aconitato
COOH
CH2
CH
CH
COOH
OH
COOH
isocitrato
3. Se produce una oxidación del isocitrato y pérdida de CO 2 . La reacción es catalizada por la
isocitrato-deshidrogenasa ligada al NAD + , que requiere Mg + ó Mn + + para su actividad.
CO2
COOH
CH2
CH
CH
COOH
OH
COOH
NAD+
isocitrato
O
COOH
CH2
NADH2
CH2
C
COOH
alfa-cetoglutarato
La reacción transcurre con gran descenso de ∆Gº es una reacción altamente exergónica.
4. La oxidación de alfa-cetoglutarato a succinato se produce en dos etapas.
a. En la primera el alfa-cetoglutarato experimenta una decarboxilacíón oxidativa para formar
succinil-S-CoA y CO 2 .
CH2
COOH
CH2
O
C
O
COOH + NAD+ + CoA SH
COOH CH2 CH2 C S CoA + CO2 + NADH2
alfa-cetoglutarato
succinil CoA
Esta reacción es comparable a la de la oxidación del piruvato a CoA y se produce por el
mismo mecanismo con intervención de:
NAD
+
pirofosfato de tiamina
ácido lipoico
FAD
+
que participan como cofactores necesarios ligados a la enzima succinil-CoA-sintetasa.
b. El producto final de la reacción la succinil-CoA que es un tioéster de elevado contenido
energético, experimenta pérdida de su grupo CoA, pero no por una simple reacción de
hidrólisis sino por una reacción con el GDP y fosfato en el que se conserva la energía.
succinil-CoA + Pi + GDP
succinato + CoA
SH
+ GTP
A continuación el GTP formado en esta reacción cede terminal al ADP para formar ATP.
GTP + ADP
GDP + ATP
La reacción es catalizada por la nucleósido-difosfoquinasa. Este tipo de fosforilación se
designa como fosforilación a nivel de sustrato, para distinguirla de las fosforilaciones
ligadas a la cadena respiratoria.
5. El succinato es oxidado a fumarato en una reacción catalizada por la succinatodeshidrogenasa que contiene FAD como coenzima que actúa como aceptor de hidrógeno.
COOH
CH2
COOH + FAD
CH2
COOH
CH2
CH2
succinato
COOH + FADH2
fumarato
6. Se produce una hidratación del fumarato dando malato, actuando coma catalizador la
fumarasa.
OH
COOH
CH
CH
COOH + H2O
COOH
C
CH2
COOH
H
7. En la última reacción del ciclo la malato-deshidrogenasa dependiente del NAD cataliza la
oxidación del malato a oxacetato.
OH
COOH
C
O
CH2
+
COOH + NAD
COOH
C
CH2
COOH + NADH2
H
Podemos ahora resumir los productos producidos en una vuelta del ciclo del ácido tricarboxílico.
Dos átomos de carbono aparecen en forma de CO 2 equivalentes, aunque no idénticos, a los
dos átomos de carbono del grupo acetilo que ingresa en el ciclo. Por deshidrogenación
enzimática se producen cuatro pares de átomos de hidrógeno, tres pares se utilizan para reducir
el NAD y uno para reducir el FAD. En último término, estos cuatro pares de átomos de hidrógeno
y electrones se combinan con el oxígeno, una vez realizado su transporte a lo largo de la cadena
respiratoria.
RUTA DEL GLUCOFOSFATO
Muchas células disponen, además del ciclo del ácido tricarboxílico, de otra ruta de degradación
de la glucosa cuya primera reacción es la oxidación de la glucosa-6-fosfato a 6-fosfato
gluconato.
La ruta del fosfogluconato, conocida como ruta de los fosfatos de pentosa o desviación del
monofosfato de hexosa, no es una ruta principal de oxidación de la glucosa.
- Su objetivo primordial, en la mayor parte de las células, es obtener NADP reducido en el
citoplasma extramitocondrial.
- Una segunda función es la producción de pentosas en especial D-ribosa, que se emplea en
la síntesis de ácidos nucléicos.
- Otra función importante consiste en participar en la formación de glucosa, a partir del CO 2 ,
en las reacciones de fotosíntesis.
Las diversas etapas de la ruta del fosfogluconato tienen lugar en la porción soluble del
citoplasma extramitocondrial de la célula.
1. La primera reacción de la ruta del fosfogluconato es la deshidrogenación enzimática de la
glucosa-6-fosfato por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para formar 6-fosfogluconato.
H
C
OH
H
C
OH
H
C
O
C
OH
H
H
C
OH
H
C
C
OH
HO
C
H
O + NADP
O + NADP
C
H
+
+
HO
COOH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
CH2OPO 3=
CH2OPO 3=
glucosa-6-fosfato
HC
OH
HC
OH
CH2 O PO 3=
6-fosfogluconato-lactona
La enzima es especifica para el NADP como aceptor electrónica. Realiza la
deshidrogenación del átomo de carbono 1 de la forma piranosa de la glucosa-6-fosfato y
rinde la 6-fosfogluconato lactona. Esta última es inestable y experimenta hidrólisis
espontánea a ácido libre en presencia de una lactonasa.
2. En la etapa siguiente el 6-fosfogluconato experimenta una decarboxilación oxidativa por
acción de la 6-fosfogluconato-deshidrogenasa y se forma una pentosa la D-ribulosa-5fosfato; reacción que produce una segunda molécula de NDAHP2 .
CH2 OH
COOH
H
C
C
O
OH
H COH
H
HO
C
C
OH
+ NADP+
H COH
+ NADPH2 + CO2
H
CH2OPO 3=
H
C
OH
CH2OPO 3=
6-fosfogluconato
ribulosa-5-fosfato
3. Por acción de la fosfo-pentosaepimerasa la ribulosa-5-fosfato se transforma
reversiblemente en xilulosa-5-fosfato, su epímero en el átomo de carbono 3. Por acción
de la fosfo-pentosa-isomerasa, la ribulosa-5-fosfato, puede convertirse, también
reversiblemente, en su isómero aldo, la ribosa-5-fosfato que puede emplearse en la
síntesis de los nucleótidos que contienen pentosa y el ARN.
CH2 OH
C
O
xilulosa-5-fosfato
HO C H
CH2 OH
HC
C
O
H
C
OH
H
C
OH
im
ep
sa
era
OH
CH2OPO 3=
CHO
CH2OPO 3=
iso
me
ras
a
ribulosa-5-fosfato
HC
OH
H
C OH
H
C OH
ribosa-5-fosfato
CH2OPO 3=
En ciertas circunstancias, la ruta del fosfogluconato finaliza en este punto, y entonces su
ecuación global se escribe así:
glucosa-6-fosfato + 2NADP+ + H2O
ribosa-5-fosfato + CO2 + 2NADPH2
El resultado neto es la producción del NADPH necesario para las reacciones biosintéticas de
reducción en el citoplasma extramitocondrial, y la formación de ribosa como precursor para la
síntesis de nucleótidos. En otras circunstancias, sin embargo, la ruta del fosfogluconato continúa
más allá, ya que las pentosas-5-fosfato pueden experimentar otras transformaciones que son
posibles gracias a dos enzimas adicionales: la transcetolasa y la transaldolasa.
- La transcetolasa que contiene pirofosfato de tiamina íntimamente unido como coenzima y
Mg + + , realiza la transferencia de un grupo glicoaldehído desde la xilulosa-5-fosfato a la
ribosa 5 fosfato. En este proceso el grupo glicolaldehído ( CH 2 OH − CO − ) se transfiere en
primer lugar al pirofosfato de tiamina unido e la enzima, que actúa como transportador
intermediario del grupo glicolaldehído, que a continuación es transferido a la molécula del
aceptor, la ribosa-5-fosfato. El resultado neto consiste en la formación de un ceto-azúcar de 7
átomos de carbono, la sedo heptulosa-7-fosfato, y un azúcar de 3 átomos de carbono, el
glicer aldehído-3-fosfato.
CH2 OH
C
O
HO
C
H
H
C
OH
CHO
CH2 OH
HCOH
+
C
O
C
H
H
C
OH
H
C
OH
HC
OH
CH2OPO 3=
HC
OH
HC
OH
CH2OPO 3=
HO
CHO
+
HC
OH
CH2 O PO 3=
CH2 O PO 3=
xilulosa-5-P
ribosa-5-P
sedoheptulosa-7-P
gliceraldehído-3-P
Debe observarse que uno de los productos de la acción de la transcetolasa es el
gliceraldehído-3-P que es un intermediario de la secuencia glicolítica. Su formación
constituye un lazo de conexión entre la vía glicolítica y la del fosfogluconato.
- La segunda enzima que participa en transformaciones ulteriores de la vía del fosfogluconato
es la transaldolasa, que actúa sobre los productos de la reacción catalizada por la
transcetolasa Cataliza la transferencia del grupo dihidroxiacetona correspondiente a los
átomos de carbono 1-2-3 de la sedoheptulosa para formar un azúcar de 6 átomos de
carbono, la fructosa-6-fosfato, y otro azúcar de 4 átomos de carbono, la eritrosa-4-fosfato.
CH2 OH
C
O
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2 O
CH2 OH
CHO
+
H
C
C
O
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
OH
CH2 O
PO 3=
CHO
+
HC
OH
HC
OH
CH2 O
CH2 O
PO 3=
PO 3=
PO 3=
La fructosa-6-fosfato, es también un intermediario de la glicólisis y por lo tanto, el segundo
punto de conexión entra las dos rutas: glicolítica y fosfogluconato.
Otra reacción destacada que cataliza la transcetolasa es:
xilulosa-5-P + eritrosa-4-P
fructosa-6-P + gliceraldehído-3-P
En la que dos intermediarios de la vía del fosfogluconato pueden convertirse en intermediarios
de la vía glicolítica.
Una consecuencia importante de la acción de las dos enzimas, consiste en que hacen posible,
junto con las enzimas de la secuencia glicolítica la interconversión de los azúcares.
La última parte de la vía del fosfogluconato no es bien definida, no conduce a un único producto
final, sino a una ruta ramificada, capaz de gran flexibilidad metabólica.
Es probable que la ruta del fosfogluconato normalmente se reúna con el ciclo glicolítico por
interconversión en intermediarios de la glicólisis.
TEMA XVI: TRANSPORTE DE ELECTRONES Y FOSFORILACION OXIDATIVA
Reacciones de óxido reducción. Enzimas de óxido-reducción. Vía de transporte de electrones: la
cadena respiratoria. Energética del transporte de electrones. Fosforilación oxidativa.
Acoplamiento de la fosforilación oxidativa al transporte de electrones.
------------------------------------------------Veremos en este capítulo que los pares de electrones derivados de los intermediarios del ciclo
del ácido tricarboxílico fluyen a lo largo de una cadena de varios eslabones, constituidos por
enzimas de transporte electrónico, con niveles de energía sucesivamente inferiores hasta reducir
al oxígeno molecular, que es el último aceptor electrónico, en la respiración. Durante este
proceso se conserva gran parte de la energía libre de estos electrones en forma de energía del
enlace fosfato del ATP; el proceso se denomina fosforilación oxidativa.
El transporte electrónico y la fosforilación oxidativa suceden en casi todas las células aerobias;
las enzimas que catalizan estas reacciones se hallan localizadas en la membrana interna de las
mitocondrias.
Reacciones de oxidación-reducción: antes de referirnos a oxidaciones biológicas, veremos
que se entiende por oxidación y reducción.
a. Si el hierro (Fe) reacciona con el oxígeno
4Fe
+
3O2
2Fe2
O3
Este proceso de ganancia de oxigeno se denomina oxidación y lo inverso o sea la pérdida
de oxigeno, reducción.
b. Si se combina un elemento con otro distinto al oxígeno
Znº + Cu++ SO4=
Zn++ SO4=
+ Cu
Lo que ocurrió es lo siguiente: el Zn es neutro, de el se desprenden una pareja de
electrones y se convierte en ión Zn.
Zn
carga 0
Zn++
carga 2
Se produce una oxidación del Zn porque de carga 0 pasa a carga 2. A su vez el ión Cu + +
capta los electrones.
Cu++ + 2ecarga 2
El cobre se reduce de carga 2 pasa a 0.
Resumiendo:
1. la pérdida de electrones se denomina oxidación
2. la ganancia de electrones se denomina reducción
Cu metalico
carga 0
c. En compuestos orgánicos el proceso de oxidación se acompaña de pérdida de hidrógeno o
ganancia de oxígeno.
H
H
C
H
H2O
H
-2H
H
C
H
OH
H
H
metano
metanol
-2H
H
H
H2O
C
O
-2H
H
C
O
ácido
metanoico
metanal
-2H
CO2
anhídrido
carbónico
El carbono llega a su grado máximo de oxidación.
O sea que la pérdida de átomos de hidrógeno o deshidrogenación equivale también a una
oxidación y el proceso inverso a una reducción.
oxidación
ganancía de oxígeno
pérdida de electrones
pérdida de hidrógeno
reducción
pérdida de oxígeno
ganancia de electrones
ganancia de hidrógeno
Las reacciones de oxidación-reducción son aquellas en que tiene lugar una transferencia de
electrones, desde un dador electrónico (el reductor) hasta un aceptor electrónico (el agente
oxidante u oxidante). Es decir que siempre que hay pérdida de electrones por un átomo se
produce una transferencia de electrones a otro átomo. O sea que la oxidación y la reducción son
simultáneas.
Ared. + Boxid.
Aoxid. + Bred.
Al equilibrio entre la forma reducida y oxidada se llama sistema de óxido reducción o sistema
redox. La tendencia de un agente reductor a perder electrones se puede expresar mediante el
potencial de reducción estándar. Es decir colocando la especie oxidante y reductora a
concentración 1.0 M, pH = 7, y a 25º C. Para medir el potencial se establece como patrón de
referencia el potencial de reducción del H 2 en la siguiente reacción.
H2
2H+
+
+2e-
El cual por convención se ha establecido que es igual a 0,0 voltios, cuando la presión de H 2
gaseoso es de 1,0 atmósfera, la concentración 1,0 M, el pH 0,0 y temperatura 25º C. Cuando se
corrige este valor a pH 7,0 el potencial estándar del sistema hidrógeno-ión hidrógeno es de -0,42
voltios.
Potenciales de reducción estándar de algunos pares redox
Reductor
Oxidante
E’ voltios
Acetaldehído
Acetato
- 0.60
H2
2H +
- 0.42
Isocitrato
α cetoglutarato + CO 2
- 0.38
NAD + H +
NAD +
- 0.32
Lactato
Piruvato
- 0.19
NADH – deshidrogenasa
(reducida)
Oxidada
- 0.11
Fe (III)
0.00
Fe (II)
Fe (III)
+ 0.26
H2 O
½ O2
+ 0.82
Citocromo b
Fe (II)
Citocromo c
Los sistemas que poseen un potencial estándar de reducción más negativo que el del par
H2
2H
+
muestran mayor tendencia a perder electrones que el hidrógeno; los que poseen
potencial más positivo tienen menor tendencia a perder electrones. Obsérvese la pareja aguaoxígeno: posee un potencial estándar de reducción fuertemente positivo.
1/2 O2
H2
+
2 H+
+
+2e-
Por dicha razón el agua muestra muy poca tendencia a perder electrones y a formar oxígeno
molecular. Dicho de otro modo, el oxígeno molecular tiene gran afinidad por los electrones,
superior que la de aceptores biológicos de electrones tales como el NAD + , las flavoproteínas y
los citocromos.
Cadena respiratoria:
Sustrato reducido
Sustrato oxidado
NAD+
CoQ
FADH2
NADH2
FAD+
CoQH2
ATP
+
2H
+ 1/2 O2
H2O
Fe++
Fe+++
Fe++
cit. b
c
a+ a3
Fe+++
Fe++
ATP
Fe+++2H
ATP
En el proceso un sustrato que se va a oxidar entrega sus electrones eH + al primer constituyente
de la cadena que es el NAD + y se reduce. El NADH + + H + entrega sus hidrógenos y respectivos
electrones a una flavoproteína y ésta a la coenzima Q, que desempeña el papel de transportador
electrónico entre las deshidrogenases ligadas al NAD + y FAD + y los citocromos. De aquí en
adelante lo que se transfieren ya son electrones y los H + irán al medio. Los electrones son
captados por el citocromo b, c y a + a3. Este último es autooxidable y entrega los electrones al
1/ 2 O 2 que con los H + formará H 2 O .
Enzimas de óxido-reducción: Tres son las clases principales de enzimas que participan de la
corriente del transporte electrónico desde los sustratos orgánicos hasta el oxigeno molecular. De
acuerdo al orden en que participan son los siguientes:
1. Deshidrogenasas ligadas a la piridina que requieren NAD o NADP como coenzima.
Participan en la primera parte del eslabón:
Sustrato reducido
NAD+
Sustrato oxidado
NADH + H+
2. Deshidrogenasas ligadas a la flavina que tienen como grupo prostético al FAD o al FMN.
Participan en la segunda parte del eslabón
FADH + H
CoQ
FAD
CoQH + H
3. Los citocromos que contienen un sistema nuclear ferroporfirínico. Participan en la última
parte del eslabón
Fe++
Fe+++
Fe++
cit. b
c
a+ a3
Fe+++
Fe++
Fe+++
2H+ + 1/2 O2
Analizamos cada una de las enzimas con sus respectivas coenzimas:
H2O
Deshidrogenasa ligadas a la piridina: se conocen alrededor de 150 y catalizan la siguiente
reacción:
Sustrato oxidado + NADH + H+
Sustrato reducido + NAD+
Las deshidrogenases ligadas a la piridina transfieren reversiblemente dos equivalentes de
reducción desde el sustrato a la forma oxidada del nucleótido piridínico; uno de ellos aparece en
el nucleótido reducido como un átomo de hidrógeno. El otro átomo de hidrógeno separado del
sustrato aparece en forma de H + libre en el medio. Veamos la estructura del NAD:
O
HO
P
O
O
H2C
adenina
H
H
OH
OH
CONH2
HO
P
O
O
+
O
H2C
N
H
H
OH
OH
La parte activa de los nucleótidos piridínicos es la nicotinamida, ya que ésta es la porción de la
molécula que va a recibir el hidrógeno del sustrato. Es importante destacar que la nicotinamida
es una vitamina del complejo 8 sea que por su participación en los mecanismos de óxidoreducción cumplen un papel fundamental en la célula. El mecanismo de óxido-reducción se
realiza según el siguiente esquema:
H
H
CONH2
CONH2
+ H+
+ 2H
+
N
N
R
R
Deshidrogenases ligadas a la flavina:
Esta clase de enzimas contienen flavin-adenin-dinucleótido (FAD) o bien flavín-mononucleótido
(FMN) como grupos prostéticos. En la mayor parte de las flavín-deshidrogenasas el nucleótido
flavínico se halla firmemente unido y no se separa de la enzima durante el ciclo catalítico.
Veamos la estructura del FMN:
6-7 dimetil-iso-aloxacina
CH2
CH2
CH2
riboflavina
(vitamina B2)
CH2
CH2
O
HO
FDN
OH
P
OH
O
O
P
O
OCH2
O
adenina
H
H
OH
OH
H
FDN: resulta de la unión pirofosfórica entre el FMN y el AMP. La parte activa del FAD y del FMN
es el anillo de isoaloxacina.
H
O
H
N
CH3
O
H
N
CH3
N
N
CH3
CH3
N
R
N
O
N
N
R
H
O
En cuanto a la coenzima Q o ubiquinona existen controversias. Importantes experimentos
recientes permiten creer que la CoQ es realmente uno de los transportadores de la cadena
respiratoria, y que funciona, posiblemente, como una molécula liposoluble que actúa a modo de
nexo de unión entre las flavoproteínas y el sistema de los citocromos.
Citocromos: los citocromos son un grupo de ferroproteínas transferidoras de electrones en las
células aerobias, que actúan secuencialmente transfiriendo electrones desde las flavoproteínas
al oxígeno molecular Todas ellas contienen grupos prostéticos ferroporfirínicos; en este aspecto
se parecen a la hemoglobina y a la mioglobina. Los citocromos experimentan cambios de
valencia reversibles, Fe (II) - Fe (III), durante el ciclo catalítico. El citocromo terminal de la
cadena, que puede reaccionar con el oxígeno, es la citocromo-oxidasa. Las formas reducidas de
los demás citocromos no pueden reoxidarse directamente por el oxigeno molecular.
Estructura: los citocromos tienen grupos prostéticos hierro porfirínicos. El anillo porfirínico deriva
del compuesto tetrapirrólico llamado porfina que se designa según sus cadenas laterales
sustituyentes.
HC
CH
N
N
HN
N
HC
CH
Forman quelatos (literalmente, cuatro dientes) con iones metálicos como el hierro, por ejemplo.
En los citocromos, el átomo de Fe experimenta cambios reversibles entre las formas Fe (II) y Fe
(III); su función real es la de desempeñar el papel de transportadores electrónicos.
Potencial estándar de óxido-reducción en la cadena respiratoria: los potenciales de
reducción de los diferentes transportadores electrónicos, se hacen más positivos a medida que
los electrones pasan desde el sustrato el oxígeno. Es decir, que el transportador electrónico más
próximo el extremo inicial de la cadena, o sea el NAD es el término más reducido, mientras que
los transportadores situados en el extremo del oxigeno (citocromo a + a3) están casi por
completo en la forma oxidada. Los transportadores intermedios en estados sucesivamente más
oxidados, según una escala que va desde el sustrato hasta el oxígeno.
Energética del transporte electrónico-Fosforilación oxidativa: hemos visto que el ∆Gº que
se produce en el transcurso de cualquier reacción química es función de su constante de
equilibrio.
∆Gº = −RT Ink eq
puede utilizarse una forma modificada de esta expresión para calcular la ∆Gº que se produce
cuando reaccionan entre sí dos pares de óxido-reducción cuyos potenciales de reducción
estándar son conocidos.
∆Gº = − nFT ∆E' 0
-
∆Gº = variación de energía libre estándar expresada en calorías;
- n = número de electrones transferidos;
- F = equivalente calorífico de faraday;
-
∆E' 0 = la diferencia entre los potenciales de reducción estándar del aceptor del dador
electrónico.
Se supone que todos los componentes se hallan a concentraciones 1, 0 M, a 25º C y pH = 7,0
Mediante esta relación, podemos calcular la ∆Gº cuando se transfiere un par equivalentes
electrónicos desde el NADH al oxigeno molecular, es decir a lo largo de toda la cadena
respiratoria.
∆Gº = − 2 × 23062 × [(0.82 − (− 0.32))] = −52.700 kcal = − 52.7 kcal
Se produce, por tanto, una variación de energía libre muy grande durante el proceso de
transporte electrónico desde el NADH hasta el oxígeno molecular, a través de la cadena
respiratoria. Este valor puede compararse con la energía libre estándar de formación de ATP a
partir del ADP y el fosfato.
ATP + H2O
ADP + FOSFATO
∆Gº = +7.3 kcal
Puede verse que la transferencia de un par de electrones, desde el NADH al oxigeno va
acompañada de una disminución de energía libre lo suficientemente grande para que resulte
posible la síntesis de varias moléculas de ATP, a partir de ADP y de fosfato, en las condiciones
estándar, siempre que se disponga de un mecanismo de acoplamiento.
Mediante cálculos semejantes se obtienen las ∆Gº que tienen lugar en cada una de las etapas
principales de transferencia electrónica en la cadena respiratoria, cuyos potenciales de reducción
estándar son conocidos. Tres de los pasos de la cadena respiratoria muestran ∆Gº
relativamente grandes; ellos son:
1. entre NAD y FAD
2. entre citocromo b y c
3. entre citocromo a y el oxígeno
En cada uno de ellos se produce una disminución de energía libre suficientemente grande para
que se origine la formación acoplada del ATP a partir de ADP y de fosfato. Las ∆Gº en otros
puntos de la cadena son pequeñas y, por ello resultan insuficientes para provocar la formación
de una molécula de ATP.
Acoplamiento de la fosforilación oxidativa al transporte electrónico: La fosforilación del
ADP acoplado a la respiración representa un mecanismo de recuperación aerobia de energía y
recibe el nombre de fosforilación oxidativa. La ecuación global para las fosforilaciones de la
cadena respiratoria puede escribirse como sigue:
NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + +1/2 O2
NAD+ + 4 H2O + 3 ATP
que podemos analizar desde el punto de vista de su componente exergónico.
NADH + H+ + 1/2 O2
NAD+ + H2O
∆Gº = −52.7 kcal
y de su componente endergónico:
3 ADP + 3 Pi
3 ATP + 3 H2O
∆Gº = 3 × 7.3 = 21.9 kcal
La fosforilación oxidativa acoplada de tres moléculas de ATP conserva por lo tanto 21,9/52,7 x
100, es decir, alrededor del 40% del descenso total de energía libre. Sólo se formarán 3
moléculas de ATP si el sustrato se oxida a nivel del NAD. Puede ocurrir que el sustrato entregue
sus electrones a la flavoproteina (por ej. succinato) en este caso se producen 2 moléculas de
ATP; y si entrega sus electrones al citocromo a, (por ej. ácido ascórbico) se forma solamente una
molécula de ATP.
Balance energético de un proceso de respiración: es decir, el ∆Gº , cuando la glucosa se
oxida completamente hasta CO 2 + H 2 O por la secuencia glicocolítica y el ciclo del ácido
tricabroxílico.
1.
glucosa
a
2 piruvato
glucosa + 2 Pi + 2 ADP + 2 NAD+
2 piruvato + 2 NADH + H+ + 2 ATP + 2 H2O
2.
2 acetil CoA
2 piruvato
2 (piruvato + NAD+ + HS - CoA)
2 acetil CoA + 2NADH + 2H+ + 2CoA2
NADH + H + se reoxida en la cadena respiratoria y se producen 3 ATP; como son 2
moleculas de NADH + H+ 3 ATP x 2 = 6 ATP
3. Ciclo de Krebs se producen 24 ATP
a. 2 isocitrato → 2 alfa-cetoglutarato hay deshidrogenación, los H 2 son captados por el
NAD + que se reoxida en la cadena respiratoria y se producen 6 ATP.
H2O
b. 2 alfa-cetoglutarato
producen 6 ATP.
2 succinato, ocurre lo mismo, o sea que también se
H2
2 oxalacetato
c. 2 malato
6 ATP.
H2
d. 2 succinato
2 fumarato. En este caso los hidrógenos son captados por
el FAD. Se producen 4 ATP.
e. 2 succinato CoA
producen 2 ATP.
2 succinato, hay una fosforilación a nivel de sustrato de
Resumiendo:
a ………….. 6 ATP
b ………….. 6 ATP
c ………….. 6 ATP
d ………….. 4 ATP
e ………….. 2 ATP
24 ATP
4. El NAD + H + que se produce en la glicólisis en el pasaje de gliceraldehído
3 P → 3 P glicerato , cuando el proceso es anaerobio se reoxida en el pasaje de
piruvato → lactato .
Cuando el proceso es aerobio el NADH + H + se reoxida en la cadena respiratoria, por lo tanto se
producen 2 ATP x 2 (porque son dos moléculas de NADH + H + ) = 4 ATP. O sea que el balance
global será:
1. ………….. 2 ATP
2. .………….. 6 ATP
glucosa + 6 O2 + 36 Pi + 36 ADP
3. ………….. 24 ATP
6 CO2 + 36 ATP + 42 H2O
4. ………….. 4 ATP
36 ATP
Si analizamos el compomente exergónico
glucosa + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O
∆Gº = −680 kcal
componente endergónico
36 Pi + 36 ADP
36 ATP + 36 H2O
∆Gº = +263 kcal
La eficacia global de la recuperación de energía resulta ser:
263
× 100 = 39%
680
Como entra el NADH producido en la glicólisis a la cadena respiratoria: el NADH2
citoplasmático producido en la glicólisis es impermeable a la membrana mitocondrial, por lo tanto
si no penetra en la mitocondria no se puede reoxidar a nivel de la cadena respiratoria. Aunque el
NADH no puede penetrar, sus electrones pueden hacerlo por medios indirectos denominados
lanzaderas. La mejor conocida es la lanzadera del glicerofosfato. El NADH citoplasmático
reacciona con la dihidroxiacetona citoplasmática para formar glicerol-3-fosfato en una reacción
catalizada por la glicerofosfato-deshidrogenasa citoplasmática.
dihidroxiacetona fosfato + NADH + H+
glicerol-3-fosfato + NAD+
El glicerol-3-fosfato atraviesa fácilmente la membrana mitocondrial. En el interior de la
mitocondria otra glicero-3-fosfato-deshidrogenasa reoxida el glicerol-3-fosfato a dihidroxiacetona
fosfato.
dihidroxiacetona fosfato + FADH2
glicerol-3-fosfato + FAD
La flavoproteína reducida cede sus equivalentes de reducción a la cadena respiratoria a nivel de
CoA y finalmente pasan al oxígeno. La dihidroxiacetona fosfato formada en esta reacción difunde
fuera de la mitocondria el citoplasma en donde puede aceptar electrones de otra molécula de
NADH extramitocondrial.
NADH + H+
NAD+
DIHIDROXICETONA-P
GLICEROL-FOSFATO
NAD
FAD
ATP
ATP
O2
TRABAJO PRACTICO Nº 14
OXIDACIONES BIOLÓGICAS
I.
OBJETIVOS
Al finalizar el trabajo práctico el alumno estará en condiciones de:
a). Definir oxidación y reducción
b). Realizar un esquema de la cadena respiratoria (oxidación biológica)
c). Reconocer prácticamente reacciones de óxido-reducción
d). Discutir un articulo de revista y sacar las conclusiones del mismo.
II. INTRODUCCION
Como los conceptos de oxidación y reducción en química general son aplicables a las
reacciones biológicas, es necesario fijar las siguientes nociones elementales:
Una oxidación puede considerarse como:
a). ganancia de oxigeno
b). pérdida de hidrógeno
c). pérdida de electrones
La reducción indica lo inverso de la oxidación, es decir:
a). pérdida de oxigeno
b). ganancia de hidrógeno
c). ganancia de electrones
Si bien se ha definido separadamente oxidación y reducción, es imposible que se produzca una
oxidación aislada, sin la correspondiente reducción simultánea. Los electrones que se
desprenden del elemento o compuesto que se oxida no pueden existir al estado libre y se fijan a
otro elemento o compuesto que, en consecuencia, se reduce.
La mayoría de las oxidaciones biológicas se cumplen en la llamada cadena respiratoria, a través
de una serie de reacciones catalizadas por sistemas enzimáticos presentes en las mitocondrias y
cuya función es la producción controlada de energía. Esta puede ser acumulada en compuestos
de alto contenido energético (ATP) gracias a los procesos de fosforilación acoplados a aquellas
oxidaciones.
La primera parte de la cadena respiratoria comprende una serie de pasos en los cuales los
hidrógenos del sustrato se transfieren sucesivamente a través de varios sistemas o etapas . A
partir de los citocromos se continúa con la transferencia de electrones hasta un aceptor final, el
oxigeno. El esquema siguiente representa la secuencia de etapas y los puntos de entrada de
algunos sustratos. También se observa los sitios de inhibición del transporte de electrones
PIRUVATO
ISOCITRATO
MALATO
GLUTAMATO
FLAVOPROTEINA 5
NAD
3-HIDROXIACIL CoA
ATP
FLAVOPROTEINA 1
Ácido Graso CoA
succinato
rotenona
FLAVOPROTEINA 3
barbitúrico
FLAVOPROTEINA 3
COENZIMA Q
Glicerofosfato
FLAVOPROTEINA 3
CITOCROMO b
Antimicina A
ATP
CITOCROMO C1
CITOCROMO C
CITOCROMO a + a3
ATP
Cianuro
O
III. PARTE EXPERIMENTAL
En la primera parte del Trabajo se efectuarán reacciones de Química Inorgánica en las
cuales la oxidación o reducción se pone de manifiesto por un cambio de color en el medio.
1. Reducción por pérdida de oxigeno: coloque un trozo de cobre metálico en un tubo de
ensayo y agregue aproximadamente 1 ml de ácido nítrico diluído. Observe el
desprendimiento de vapores rojizos de óxido nítrico y el color azul que toma la solución
debido a la formación del catión cobre.
8 NO3 H + 3 Cu
Acido
Nítrico
(incoloro)
3 (NO3)2 Cu + 2 NO + 4 H2O
Cobre
(rojo)
Nitrato
de cobre
(azul)
Óxido
Nitrico
El NO3 H contiene 3 átomos de O por molécula y se convierte en un compuesto (NO)
que sólo contiene uno.
2. Oxido-reducción por transferencia de electrones:
a. Coloque en un tubo de ensayo una granalla de zinc y agregue 2 ml de solución de
sulfato de cobre al 1,5 %. Caliente a la llama y observe la decoloración de la
solución y la aparición de partículas rojo parduzcas (cobre metálico).
SO4 Cu + Zn
(Azul)
SO4 Zn + Cu
(Incoloro) (Rojo pardo)
Interpretación:
Zn -
2 e-
Zn++
(oxidación)
Cu++ +
2 e-
Cu
(reducción)
b. Agregue 1 ml de ioduro de potasio al 2% en un tubo que contiene 1 ml de cloruro
férrico al 0,5%. Observe la coloración amarilla que toma la solución, debida a la
liberación de iodo. Añada una gota de engrudo de almidón que permitirá reconocer
el iodo liberado por la aparición de un color azul.
2 I- - 2 e-
I2
(oxidación)
IV. PANEL
A continuación se discutirán dos artículos básicos (ver bibliografía), sobre mitocondria y
cadena respiratoria, cuyos autores son investigadores de gran relevancia.
V. INFORME:
a. Explicar las reacciones de óxido-reducción realizados en el laboratorio.
b. Escribir las conclusiones de cada uno de los artículos comentados en el Panel.
VI. REACTIVOS
1.- Ácido nítrico diluido (2N): mida 133 ml de NO 3 H concentrado y diluya hasta 1000 ml con
agua destilada.
2.- Sulfato de cobre 1,5%: disuelva 15g de SO 4 Cu en 1000 ml de agua destilada.
3.- Ioduro de potasio 2%: disuelva 20 g IK en 1000 de agua.
4.- Cloruro férrico 0.5%: disuelva 5 g de Cl 3 Fe en 1000 ml de agua.
VII. BIBLIOGRAFIA
1. Blanco A. Guía de Trabajos Prácticos de la Facultad de Ciencias Médicas de la
Universidad Nacional de Córdoba . Capitulo 8º, 1972.
2. Green David. La Mitocondria en la Célula viva (Selecciones de Scientific American), pp.
105 - 113. Ed. Blene, 1970.
3. Racker, Efrain. La Membrana de la Mitocondria en: la célula viva (Selecciones de
Scientific American), pp 150 - 158. Ed. Blene 1970.
TEMA XVIII: Oxidación de los ácidos grasos
Hidrólisis intracelular de los lípidos. Ciclo de oxidación de los ácidos grasos: activación y entrada
de los ácidos grasos a la mitocondria. Primera deshidrogenación. Hidratación. Segunda
deshidrogenación. Clivaje tiolico. Oxidación de los ácidos grasos insaturados. Cuerpos cetónicos
y su oxidación. Oxidación de los ácidos grasos de carbono impar.
-----------------------------------------Aunque los hidratos de carbono, a causa de su abundancia constituyen el combustible principal
para la mayor parte de los organismos, los ácidos grasos desempeñan también un papel muy
destacado como fuente energética. La oxidación de los ácidos grasos es importante en los
animales superiores y en las plantas, que pueden almacenar cantidades grandes de grasa
neutra como combustible de reserva. La grasa neutra posee un valor calorífico elevado ( 9 kcal)
y puede almacenarse en forma casi anhidra en las gotitas de grasa intracelulares, mientras que
el glucógeno o el almidón (valor calórico = 4 kcal) se hallan demasiado hidratados para poder
almacenarse en forma tan concentrada.
Hidrólisis intracelular de los lípidos:
Los ácidos grasos que experimentan oxidación en los tejidos de los animales superiores
provienen del fluido extracelular o bien de los lípidos intracelulares endógenos. La sangre de los
vertebrados contiene cantidades considerables de triacilgliceroles y de fosfoglicéridos, así como
cantidades muy pequeñas de ácidos grasos libres unidos a la proteína seroalbúmina, que actúa
transportando los ácidos grasos. Estos últimos son oxidados en tejidos tales como el corazón y
el músculo.
La fuente endógena principal de ácidos grasos combustibles es grasa de depósito, en roma de
gotitas de grasa del citoplasma, constituido, en su mayor parte por triacilgliceroles. Resumiendo
lo expuesto:
a. fluido extracelular
Ácidos grasos a
oxidarse provienen
de la sangre que contiene
triacilgliceroles, fosfoglicéridos,
ácidos grasos
1. grasa de depósito constituida
por triacilgliceroles.
b. fuente endógena
2. fosfoglicéridos de las
membranas
A. Hidrólisis intracelular:
Los ácidos grasos deben hallarse en forma libre, es decir no esterificados, para que puedan
experimentar el proceso de activación y oxidación. Para ello, deben en primer lugar, hidrolizarse
por la acción de lipasas intracelulares para rendir ácidos grasos libres y glicerina. Se sabe
relativamente poco acerca de la secuencia y detalles de la hidrólisis intracelular de los lípidos.
Sin embargo, en general, no tiene lugar acumulación significativa de ácidos grasos o de otros
productos de hidrólisis que serían tóxicos para la estructura de la membrana. Evidentemente, la
velocidad y la ruta de hidrólisis de los lípidos intracelulares esta ajustada a la velocidad de
utilización de los ácidos grasos.
B. Ciclo de los ácidos grasos:
Activación y penetración de los ácidos grasos en el interior de la mitocondria: existen 3
fases en la entrada de los ácidos grasos procedentes del citoplasma extramitocondrial, en el
interior de la mitocondria.
1. Esterificación enzimática del ácido graso libre con la CoA extramitocondrial, a expensas
del ATP, que tiene lugar en la membrana exterior.
2. Transferencia del grupo acilo graso desde la CoA a la molécula transportadora
carnitina, la cual lo conduce a través de la membrana interior.
3. Transferencia del grupo acilo graso desde la carnitina a la CoA intramitocondrial.
Activación de los ácidos grasos: tres enzimas diferentes catalizan la formación de ésteres
acil-CoA graso; cada una de ellas se especifica para un determinado intervalo de longitud de
cadena de ácido graso.
Acetato-tioquinasa
Activa los ácidos acético, propiónico
y acrílico
Tioquinasa de ácido graso
de cadena media
Activa los ácidos grasos desde
cuatro hasta doce átomos de
carbono
Tioquinasa de ácido graso
de cadena larga
Activa los ácidos grasos de 12 a 22
o más; átomos de carbono
Las últimas dos tioquinasas activan tanto los ácidos grasos saturados como los no saturados.
Las tres se encuentran en la membrana exterior de la mitocondria. Las propiedades y
mecanismos de las tres tioquinasas, son mas o menos idénticos. La reacción global
catalizada por las tioquinasas ligadas al ATP es la siguiente:
O
R
COOH + ATP + CoA
SH
R
CH
SCoA + AMP + PPi
A medida que el enlace tioéster se forna entre el grupo carboxilo del ácido graso y el grupo
tiol de la CoA, el ATP experimenta ruptura pirofosfórica y rinde AMP + PPi . A su vez el PPi
formado resulta hidrolizado por la pirofosfatasa inorgánica.
PPi
+
H2O
2 Pi
El efecto neto de esta hidrólisis es la utilización de dos enlaces fosfato de elevada energía
para impulsar el equilibrio global de la etapa de activación a la formación de acil CoA graso.
Transferencia de carnitina: Los ácidos grasos superiores poseen una capacidad limitada
para atravesar la membrana interior de la mitocondria en forma de ésteres de CoA; pero su
entrada es estimulada por la carnitina. En el proceso actúa una enzima la acil-CoA graso:
carnitin transferasa de ácido graso, que cataliza la transferencia del grupo acilo graso desde
su enlace tioéster con la CoA, a un enlace éster con la carnitina que es un enlace de elevada
energía.
CH3
CH3
+
N
O
CH2
CH
CH3
CH2
COOH
+
R
C
S
CoA
OH
CH3
CH3
+
N
CH2
CH3
CH
CH2
COOH +
CoA
SH
O
C
O
R
El compuesto carnitín-O-acilo graso, así formado, atraviesa con facilidad la membrana
interna de la mitocondria; no se sabe si el paso se realiza por simple difusión o con
intervención de algún mecanismo transportador de la membrana mitocondrial.
Transferencia de la CoA intramitocondrial: En la última etapa del proceso de penetración,
el grupo acilo graso es transferido desde la carnitina a la CoA intramitocondrial por acción de
la carnitín-transferasa de ácido graso intramitocondrial.
acil-graso-carnitina + CoA
acil-graso-CoA + carnitina
SH
Este mecanismo de entrada ejerce el efecto de mantener separada la CoA extramitocondrial
de la intramitocondrial. El acil-graso-CoA se emplea entonces como sustrato para el ciclo de
oxidación del ácido graso, que tiene lugar en el compartimiento interno de la matriz. Las
mitocondrias contienen otro tipo de acil-tioquinasas que participan en la activación del ácido
graso. Esta enzima necesita GTP en lugar de ATP y produce GDP + Pi .
O
GTP + RCOOH + CoASH
R
C
SCoA + GDP + Pi
Puesto que la carnitina no es necesaria para su acción, probablemente esta implicada en la
activación de los ácidos grasos libres formados en el interior de las mitocondrias.
C. Primera etapa de deshidrogenación:
A continuación de la etapa de activación, las reacciones de oxidación del ácido graso tienen
lugar en el compartimiento interior de la mitocondria. El éster formado experimenta la
deshidrogenación enzimática en los átomos de carbono alfa y beta, es decir, en los átomos
de carbono 2 y 3, para formar un acil-graso-CoA no saturado. La posición del doble enlace se
designa mediante el símbolo ∆ 2,3 . Existen cuatro clases diferentes de deshidrogenasas de
acil CoA graso que contienen FAD, cada una de las cuales es específico para un
determinado intervalo de longitud de cadena del ácido graso.
O
2
R
CH2
3
CH2
C
acil-graso CoA
SCoA
+
E
R
FADoxi.
C
H
O
C
C
SCoA
∆ 2,3 trans-enoil CoA + E
FADred.
H
El enlace no saturado ∆ 2,3 formado en esta reacción es el isómero geométrico trans. Los
electrones del FAD red. son cedidos a la cadena respiratoria.
D. Etapa de hidratación: La hidratación reversible del doble enlace de los ésteres ∆ 2,3
enoílicos del CoA para formar beta-hidroxiacil-CoA es catalizada por la enzima enoilhidratasa.
R
CH2
C
H
O
C
C
S
CoA
∆ 2,3 trans-enoil CoA
H
OH
R
CH2
C
O
CH2
C
β−hidroxi-acil-CoA
SCoA
H
E. Segunda etapa de deshidrogenación:
El compuesto obtenido se deshidrogena para formar un 3-oxoacil-graso-CoA, con
intervención de la β -hidroxiacil-graso-CoA-deshidrogenasa siendo el NAD + el aceptor
electrónico especifico.
OH
R
CH2
C
O
CH2
C
SCoA + NAD+
H
O
R
CH2
C
O
CH2
C
+
SCoA + NADH + H
El NADH cede sus electrones a la NADH deshidrogenasa de la cadena respiratoria.
F. Etapa de ruptura tiónica: En la última etapa de la secuencia de la oxidación del ácido
graso, que es catalizada por la tiolasa, el 3 oxoacil-graso-CoA experimenta una escisión por
interacción con una molécula de CoA libre para producir un fragmento de dos carbonos que
contiene el carboxilo terminal en forma de acetil-CoA libre, y el éster del CoA de un ácido
graso cuya cadena se ha acortado en dos átomos de carbono.
O
R
CH2
O
C
CH2
C
SCoA +
CoA
O
O
R
CH2
C
SH
SCoA +
CH3
C
SCoA
La. reacción es muy exergónica, y el equilibrio favorece, por tanto, la ruptura.
Balance de la oxidación: Con la reacción de tiólisis se ha completado una vuelta de la
secuencia de oxidación del ácido graso, en la que una molécula de acetil-CoA, y dos pares
de átomos de hidrógeno resultan eliminados de un acil-CoA graso de cadena larga. La
ecuación global de una vuelta de la secuencia de oxidación del ácido graso actuando sobre
el palmitoil-CoA es la siguiente:
+
CoA + CoA + FAD + NAD + H2O
palmitoil
miristoil
CoA +
miristoil
CoA
+ FADH2 + NADH + H+
Ahora podemos escribir la ecuación para las siete vueltas del espiral necesarias a fin de
convertir una molécula de palmitoil-CoA en 8 moléculas de acetil CoA (el ácido palmítico
tiene 16 átomos de carbono). Cada molécula de FADH2 cede un par de equivalentes
electrónicos a la cadena respiratoria a nivel de la CoA y se generan 2 moléculas de ATP. De
modo análogo, la oxidación de cada molécula de NADH da por resultado la formación de 3
moléculas de ATP. Por lo tanto, se forman un total de 5 moléculas de ATP por molécula de
acetil-CoA escindido. Podemos escribir ahora la ecuación que también comprende las
fosforilaciones:
pamitoíl
(1)
CoA + 7 CoA + 7 O2 + 35 Pi + 35 ADP
8 acetil CoA + 35 ATP + 42 H2O
Las 8 moléculas de acetil CoA formadas en el ciclo del ácido graso pueden incorporarse
ahora al ciclo de Krebs
(2)
8 acetil CoA + 16 O2 + 96 Pi + 96 ADP
8 CoA + 96 ATP + 104 H2O + 16 CO2
Combinando la ecuación (1) y (2) obtenemos la ecuación global:
pamitoíl
CoA + 23 O2 + 131 Pi + 131 ADP
CoA + 16 CO2 + 131 ATP + 146 H2O
Puesto que se necesita una molécula de ATP ( o de GTP) para activar el ácido palmítico libre
al comenzar, podemos suponer que el rendimiento neto de ATP es de 130 moléculas.
Oxidación de los acidos grasos no saturados: Los ácidos grasos no saturados, son
oxidados por las mismas rutas generales que los ácidos saturados; pero se plantean dos
problemas:
1. Los dobles enlaces de los ácidos grasos no saturados existentes en la naturaleza
se hallan en la configuración geométrica cis, mientras que los ésteres ∆ 2,3
insaturados del acil CoA que actúan como intermediarios en la oxidación de los
ácidos grasos saturados, son trans.
2. Los dobles enlaces de la mayor parte de los ácidos grasos no saturados aparecen
en posiciones tales que la eliminación sucesiva de fragmentos de 2 átomos de
carbono rinde un acil-CoA graso ∆ 3,4 en lugar de ∆ 2,3 .
Se ha resuelto este problema con el descubrimiento de una enzima auxiliar, la ∆ 3,4 -cis- ∆ 2,3 trans-enoil CoA-isomerasa que cataliza el desplazamiento del doble enlace desde la
configuración ∆ 3,4 -cis a la ∆ 2,3 -trans que es el sustrato normal de la siguiente enzima de la
secuencia de oxidación del ácido-graso.
Cuerpos cetónicos y su oxidación: En muchos vertebrados el hígado posee la capacidad
enzimática adecuada para desviar algo de acetil-CoA, hacia la formación de acetoacetato y
β -hidroxibutirato, los cuales son transportados por la sangre a los tejidos periféricos, en
donde pueden ser oxidados por el ciclo del ácido tricarboxilico. Estos compuestos reciben el
nombre de cuerpos cetónicos. El acetoacetato proviene de la condensación de dos
moléculas de acetil-CoA catalizado por la tiolasa.
acetil CoA + acetil CoA
acetoacetil CoA + HSCoA
La acetoacetil CoA experimenta la pérdida de la CoA para transformarse en acetoacetato,
proceso conocido como desacilación. La principal ruta para la desacilación es la formación y
escisión enzimática del β -hidroxi- β -metil glutaril CoA.
O
CH3
CH3
CH2
C
CH2
C
SCoA
OH
acetoacetil CoA + acetil CoA
β-hidroxi β-metil glutaril CoA + CoA
El acetoacetato libre así producido se reduce enzimáticamente a Beta-hidroxibutirato, por la
Beta-hidroxibutirato deshidrogenasa ligada al NAD.
acetoacetato + NADH + H+
Beta-hidroxibutirato + NAD+
La mezcla de acetoacetato y Beta hidroxibutirato resultante de esta reacción pueden difundir
después, fuera de la célula hepática, a la corriente sanguínea y llegar a los tejidos periféricos.
Normalmente la concentración de cuerpos cetónicos en la sangre es muy baja, pero causa del.
ayuno o por la diabetes puede alcanzar niveles elevados.
Esto es debido, a que al no existir glucosa utilizable por la célula, ésta se vale de las grasas, las
cuales al degradarse dan como producto acetil CoA en cantidades elevadas.
Oxidación de ácidos grasos de número impar de carbonos: Estos ácidos grasos raramente
se encuentran en la naturaleza. Son oxidados por el ciclo de oxidación del ácido graso. Se
separan sucesivamente restos de acetil CoA hasta que se llega a un resto terminal de tres
átomos de carbono: propionil-CoA. El propionil CoA experimenta una carboxilación enzimática
que lo transforma en metil-malonil CoA que es isomerizado a succinil CoA, que pierde la CoA
para rendir succinato que se incorpora al ciclo del ácido tricarboxílico.
TRABAJO PRACTICO Nº 16
METABOLISMO LIPIDICO
I.
OBJETIVOS:
Al finalizar el trabajo práctico el alumno estará en condiciones de:
a. Reconocer sueros lipémicos y no lipémicos;
b. Esquematizar un lipidograma con las fracciones de transporte de los lípidos;
c. Interpretar los mecanismos principales del metabolismo lipídico;
d. Reconocer cuerpos cetónicos en orina.
II. PARTE EXPERIMENTAL
Se verá esquemáticamente el metabolismo
de las grasas. Para ello el camino más lógico
es seguir el destino de los lípidos ingeridos en la dieta. Casi todos los lípidos de una dieta
normal están en forma de grasas neutras (triacilgliceroles). Los productos animales contienen
también algo de colesterol.
A. DIGESTION Y ABSORCION
En el intestino delgado, los triacilgliceroles son hidrolizados por la liposapancreática. Este
proceso es ayudado por las sales biliares que emulsionan las gotitas de grasa. Solo
cerca de una cuarta parte de los triacilgliceroles son completamente hidrolizados, a
glicerol y ácido graso, estando la mayor parte de los productos finales en forma de
monoacilgliceroles y pequeñas cantidades de diacilgliceroles. La mezcla de grasa
hidrolizada y parcialmente hidrolizada es absorbida con ayuda de las sales biliares. En la
mucosa intestinal los ácidos libres y el glicerol son resintetizados en triacilgliceroles y
combinados con la proteína de transporte, colesterol y fosfoglicéridos para formar
quilomicrones. Estos grandes agregados pasan a la circulación general. En ella, por su
gran tamaño molecular producen la dispersión de la luz y contribuyen a la turbidez del
plasma observando después de una comida rica en grasas. Los ácidos grasos de cadena
corta entran por el sistema portal directamente al hígado. El alumno ingerirá una comida
con hidratos de carbono y otro alumno una comida grasa. A la hora y media se extrae
sangre y se separan los sueros.
en ayunas
con hidratos de carbono
con grasas
Se comparan ambos sueros, con otro le una persona en ayunas.
B. TRANSPORTE
Los lípidos son insolubles, en agua, a pesar de ello los lípidos plasmáticos están en
solución porque están combinados con una proteína que los transporta. La gran molécula
resultante, una lipoproteína es soluble en agua. Todas las lipoproteínas contienen
proteína, colesterol, fosfoglicéridos y triacilglicéridos. Esta "micela" está dispuesta de tal
modo que la proteína y los grupos hidrosolubles se hallan en la parte externa, en
contacto con el plasma acuoso, mientras que los grupos no solubles están en el centro.
Debido a la parte proteica de la molécula, las lipoproteínas pueden separarse por
electroforesis. Se reconocen cuatro bandas:
- alfa-lipoproteína: que contiene principalmente fosfoglicéridos;
- prebeta-lipoproteína: contiene principalmente triacilgliceroles;
- betalipoproteína: contiene principalmente colesterol;
- quilomicrones: contiene principalmente triacilgliceroles.
En el plasma normal tomado en ayunas, las bandas alfa y beta son las únicas visibles.
Las prebetalipoproteína son visibles cuando existe excesiva síntesis endógena de
triacilgliceroles y en personas que tienen una dieta con elevado contenido en hidratos de
carbono. Los quilomicrones aparecen después de una comida rica en grasas. Se
mostrarán lipoproteínogramas pura observar como se transportan las grasas unida a la
proteína.
C. METABOLISMO DEL TEJIDO ADIPOSO
Reservorio de los quilomicrones es el tejido adiposo. La enzima lipoproteinlipasa hidroliza
los triacilgliceroles de los quilomicrones que libera ácidos grasos y son captados por la
célula grasa. Esto reduce el tamaño de la molécula y el plasma se clarifica. ¿De donde
provienen los triacilgliceroles que están depositados en el tejido adiposo?. Los
precursores son:
a). la glucosa
b). los ácidos grasos
prebetalipoproteína.
Glucosa
provenientes
de
la
hidrólisis
Por el ciclo
glicolítico
de
quilomicrones
y
α glicero fosfato
Quilomicrones
Ácidos grasos
Prebetalipoproteína
Triacilgliceroles
Los ácidos grasos libres son transportados por la albúmina. La vida media de los ácidos
grasos es corta por eliminación del plasma por una de las dos vías siguientes:
a). Los ácidos grasos son la fuente principal del organismo en ayunas.
b). El exceso de ácidos grasos puede ser captado por hígado, reesterificado a
triacilglicerol y liberado como triacilglicerol endógeno que forman las
prebetalipoproteínas y son metabolizadas en tejido adiposo.
Cuando una gran cantidad de ácido graso alcanza el hígado, parte de los mismos es
convertida en cuerpo cetónico. Se comprobará químicamente la existencia de cuerpos
cetónicos en la orina.
III. INFORME
Realice un informe de los puntos A, B y C.
IV. BIBLIOGRAFIA
Zilva, J.; “Bioquímica clínica en el diagnóstico y tratamiento”. Cap. XI. 1973
TEMA XIX: Degradación oxidativa de los aminoácidos
Esquema de la oxidación de los aminoácidos. Transaminación y función del piridoxal fosfato.
Desaminación oxidativa. Vías de la acetil CoA y del alfacetoglutorato, del succinato, del
oxalacetato. Formación de los productos de excreción nitrogenada. Ciclo de la urea. Excreción
de amoníaco. Formación de ácido úrico.
-----------------------------------------------Aunque la función primordial de los A.A. es la de ser precursores de las proteínas y de otras
biomoléculas, se emplean con frecuencia como fuente energética. Los animales superiores
oxidan activamente los aminoácidos tanto exógenos corno endógenos. Aún cuando no se haya
ingerido cantidad alguna de proteínas, los seres humanos pueden excretar hasta 5 grs. de N2
cada día, que corresponden a la oxidación neta de casi 30 grs. de proteína endógena. El ciclo de
los ácidos tricarboxílicos es la ruta definitiva para la oxidación de los esqueletos carbonados de
los aminoácidos.
En este capítulo describiremos la degradación oxidativa de los aminoácidos normalmente
presentes como unidades estructurales de las proteínas, lo que constituye la corriente principal
del catabolismo de los aminoácidos. Aunque las reacciones enzimáticas básicas implicadas en el
catabolismo aminoácido son en su mayor parte semejantes en todos los organismos, el ritmo
real de utilización y la proporción de los diferentes aminoácidos empleados en un organismo
determinado dependen de muchos factores que incluyen:
1. La capacidad genética para metabolizar aminoácidos;
2. La asequibilidad de aminoácidos del entorno;
3. La dependencia nutritiva del organismo respecto de los aminoácidos esenciales;
4. La disponibilidad de otros combustibles caloríficos;
5. Las necesidades de aminoácidos del organismo para la síntesis proteica;
6. La necesidad de aminoácidos específicos como precursores de ciertas biomoléculas
importantes, tales como purinas, pirimidinas, componentes de la pared celular, hormonas
y otras moléculas especializadas.
PROTEOLISIS
Antes que las proteínas puedan incorporarse a las rutas catabólicas deben experimentar
hidrólisis completa hasta transformarse en aminoácidos ya que las moléculas proteicas intactas y
la mayoría de los péptidos no pueden atravesar la membrana celular, mientras que los
aminoácidos libres son absorbidos fácilmente. Los péptidos extracelulares y las proteínas con
frecuencia son hidrolizados por acción de enzimas segregadas al entorno, por ejemplo muchos
microorganismos forman y segregan peptidasas y enzimas proteolíticas. Sin embargo, la
proteólisis extracelular ha sido estudiada con máximo detalle en el tracto digestivo de los
vertebrados (ver proceso en página 460 de Lehninger). Por acción combinada de las enzimas
proteolíticas segregadas por el estómago, el páncreas y el intestino delgado, las proteínas
ingeridas se hidrolizan por completo hasta aminoácidos, los cuales son absorbidos por las
células epiteliales del intestino delgado, mediante un transporte activo que requiere energía. Los
aminoácidos son enviados luego a los tejidos por medio de la sangre. Al entrar en las células
individuales también por transporte activo, se incorporan a los canales metabólicos. Se sabe
muy poco de la proteólisis intracelular, que en algunos tejidos como el hígado, tiene lugar a un
ritmo elevado.
ESQUEMA DE LA OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS
Para la oxidación de los 20 aminoácidos diferentes existen 20 secuencias multienzimáticas
distintas. En último término todas convergen en unas pocas rutas terminales que conducen al
ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Los esqueletos hidrocarbonados de 10 de los A.A. son
convertidos finalmente en acetil-CoA, ya sea por la vía del piruvato o por la del acetoacil-CoA,
cinco se convierten en α oxoglutorato, tres en succinil-CoA y dos en oxalacetato. La fenilalanina
y la tirosina se degradan de modo que una porción del esqueleto hidrocarbonado se incorpora
como acetil-CoA y lo otra como fumarato. Sin embargo no todos los átomos de C de los 20 A.A.
se incorporan al ciclo del ácido tricarboxílico ya que algunos se pierden por el camino de la
descarboxilación. Las rutas del catabolismo no son necesariamente idénticas a las de la
biosíntesis, pero hay algunas etapas que son comunes.
Alanina
Cisteína
Glicocola
Serina
Treonina
Glutamato
Piruvato
α Oxoglutarato
Isocitrato
Isoleucina
Leucina
Triptófano
Arginina
Histidina
Glutamina
Prolina
Succinil-CoA
Citrato
Isoleucina
Metionina
Valina
Succinato
Acetil-CoA
Oxalacetato
Tirosina
Fumarato
Acetoacetil-CoA
Fenilalamina
Malato
Fenilalanina
Tirosina
Leucina
Lisina
Triptófano
Aspartato
Asparagina
Los grupos α -amino de los aminoácidos comparten un destino común, al menos en los
vertebrados, los cuales excretan el N2 amínico en forma de Urea, Amoníaco o de Ácido Úrico,
según la especie. Los mecanismos por los cuales los grupos − NH2 son eliminados de los A.A. y
luego convertidos en cualquiera de los tres productos de excreción, son completamente
semejantes. Puesto que la eliminación de los grupos − NH2 constituye la primera etapa en la
degradación de los A.A., examinaremos ahora los dos procesos principales implicados en esta
reacción, ellos son la Transaminación y la Desaminación Oxidativa.
TRANSAMINACION: Por este proceso el grupo amino de por lo menos 11 aminoácidos es
separado enzimáticamente por transaminación y transferido al carbono α de uno o tres α
oxoácidos (piruvato; α -oxoglutarato o al oxalacetato). Por lo tanto el aminoácido al perder su
grupo NH2 se transforma en el oxoácido correspondiente y el α -oxoácido que acepta el grupo
NH2 se transforma en el aminoácido correspondiente. Dos transaminasas importantes son: la
ALANIN-TRANSAMINASA; que cataliza la reacción:
α − oxoácido + alanina
α − a min oácido + ácido pirúvico
y la GLUTANATO-TRANSAMINASA, que cataliza la reacción
α − oxoácido + ácido glutámico
α − a min oácido + ácido α − oxoglutári co
Ejemplo de transaminación:
O
R'
H
C
NH2
+
R2
C
O
COOH
COOH
R1
C
NH2
COOH +
R2
C
COOH
H
Cualquiera sea la ruta de transaminación, el α -oxoglutarato es el aceptor final de los grupos
NH 2 de la mayor parte de los A.A. y luego transporta esos grupos NH 2 hasta una secuencia
final de reacciones mediante las cuales se forman los productos nitrogenados finales o de
excreción. Por ejemplo en la reacción anterior la alanin-transaminasa cataliza la formación de
alanina a partir de un α aminoácido más ácido pirúvico, luego esa alanina le transfiere el grupo
NH 2 al α oxoglutarato por acción de la alanin-glutamato-transaminasa.
Alanina + ácido α − oxoglutári co
ácido pirúvico + ácido glutámico
(aceptor final)
Las transaminasas se encuentran tanto en el citoplasma como en la mitocondria de las células
eucarióticas; las formas mitocondriales y las extramitocondriales difieren en sus propiedades
físico-químicas. Todas las transaminasas emplean una misma coenzima y comparten un
mecanismo de reacción común. La coenzima es el fosfato de piridoxal, un derivado de la
vitamina B 6 , necesario como factor de crecimiento y esencial en la dieta de muchos
microorganismos y animales.
H
C
HO
CH2
O
C
C
H3C
O
C
C
O
CH
N
Fosfato de piridoxal
P
OH
El fosfato de piridoxal es también el grupo
prostético de cierto número de otras enzimas
que catalizan reacciones en las que
OH intervienen α -aminoácidos. En principio el
fosfato de piridoxal actúa como un
transportador de grupos O, en algunos casos
de aminoácidos. La clave de acción es su
grupo aldehído que puede formar una base de
Shiff o cetimina, con amoníaco o con diversas
aminas.
Durante su ciclo catalítico en las transaminasas, la coenzima experimenta reacciones reversibles
entre la forma de aldehído libre (fosfato de piridoxal) y su forma aminada (el fosfato de
piridoxamina). Se produce el ciclo en dos etapas:
El complejo enzima-fosfato de piridoxal, acepta un grupo amino del dador de grupos − NH 2 con
formación de un complejo enzima-fosfato de piridoxamina; ello ocurre mediante dos bases de
Shiff intermedias.
El complejo enzima-fosfato de piridoxamina forma una base de con el aceptor entrante del grupo
NH 2 , el α -oxoácido, al que se cede a continuación el grupo NH 2 .
NH2
R1
CH
H
O
COOH +
E
C
H2O +
H
R1
H
C
Dador de NH2
N
C
E
COOH
Base de Shiff I
O
R1
C
N
CH2
R1
E
COOH + E
C
NH2
enzima-fosfato de
piridoxamina
α − oxoácido
COOH
CH2
Base de Shiff II
O
E
CH2
NH2 + R2
C
R2
COOH
α oxoácido
aceptor de NH2
C
N
CH2
E
COOH
Base de Shiff III
H
R2
C
N
C
NH2
O
H
E
COOH
E
C
H + R2
enzima-fosfato
de piridoxal
CH
COOH
α aminoácido
Base de Shiff IV
DESAMINACION OXIDATIVA
Este proceso ocurre en la mitocondria y los grupos NH 2 recogidos de los diferentes aminoácidos
por la acción de las transaminasas, aparecen en el último término en forma de grupos α -aminos
del L-glutamato. En algunas células, particularmente en las bacterias, el glutamato experimenta
una desaminación oxidativa rápida, catalizada por la glutamato-deshidrogenasa ligada a la
piridina.
L-glutamato + NAD+
oxoglutarato + NH+4 + NADH + H+
Descarga así en forma de iones NH +4 , los grupos aminos recogidos de los demás aminoácidos.
La L-glutamato deshidrogenasa puede usar también el NADP + como aceptor de electrones, el
NADPH así formado, actúa como reductor en las reacciones biosintéticas. La mayor parte de los
organismos tienden a reutilizar el NH +4 formado en el catabolismo de los A.A. recuperándolo.
α − cetoglutarato + NH+4 + NADH + H+
glutamato + NAD +
Glutamato deshidrogenasa
RUTAS QUE CONDUCEN AL ACETIL-CoA
Treonina
Cistina
Cisteina
Glicocola
Serina
Alanina
Ácido Pirúvico
Acetil-CoA
El esquema muestra los portales de entrada por los que penetran en el ciclo de los ácidos
carboxílicos, los esqueletos carbonados de los diferentes aminoácidos. Las rutas de los 20 A.A.
dependen del punto de entrada. El punto principal de entrada en el ciclo es por la vía del acetilCoA, diez aminoácidos penetran por esta ruta, cinco de ellos se degradan al acetil-CoA por la vía
del piruvato y los restantes por la del acetoacetil-CoA.
NH2
CH3
CH
CH
COOH
OH
Treonina
Glicocola
H2N
CH
CH2
O
CH3
COOH
C
H
Serinhidroximetil
tranferasa
OH
acetaldehído
NAD+
NH2
ATP
Serina
CH2
CH
OH
COOH
CoA
Serina
deshidrasa
O
Ácido Pirúvico
CH3
C
NADH + H+
COOH
AMP; Pi
Piruvato
deshidrogenasa
O
CH3
C
S CoA
Acetil CoA
VIA DEL PIRUVATO
Los cinco aminoácidos que pentran por la vía del piruvato son la alanina, la cisteína, la glicocola,
la serina y la treonina (ejemplo anterior). La alanina rinde directamente piruvato por
transaminación con el α -oxoglutarato. En el ejemplo pueden ver como se degradan hasta
piruvato, la treonina, la glicocola y serina.
RUTA DEL α-OXOGLUTARATO
Los esqueletos carbonados de cinco aminoácidos (arginina, histidina, ácido glutámico, glutamina
y prolina) entran en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos por la vía de α -cetoglutarato, cuyo
precursor inmediato es el ácido glutámico.
Arginina
Prolina
Semialdehído
glutámico
Glutamina
Histidina
Ácido Glutámico
α − cetoglutar ato
El esquema muestra las rutas que conducen hasta el α -cetoglutarato de los distintos A.A. para
poder entrar al ciclo de Krebs.
RUTA DEL SUCCINATO
Los esqueletos carbonados de la metionina, la isoleucina y la valina, se degradan
definitivamente, por la vía del propionil-CoA y del metilmalonil-CoA, a succinil-CoA que
experimenta una desacilación para dar succinato, intermediario del ciclo de Krebs.
METIONINA
Ácido α−oxobutírico
Isoileucina
Propionil-CoA
Valina
Metilmalonil-CoA
Succil-CoA
RUTA DEL OXALACETATO
La asparagina y ácido aspártico se incorporan finalmente al ciclo de Krebs en forma de
oxalacetato. La asparagina en primer lugar se hidroliza a ácido aspártico y amoníaco por la
acción de la asparaginasa.
Asparagina + H2O
ácido-aspartico +
NH3
El aspartato así formado, experimenta transaminación con el ácido α -oxoglutarato para formar
ácido oxalacético.
Ácido aspartico + ácido α − oxoglutarato
ácido oxalacético + ácido glutámico
De esta manera los cuatro átomos de carbono de estos aminoácidos pueden incorporarse al
ciclo de Krebs. En las plantas y en algunos microorganismos el ácido aspártico experimenta una
eliminación directa de NH3 para dar fumarato, catalizada por la enzima aspartasa, que no se
encuentra presente en los tejidos animales.
Ácido aspartico
Ácido fumárico + NH3
FORMACION DE PRODUCTOS DE EXCRECION NITROGENADOS
La mayoría de los vertebrados excretan definitivamente cierta fracción del amoníaco formado en
una de estas tres formas: urea, amoníaco, o ácido úrico. El N 2 amínico es excretado por la
mayor parte de los vertebrados terrestres en forma de urea. Son organismos designados como
ureotélicos. Muchos animales acuáticos, tales como los peces teleósteos, excretan nitrógeno
amínico en forma de NH3 y se les denomina amonotélicos.
Los pájaros y los reptiles terrestres, cuyo consumo de agua es limitado, excretan el N 2 amínico
en forma de ácido úrico (en forma semisólida) y a estos organismos se los llama uricotélicos. Los
anfibios ocupan una posición intermedia. El renacuajo, cuyos hábitos son acuáticos, excreta
amoníaco, después de la metamorfosis, durante la cual el hígado adquiere las enzimas
necesarias, la rana adulta excreta urea.
CICLO DE LA UREA
La formación de urea tiene lugar casi por completo en el hígado de los organismos ureotélicos,
es catalizada por un mecanismo cíclico denominado ciclo de la urea. Penetran en este ciclo dos
grupos aminos que proceden inicialmente de los α -aminoácidos por desaminación, junto con
una molécula de CO 2 y forman arginina a partir de la ornitina, diaminoácido homólogo de la
lisina. Esta parte del ciclo de la urea tiene lugar en casi todos los organismos capaces de realizar
la biosíntesis de la arginina pero solamente los animales ureotélicos poseen grandes cantidades
de enzima arginasa, que cataliza la hidrólisis irreversible de la arginina para formar urea
regenerando ornitina. La urea molécula neutra soluble en H 2 O se excreta con la orina.
- NH2
Grupos
-amino
α − oxoglutarato
ácido
aspártico
arginasa
ácido
glutámico
- NH2
arginina
- NH2
H2N
citrulina
NH2
O
carbomilfosfato
C
C
ornitina
NH2
O
El primer grupo NH 2 que entra al ciclo surge en forma de NH3 libre como consecuencia de la
desaminación oxidativa ligada al NAD + del glutamato en las mitocondrias.
Ácido glutámico + NAD+
ácido α−oxoglutárico + NH3 + NADH + H+
Entonces el NH3 libre es utilizado junto con el CO 2 para formar fosfato de carbamilo en una
reacción compleja, catalizada por la carbamil-fosfato sintetasa.
O
CO2 + NH3 + 2 ATP + H2O
H2N
C
O
O
-
P
O
Fosfato de carbamilo
O
-
+ ADP + Pi
Se necesitan dos moléculas de ATP para formar cada molécula de fosfato de carbamilo que
interviene en esta reacción, la cual es irreversible. El fosfato de carbamilo es un compuesto rico
en energía. El fosfato de carbamilo originado en esta reacción, cede a continuación, su grupo
carbamilo a la ornitina para formar citrulina y fosfato; la reacción es catalizada por la ornitintranscarbamilasa. El segundo grupo − NH 2 penetra después en el ciclo de la urea, al que llega
en forma de aspartato que a su vez lo adquirió del glutamato por acción de la aspartatoglutamato-transaminasa.
Ácido α−oxoglutárico + ácido aspártico
Ácido glutámico + ácido oxalacético
A continuación el grupo NH 2 del aspartato se condensa con el átomo de carbono carbonílico de
la citrulina en presencia de ATP para formar argininosuccinato, reacción catalizada por la
arginosuccinato sintetasa. El arginosuccinato es escindido en forma irreversible por acción de la
arginin-succinasa, con formación de arginina y fumarato libre. Hasta este punto la secuencia de
la reacción es empleada por la mayoría de las células en la biosíntesis de la arginasa. Los
animales ureotélicos sin embargo poseen arginasa, la cual desdobla, la arginina en urea y
ornitina que vuelve al ciclo. La ecuación global del ciclo de la urea es:
Urea + 2 ADP + 2 Pi + AMP + PPi
2 NH3 + CO2 + 2 ATP + H2O
EXCRECION DE AMONIACO:
Se cree que en los organismos amonotélicos los grupos − NH 2 derivados a diversos α aminoácidos, se transaminan para formar glutamato, que experimenta después una
desaminación oxidativa mediante la glutamato-deshidrogenasa. El NH3 así formado se convierte
después en N 2 amídico de la glutamina, que es la forma de transporte del NH3 en la mayor
parte de organismos. La glutamina se forma por acción de la glutamina-sintetasa a partir de
ácido glutámico.
NH2
HOOC
CH2 CH2 CH
O
Mg++
COOH + NH3 + ATP
Acido Glutámico
H2N
C
NH2
CH2 CH2 CH
COOH + ADP + Pi
Glutamina
La glutamina rinde NH3 libre en los túbulos renales de la mayoría de los vertebrados, pero esta
reacción predomina en los organismos amonotélicos La reacción es:
Glutamina + H2O
Glutamato + NH4+
El NH +4 así formado pasa directamente a la orina. Dado que la glutamina no es tóxica constituye
un medio de transporte eficaz del NH3 .
FORMACION DE ACIDO ÚRICO:
En los organismos uricotélicos, el ácido úrico es la forma principal de excreción de los grupos
− NH 2 de los α -aminoácidos. Es también el producto principal de excreción del metabolismo
purínico en los primates, los pájaros y los reptiles terrestres. La ruta de formación de ácido úrico
es compleja, puesto que en primer lugar debe formarse el anillo purínico a partir de precursores
sencillos.
OH
N
C
Amino ácidos
− NH2
N
C
C
C
N
O2
C
N
C
C
C
N
C
C
N
H
HO
N
N
H
Anillo de Purina
Xantina
H
O
N
C
H
N
C
C
C
C
O
N
N
H
H
Acido Urico
(forma oxo)
O
H
Xantin
oxidasa
TRABAJO PRACTICO Nº 17
METABOLISMO NITROGENADO
I.
OBJETIVOS
1). Reconocer la influencia de la composición de la dieta sobre la concentración en plasma y
eliminación urinaria de algunos compuestos que son productos finales del catabolismo
nitrogenado en el organismo humano.
II. INTRODUCCION
En este trabajo práctico se requiere colaboración de tres alumnos en cada grupo de trabajo.
Los resultados de la experiencia y las enseñanzas que todos los alumnos reciban de la
misma, dependen de la seriedad y responsabilidad puestas en el cumplimiento de las
instrucciones. Por ello se ruega a quienes participan en la prueba, observar estrictamente las
indicaciones que se dan a continuación. Cada uno de los voluntarios comenzará con la dieta
que se le asigne cuatro días antes de la fecha en la cual su comisión realiza el trabajo y la
mantendrá hasta el día del práctico. Durante las 24 hs. anteriores al T.P. recogerá la orina de
todas sus micciones y la irá acumulando en un recipiente perfectamente conservado en
refrigerador. Al concurrir al laboratorio colocará en un recipiente perfectamente limpio unos
150 a 200 ml. de orina que representa una muestra del total de orina emitida durante ese
lapso. La interpretación de los resultados exige conocimientos de ciertas vías del
metabolismo nitrogenado: formación de úrea, biosíntesis de creatina, metabolismo del
triptófano y catabolismo de bases púricas. Además, es conveniente repasar conceptos
generales de nutrición y de composición de alimentos. Por ello se aconseja el estudio previo
de esos temas para un aprovechamiento racional de la experiencia.-
DIETA NORMO - PROTEICA
Cal
H.de C.
52%
1472
368 grs.
Prot.
15%
436
109 grs.
Gr.
33%
909
1011 grs.
2800
ALIMENTO
C.N.
H. DE C.
PR.
GR.
Leche
300
15
9
9
Queso
50
--
10
10
Huevo
1 unidad
--
6
6
Carne
250
--
50
12
A
200
9
2
--
B
200
20
2
--
Vegetales C
200
40
4
--
Frutas
400
60
4
--
Pan
250
150
22
--
Dulce
30
24
--
--
Azucar
50
50
--
--
Manteca
30
--
--
24
Aceite
40
--
--
40
109
101
368
Puede reemplazarse por 150 grs. de cereales o harina, en cocido.
Desayuno:
150 grs. de leche o té, café o mate
15 grs. de azúcar
50 grs. de pan o galletitas
15 grs. de manteca
15 grs. de dulce
A media mañana :
1 fruta
Almuerzo y cena:
1 porción de carne : 150 grs. (vacuno, ave o pescado). A la plancha, a la parrilla
o al horno
1 porción de verduras (300 grs.). En ensalada, hervidas, al horno, en tortilla,
etc.
1 huevo (en la cena) duro, cocido blando o en preparaciones.
1 cucharada de aceite (20 grs.)
50 grs. de pan
1 fruta
Té o café
Merienda :
Té o café o 1 gaseosa
1 sandwich (100 grs. de pan, 50 grs. de queso, 30 grs. de manteca)
DIETA - HIPOPROTEICA
H.de C.
2700
Cal.
Prot.
Gr.
ALIMENTO
Leche
Queso semiduro
Huevo
1612
59%
C.N.
403 grs.
7%
202 cal.
48 grs.
34%
891 cal.
99 grs.
H. DE C.
PR.
GR.
300
15
9
9
50
--
25
24
--
6
6
1 unidad
Carnes rojas
400
--
80
20
A
200
9
2
--
B
200
20
2
--
Vegetales C
200
40
4
--
Frutas
400
60
4
--
Legumbres
50
30
10
Pan Negro
250
150
22
--
Azúcar
50
50
--
40
Aceite
40
--
--
--
250
--
--
24
50
--
--
40
374
164
99
Caldo de Carne
Extracto de carne
Debe usar siempre carnes rojas, evitando las blancas (pollo o pescado). Una de las
porciones del día debe estar constituida por viseras (hígado, riñón, etc.). Preferir vegetales
de hoja. Utilizar frutas desecadas.
Desayuno:
150 grs. de leche con té, café o mate.
15 grs. de azúcar
50 grs. de pan negro o galletitas integrales
1 porción de queso (50 grs.)
A media mañana:
1 huevo duro o pasado por agua almuerzo cena:
Almuerzo y cena:
1 plato de sopa preparado con caldo y legumbres enteras o sus harinas (ej.
arvejas secas, partidas; harina de lentejas o arvejas). Condimentar con
extracto de carne o tomates y queso rallado.
200 grs. de carne (de vaca o viseras) a la plancha, horno, parrilla.
300 grs. de verduras, especialmente de hojas.
1 porción de compota de frutas secas.
50 grs. de pan negro
Té o café.
Merienda:
Té o café o 1 gaseosa
Sándwich (100 grs. de pan negro – 50 grs. de queso)
ALIMENTO
C.N.
H. DE C.
PR.
GR.
Leche
300
15
9
9
Huevo
1 unidad
--
6
6
A
300
9
3
--
B
300
30
3
--
Vegetales C
200
40
4
--
Frutas
500
75
5
--
Pan
200
120
18
--
Azúcar
50
50
--
--
Dulce
80
64
--
--
Aceite
50
--
60
Manteca
30
--
---
403
48
99
Puede reemplazar por 2 fetas gruesitas de jamón crudo o cocido.
Puede reemplazar por 150 grs. de cereales o harinas en cocido
Desayuno:
150 grs. de leche, con té, café o mate.
15 grs. de azúcar
50 grs. de pan
15 grs. manteca - 15 grs. de dulce
A media mañana:
1 fruta
24
Almuerzo y cena:
400 grs. de verduras (ensaladas hervidas, con aceite y sal, al horno, al vapor,
fritas, etc.) o 1 porción de cereal o pasta.
1/2 huevo (duro, cocido blando, en preparaciones)
1/2 cucharada de aceite
50 grs. de pan
1 fruta o 1 porción de dulce de batata o membrillo
Té o café
Merienda:
Té, café o gaseosa
Galletitas dulces (53 grs.)
DIETA HIPER – PROTEICA
H.de C. :
49%
1496 cal.
374 grs.
Prot. :
22%
656 cal.
164 grs.
Gr. :
29%
891 cal.
99 grs.
V.C.T.
3000
Cal.
III. PARTE EXPERIMENTAL
•
Determinación de un ácido úrico:
Fundamento
El suero se desproteiniza con ácido túngstico preformado. El ácido úrico presente en el
aproteinizado reacciona con el reactivo fosfolitio túngstico en medio alcalino de carbonato de
sodio. El color del azul de tungsteno producido es proporcional a la concentración de ácido
úrico y se mide colorimétricamente a 710 mm.
Técnica en suero:
1). Desproteinización: En un tubo de centrífuga colocar 8 ml de agua destilada, 1 ml de
ácido túngstico y 1 ml de suero. Agitar vigorosamente esperar 5 minutos y centrifugar.
2). En tres tubos marcados B (blanco), T (testigo) y D (desconocido) colocar:
B
T
D
Desproteinizado
--
--
5 ml.
Agua destilada
5 ml.
5 ml.
--
0.05 ml.
--
Testigo
--
Reactivo 1
1 ml.
1 ml.
1 ml.
Reactivo 2
1 ml.
1 ml.
1 ml.
Mezclar por inversión y colocar en bario de agua entre 22º C y 28º C. Leer entre 30 y 45
minutos después en fotocolorímetro con filtro rojo o en espectrofotómetro a 710 mm.
Cálculos:
ácido úrico mg / 1 = D × f
Técnica en orina:
Se recoge orina de 24 horas y se diluye a 2 litros con agua. Efectuar la técnica de la misma
manera que en suero, reemplazando por 100 ml de dilución y completando a 5 ml con agua
destilada. Cálculos:
ácido úrico mg / 24 hs =
•
D
× 1000
T
Determinación de urea:
Fundamento:
La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y
amoníaco, este reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de
indofenol que se determina colorimétricamente a 540 mm.
Técnica en sangre:
En tres tubos marcados B (blanco), D (desconocido) y T (testigo); colocar una o dos gotas de
agua y agregar.
B
T
D
Testigo
--
20 ml.
--
Suero o Plasma
--
--
20 ml.
1 gota
1 gota
1 gota
Ureasa
Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37º C.
Reactivo Nº 1
1 ml.
1 ml.
1 ml.
Reactivo Nº 2
1 ml.
1 ml.
1 ml.
Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37º C.
Agua destilada
10 ml.
10 ml.
Mezclar por inversión y leer. Calculo:
urea gr / 1 = D ⋅
0.60
gr / 1
T
10 ml.
Técnica en orina:
Se sigue la misma técnica que para sangre, utilizando orina diluida cc agua o solución
fisiológica. Es conveniente diluir según el siguiente esquema.
Densidad hasta 1015 …….....……………………Diluír 1/10
Densidad de 1016 a 1025 ……………………… Diluír 1/20
Densidad mayor de 1025 ……………………… Diluír 1/40
Como la orina contiene cantidades variables de amoniaco. Debe efectuarse un blanco de
orina. Se hace igual que el blanco de reactivos dado anteriormente con la diferencia que
después de agregado el reactivo 1 y antes del reactivo 2 se agrega 20 ml de la dilución de
orina. Llevar el aparato en BR y leer T, blanco de orina y D. Cálculos:
urea gr / 1 =
•
(D − B de orina)
× dilución
S
Determinación de creatinina
Fundamento:
Se basa en la reacción de la creatinina con el picrato, alcalino, previa desproteinización con
el ácido pícrico. El cromógeno (picrato de creatinina) obtenido se lee a 510 mm.
Técnica en sangre:
a). Desproteinización: A 5 ml. de suero agregar 7,5 ml. de reactivo. Mezclar por inversión.
Dejar reposar 10 minutos y centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos como mínimo.
b). En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (blanco) T (testigo) y D (desconocido)
colocar:
B
T
D
Sobrenadante
--
--
6.0 ml.
Testigo
--
1.0 ml.
--
Agua
2.5 ml.
1.5 ml.
--
Reactivo 1
3.5 ml.
3.5 ml.
--
Reactivo 2
1.0 ml.
1.0 ml.
1.0 ml.
Mezclar por inversión, luego de 20 minutos leer en espectrofotómetro a 5/0 mm. Cálculos:
creatinina mg / 1 =
D
× 20
T
Técnica de orina:
Se recoge orina de 24 horas y se diluye a 2 litros con agua. En tres tubos marcados B
(blanco), T (testigo) y D (desconocido).
B
T
D
Orina diluída
--
--
20 ml.
Testigo
--
1.0 ml.
Agua
2.5 ml.
1.5 ml.
2.5 ml.
Reactivo 1
3.5 ml.
3.5 ml.
3.5 ml.
Reactivo 2
1.0 ml.
1.0 ml.
1.0 ml.
--
Calculos:
g / 24 hs. =
D
×2
T
Reactivos:
- Ureasa: solución estabilizado y tamponada de ureasa de alta proteína.
- Reactivo para urea: solución de 532 mmol/1 de fenol, 0.83 mmol/1 de nitro ferricianuro de
sodio y 0,3 mmol/1 de etilenebis-ditrocarbonato manganeso.
- Reactivo 2 para urea: solución de urea estabilizada equivale a 36.6 mmol/1 de hipoclorito
de sodio 0,625 mol/1 estabilizado.
- Testigo de urea: solución de urea estabilizada equivale a 0,60 g/1.
- Acido túngstico: desproteinizante concentrado y estabilizado de orina
- Reactivo 1 para ácido úrico: solución 1,84 mmol/1 de carbonato de sodio. Mezclar
siempre por inversión antes de usar.
- Reactivo 2 para ácido úrico: reactivo fosfo-litio-túngstico preparado con ácido fosfórico y
tungstato de sodio en relación molar 4:1. Contiene 291 mmol/1 sulfato de litio.
- Testigo de ácido úrico: solución estabilizada de ácido úrico.
- Reactivo 1 de creatinina: ácido pícrico 41,4 mmol. Estable indefinidamente a temperatura
ambiente.
- Reactivo 2 para creatinina: buffer glicina/NaOH 1 mol para pH final 12.4 estable
indefinidamente a temperatura ambiente.
- Testigo: solución de creatinina de 20 mg/1.
IV. INFORME
a). Comentar la influencia de la dieta en cada uno de los metabolitos estudiados.
b). Realizar un esquema de la formación de urea, creatinina y ácido
úrico
TEMA XX: BIOSINTESIS DE CARBOHIDRATOS
Principales vías de la síntesis de carbohidratos. Formación de fosfoenol-piruvato a partir de
piruvato. Conversión de fosfoenol-piruvato a glucosa. Gluconeogénesis a partir de los
intermediarios del ciclo de Krebs, de la acetil CoA y de los aminoácidos.
-------------------------------------------Hemos visto que la transformación de la glucosa en piruvato es la senda principal del
metabolismo de los carbohidratos en le mayoría de las células, tanto en condiciones aerobias
como anaerobias.
El proceso inverso, la conversión del piruvato en glucosa es el camino más importante.
Convergen sobre esta senda central biosintética otras dos sendas las cuales provienen de dos
precursores diferentes que no son carbohidratos. Una de ellas está dada por productos
intermedios del ciclo de Krebs, que se transforman en piruvato. Este proceso se denomina
gluconeogénesis. El otro camino está dado por las reacciones que provocan la reducción del
CO 2 para formar glucosa (es en las células fotosintéticas).
1.- Formación de fosfoenol-piruvato: la conversión del piruvato en fosfoenol-piruvato no
puede realizarse en presencia de la piruvato-quinasa ya que el ∆Gº = +75 kcal . La
fosforilación del piruvato se consigue tanto en el citoplasma como en la mitocondria mediante
una secuencia reaccional de rodeo que necesita de la intervención de varias enzimas. La
primera reacción es la catalizada por la piruvato-carboxilasa (de la mitocondria).
H2O
Acetil CoA + oxalacetato + ADP + Pi
piruvato + CO2 + ATP
∆Gº = −0.5 kcal
La enzima piruvato carboxilasa que se encuentra en la mitocondria necesita de le acción de
la acetil CoA para actuar.
2.- El oxelacetato es reducido a malato por el NADH 2
NADH+ + malato
NADH2 + oxalacetato
∆Gº = −6.7 kcal
3.- El malato formado difunde al citoplasma donde es reoxidado por la forma citoplasmática de la
malato-deshidrogenasa ligada al NAD + para formar oxalacetato extramitocondrial.
malato + NAD+
oxalacetato + NADH2
∆Gº = +6.7 kcal
Esta reacción es muy endergónica, se desplaza hacia la derecha porque los productos
finales se eliminan rápidamente.
4.- El oxalacetato se transforma en fosfoenol-piruvato por la acción de los fosfoenol-piruvatocarboxiquinasa. En esta reacción el donador de fósforo es el GTP (o el ITP).
Mg++
oxalacetato + GTP
fosfoenol-piruvato + CO2 + GDP
∆Gº = + 0.7 kcal
Sumando todas las reacciones, escribimos la ecuación global, teniendo en cuenta la suma
algebraica de los ∆Gº .
fosfoenol-piruvato + ADP + GDP + Pi
piruvato + ATP + GTP
∆Gº = +0.2 kcal
Esta reacción global es reversible, puesto que su variación de energía libre estándar es muy
pequeña. Tenderá a desplazarse a la derecha siempre que el cociente (ATP) / (ADP) tenga un
valor elevado y que haya presente un exceso de piruvato. Para fosforilar una molécula de
piruvato se consumen dos enlaces de alto valor energético. Practicando le dirección energética
de la ecuación, se observa que el proceso endergónico que requiere energía es:
piruvato + GTP
fosfoenol-piruvato + GDP
∆Gº = + 7.5 kcal
Mientras que el proceso que cede energía es:
ADP + Pi
ATP + H2O
∆Gº = − 7.3 kcal
Conversión en glucosa del fosfoenol-piruvato: el fosfoenol-piruvato se convierte fácilmente
en fructuosa 1-6 difosfato por inversión de las reacciones de la glicólisis que comienzan con la
enolasa y terminan en la aldolasa.
enolasa
fosfoenol-piruvato + H2O
2-fosfoglicerato
(1)
3-fosfoglicerato
2-fosfoglicerato
(2)
ATP + 3-fosfoglicerato
ADP + 1,3-difosfoglicerato
(3)
1-3 difosfo-glicerato + NADH2
gliceraldehido-3-fosfato + NAD+ + Pi
(4)
gliceraldehído-3-P
dihidroxiacetona-P
gliceraldehído-3-P + dihidroxiacetona-P
(5)
fructosa-1-6-di P
(1) fosfoglicerometasa - (2) - fosfoglicerato-quinasa - (3) - gliceraldehído-3 Pdeshidrogenasa - (4) - triosa-fosfato-isomerasa (5) - aldolasa
La reacción siguiente no se realiza en dirección a le síntesis catalizada por le fosfofructoquinasa.
Esta reacción es catalizada por le fructosadifosfatasa.
fructosa-1-6-difosfato + H2O
fructosa-6-P + Pi
∆Gº = − 0.4 kcal
En la etapa siguiente en camino hacia la glucosa la fructosa 6P se convierte de modo reversible
en glucosa 6P por la acción de la fosfohexoisomerasa o fosfoglucoisomerasa.
fructosa 6-P
glucosa 6-P
En la mayoría de las células la glucosa-6-P formada durante la gluconeogénesis se emplea
como precursor en la producción de polímeros de reservas como glucógeno, almidón, de otros
monosacáridos de la glucosa, de disacáridos y polímeros estructurales. Sin embargo en
determinadas células como en el hígado, riñón, epitelio intestinal de los vertebrados, la glucosa6-P puede desfosforilarse y libera glucosa. El hígado constituye la fuente más importante de la
glucosa sanguínea. La escisión de la glucosa-6-P; no puede tener efecto por inversión de la
reacción de la hexoquinasa, a causa del gran cambio de energía libre estándar positiva que hay
en la dirección de formación de la glucosa libre.
glucosa-6-P + ADP
glucosa + ATP
∆Gº = + 4.0 kcal
Sin embargo la producción de glucosa libre es inducida por la glucosa -6-fosfatasa, que cataliza
la siguiente reacción exergónica de hidrólisis.
glucosa-6-P + H2O
glucosa + Pi
∆Gº = − 3.3 kcal
Esta enzima se encuentra de modo característico en el hígado y riñón de los vertebrados. Su
actividad es dependiente de los lípidos y de la estructura de la membrana. La glucosa-6fosfatasa no se encuentra en los músculos, ni en el cerebro, por lo que estos órganos no poseen
la capacidad de donar glucosa libre.
Resumiendo:
2 piruvato + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH2 + 6 H2O
glucosa + 2 NAD+ + 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi
Por cada molécula de glucosa que se forme se consumen seis enlaces fosfato de alto valor
energético y se requiere dos moléculas de NADH2 como reductor.
La reacción global es exergónica.
glucógeno
UDP-glucosa
UTP
glucosa-1-P
glucosa-6-P
disacáridos
fructosa-6-P
glucosa libre
monosacáridos
ATP
Pi
Pi
fructosa-1-P
gliceraldehído-3-P
3-P-glicerato
2-P-glicerato
fosfoenolpiruvato
GTP
CO2
oxalacetato
malato
malato
oxalacetato
piruvato
piruvato
Gluconeogénesis a partir de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
Dijimos anteriormente que la síntesis de glucosa podría tener varios precursores. Entre ellos los
principales son los productos intermedios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos que pueden
experimentar oxidación a malato. Entonces el malato puede abandonar las mitocondrias y
experimentar su oxidación a oxalacetato en el citoplasma extramitocondrial; donde tiene lugar la
formación de fosfoenol-piruvato por la acción de la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa del
citoplasma. Tres átomos de carbono de los distintos intermediarios del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos se convierten, finalmente en tres átomos de carbono del fosfoenol-piruvato. Estos
carbonos proceden de los átomos alfa-carboxílicos (alfa-carboxilicos) y beta del oxalacetato.
Acido oxalacético.
COOH
β CH2
C
O
α COOH
Gluconeogénesis a partir de acetil CoA: en los tejidos de los animales superiores no hay
formación neta de nueva glucosa a partir de los dos átomos de carbono del grupo acetilo del
acetil CoA. Lo que sí sucede es que la condensación de la acetil CoA con el oxalacetato de
citrato que al oxidarse para dar fosfoenol-piruvato pierde 3 átomos de C en forma de CO 2 . Se
deduce que no puede formar más glucosa que el oxalacetato. En los tejidos animales la acetil
CoA no puede convertirse directamente en piruvato o en succinato. En los animales superiores
no existe senda metabólica alguna por lo que los átomos de carbono de los ácidos grasos
puedan ser utilizados para producir nueva glucosa.
Gluconeogénesis a partir de los aminoácidos: Como se ha visto, algunos o todos los átomos
de carbono de los distintos aminoácidos derivados de proteínas son finalmente convertibles en
acetil CoA o en intermediarios del ciclo de Krebs. Aquellos aminoácidos que pueden servir de
precursores del fosfoenol-piruvato y por consiguiente de la glucosa son aminoácidos
glucogénicos. Ej: alanina, arginina, glicina, histidina, valina, prolina, etc. Los aminoácidos que por
degradación son capaces de formar acetoacetato se los denomina cetógenos. Ej.: leucina. La
fenilalanina y la tirosina constituyen ejemplos de aminoácidos que a la vez son glucogénicos y
cetogénicos puesto que por degradación se escinden para formar ácido fumárico (glucogénico) y
acetil CoA (cetogénico).
TEMA XXI: BIOSÍNTESIS DE LÍPIDOS
Biosíntesis de ácidos grasos saturados. Formación de malonil CoA. Pasos en la síntesis de
ácidos grasos. Prolongación de los ácidos grasos saturados en la mitocondria y los microsomas.
Biosíntesis de triacil-gliceroles. Biosíntesis de colesterol.
----------------------------------------------La ruta biosintética que conduce desde la glucosa a los ácidos grasos es importante en la
mayoría de los organismos. Puesto que la capacidad de los animales superiores para almacenar
polisacáridos es bastantes limitada la glucosa ingerida en exceso, respecto a las necesidades
calóricas inmediatas y a la capacidad de almacenaje, se convierte en ácidos grasos, y éstos a su
vez, en triacilgliceroles que pueden almacenarse en grandes cantidades en el tejido adiposo.
Constituye otro proceso importante la biosíntesis de fosfoglicéridos de las membranas, puesto
que la mayoría de las células experimentan un recambio relativamente veloz. También se verá la
biosíntesis de colesterol. Aunque desde el punto de vista cuantitativo se trata de una vía
secundaria, el gran número de esteroles, biológicamente activos, que derivan del colesterol le
confiere considerable importancia.
BIOSINTESIS DE LOS ÁCIDOS GRASOS SATURADOS
La síntesis completa de ácidos grasos saturados de largas cadenas tiene efecto, solamente en la
fracción soluble del citoplasma. Esta catalizada por un complejo de siete enzimas que se
denomina complejo sintetasa de ácidos grasos. Los acil-derivados intermediarios del proceso no
son los tioésteres de la CoA, como en el caso de la oxidación de los ácidos grasos, sino
tioésteres de una proteína de bajo peso molecular denominado proteína transportadora de
ácidos (o ACP). Esta proteína puede formar complejos con las enzimas sintetasas a manera de
un racimo.
Malonil transferasa
Acil transferasa
Palmitil
transferasa
Enzima condensante
(β citonil sintetasa)
Deshidrogenasa
(2º reducción)
SH (resto fosfopantotenil
con grupo SH terminal que
enlaza los intermediarios
acílicos)
Deshidrogenasa
(1º reducción)
Deshidratasa
SH
(resto SH perteneciente a la proteína
transportadora de grupos acilos)
La malonil CoA es el precursor inmediato de 14 de los 16 átomos de carbono del ácido palmítico;
se forma a partir de la acetil-CoA citoplasmática (que deriva de la acetil-CoA mitocondrial) y del
CO 2 por la acción de la acetil-CoA-carboxilasa.
O
CH3
C
O
biotina
SCoA + CO2 + ATP
HOOC
CH2
Mn++
C
S
CoA
El CO2 se convierte en el carbono carboxílico libre distal de la malonil CoA. Los grupos acilos
de la acetil-CoA y de la malonil CoA son transferidos al grupo tiol de la ACP por acción de dos
enzimas acil-transferasa y malonil-transferasa.
O
O
SH + CH3
C
SCoA
acil
S
transferasa
SH
C
CH3 + HSCoA
SH
O
O
S
C
CH3 + COOH CH2
C SCoA
O
malonil
S C CH3 + HSCoA
transferasa
S
SH
C
O
CH2
COO H
Acetil-S-ACP y malonil-S-ACP reaccionan entre sí de manera que el grupo acetilo del primero
pasa a formar los carbonos 3 y 4 del grupos acetoacetilico, con desplazamiento del CO 2 .
SH + CO2
condensante
S
C
O
CH2
C
O
CH3
La acetoacetil-S-ACP se reduce por acción del NADPH.
SH
SH
NADPH+ + H+
S
C
O
NADPH+ + H+
NADP
deshidratasa
S
deshidrogenasa
C
CH2
C
SH
O
S
C
H2O
CH2
O
H
C
CH3
OH
CH
CH3
β-hidrobutiril-S-ACP
crotonil-S-ACP
SH
C
O
CH
CH3
S
C
acil
transferasa
S
NADP
O
CH2
CH2
O
SH
CH2
CH3
CH2
CH3
butiril-S-ACP
La formación de butiril-S-ACP completa el primer ciclo, el cual se repite seis veces más en el
cual una molécula de malonil-S-CoA se incorpora a la ACP para dar malonil-S-ACP la cual
experimenta pérdida de CO 2 y condensación con el acilo graso que se encuentra en el otro
brazo. De esta manera el producto es el ácido palmítico de 16 átomos de carbono. Al final del
ciclo se libera la ACP por la acción de una desacilasa hidrolítica.
SH + CH3
(CH2)14
COOH
ácido palmitico
SH
Las reacciones enzimáticas de la síntesis de ácidos grasos difieren de la oxidación en:
1.- Su localización dentro de la célula.
2.- En el portador de grupos acilos.
3.- En la forma en que las unidades de dos átomos de carbono se adicionan o eliminan
4.- El NADPH necesario en la reducción proviene de la vía del fosfogluconato.
PROLONGACION DE LOS ACIDOS GRASOS SATURADOS EN LAS MITOCONDRIAS Y LOS
MICROSOMAS
El ácido palmítico que es el producto final normal del sistema de la sintetasa de los ácidos
grasos del citoplasma, puede prolongarse mediante dos tipos diferentes de sistema enzimáticos:
el de las mitocondrias y el del retículo endoplasmático.
En las mitocondrias los ácidos grasos saturados de 12 a 16 átomos de carbono, en forma de
ésteres de la CoA, se alargan por adiciones sucesivas de acetil-CoA. La ruta mitocondrial se
realiza por inversión de las mismas etapas implicadas en la oxidación, con excepción de la
reducción del doble enlace que conduce al ácido graso saturado, que se verifica a expensas del
como reductor actor, y no de la flavoproteína. El sistema mitocondrial es capaz de alargar
también los ácidos grasos no saturados.
En los microsomas tanto los ésteres de ácidos grasos saturados, como los de los no saturados
pueden prolongarse, pero en este caso
es la malonil-CoA la fuente de grupos acetilos.
FORMACION DE ACIDOS MONOENOICOS (con doble enlace)
Los precursores de los ácidos grasos monoenoicos son el:
Acido palmítico (C16)
Acido Esteárico (C18)
Acido palmitoleico (∆9−10)
Acido oleico (∆9−10)
Aunque la mayoría de los organismos tienen capacidad para formar ácido palmitoleico y ácido
oleico, la ruta y el mecanismo utilizado dependen si el organismo es anaerobio o aerobio.
En los organismo aerobios los dobles enlaces son introducidos por una oxigenasa específica
localizada en la fracción microsómica, especialmente del hígado y del tejido adiposo.
No se conocen los detalles completos del mecanismo enzimático, pero se sabe que se utiliza la
molécula de oxígeno como aceptor de dos pares de electrones, uno de los cuales procede del
sustrato acil-CoA y el otro del NADPH, que se requiere en la reacción.
palmitoíl-CoA + NADPH + H+ + O2
1 par
palmitoleíl-CoA + NADP+ + 2 H2O
1 par
FORMACION DE ACIDOS POLIENOICOS
Todos los ácidos polienoicos se forman a partir de cuatro precursores:
1.- Acido palmitoleico
2.- Acido oleico
3.- Acido linoleico
4.- Acido linolénico
Los cuales sufren ulterior alargamiento y/o desaturización. Los ácidos linoleicos y linolénicos no
pueden ser sintetizados por los mamiferos quienes tienen que tomarlos de fuentes vegetales; por
esta razón se denominan ácidos grasos esenciales.
BIOSINTESIS DE TRIACIL GLICEROLES (TAG)
Los TAG, que actúan como lípidos de depósito o de almacenamiento, son activamente
sintetizados por las células hepáticas y adiposas de los mamiferos. Para la síntesis se requieren
dos precursores principales:
1.- Glicerol 3-fosfato
2.- Acil CoA graso
El glicerol 3-fosfato procede de dos fuentes:
1.- Dihidroxiacetona-fosfato que se produce en la glicólisis.
glicerol-3-fosfato + NAD+
Dihidroxiacetona-fosfato + NADH + H+
2.- También puede formarse por la acción de la gliceril-quinasa
ATP + glicerina
glicerol-3-fosfato + ADP
ETAPAS DE LA BIOSINTESIS
- Primera etapa: Acilación de los grupos oxidrilos libres del glicerol-3-fosfato por dos
moléculas de acil-CoA graso, produciendo un ácido fosfatídico.
O
CH2 O
CH2 OH
C R
O
O
+
CH OH
CH2 O
2
R
C
S CoA
O
CH
CH2 O
PO 3H2
C
R'
+ 2 HSCoA
PO 3H2
- Segunda etapa: El ácido fosfatídico experimenta una hidrólisis por acción de una fosfatasa
específica formando diacilglicérido.
O
O
CH2 O
C
CH2 O
R
O
C
CH2 O
R
O
O
CH
C
+ H2O
R'
CH
O
C
R' + Pi
CH2 OH
PO 3H2
- Tercera etapa: El diacilglicérido reacciona con una molécula de acil-graso CoA dando
triacilglicerol.
O
CH2 O
C
O
R
CH2 O
O
O
CH
O
C
R'
+
R''
C
C
R'
O
S CoA
CH
O
C
R'' + HSCoA
O
CH2 OH
CH2 O
C
R'''
BIOSINTESIS DE FOSFOGLICERIDOS
Los principales fosfoglicéridos que sirven como componentes de las membranas y las
lipoproteínas de transporte se forman por ramificaciones de la ruta biosintética a partir del ácido
fosfatídico. Además intervienen los nucleótidos citidínicos. Todas estas reacciones tienen lugar
en el retículo endoplásmico.
El ácido fosfatídico con el CTP se convierte en citidín-difosfato-diacilglicérido que es el precursor
común de todos los fosfoglicéridos formados por ésta ruta.
citidín-difosfato-diacilglicérido + PPi
Acido fosfatídico + CTP
Su porción CMP puede considerarse la portadora del ácido fosfatídico. En las reacciones
subsiguientes, cada una de las cuales es catalizada por una enzima específica la porción CMP
es desplazada por los alcoholes: serina, inositol, fosfato de glicerilo.
O
O
CH2
C
R
O
O
CH
C
R'
CH2
O
HO
O
P
O
HO
O
P
O
CH2
citosina
O
H
H
OH
OH
H
1). CDP - diacilglicérido + serina
fosfatidil-serina + CMP
2). CDP - diacilglicérido + inositol
fosfatidil inositol + CMP
3). CDP - diacilglicérido + glicerol-fosfato
fosfatidil-glicerol-fosfato + CMP
La descarboxilación enzimática del resto de la serina de la fosfatidilserina conduce a la
formación de la fosfatidil-etanolamina. La fosfatidil-etanolamina es precursora de la fosfatidilcolina, la cual se forma por transferencia de tres grupos metilos. El fosfatidil-gliceril-fosfato es
precursor de dos lípidos. Por desfosforilación rinde fosfatidil-glicerina que es uno de los
componentes de la membrana celular de muchas bacterias. El fosfatidil-gliceril-fosfato con una
segunda molécula de CDP - diacilglicérido rinde cardiolipina.
Acido fosfatídico
CTP
Fos
f ato
de
glice
ri l o
CDP - diacilglicérido
i na
Ser
Inositol
Fosfatidil-serina
Fosfatidil-inositol
Fosfatidil-glicerol-fosfato
CO2
Pi
Fosfatidil-etanolamina
Fosfatidil-glicerina
+ CDP-diacilglicérido
3 CH3Cardiolipina
Fosfatidil-colina
BIOSINTESIS DE COLESTEROL
Comprende tres etapas:
1.- Conversión de acetato en ácido mevalónico
2.- Conversión de ácido mevalónico en escualeno
3.- Conversión de escualeno en colesterol.
1). Conversión de acetato en ácido mevalónico:
El ácido mevalónico tiene seis átomos de carbono por lo que se forma por condensación de
tres moléculas de acetil-CoA.
β hidroxi - β metil - glutaril CoA + CoA
Acetil CoA + acetoacetil CoA
β hidroxi - β metil - glutaril CoA
NADPH2
ácido mevalónico + NADP + HSCoA
2). Conversión de ácido mevalónico en escualeno:
El ácido mevalónico es fosforilado por el ATP y se convierte en ácido-3-fosfo-5pirofosfomevalónico.
CH3
COO H
CH2 C
OH
CH2
CH2
O
P
O
O
HO
P
O
OH
OH
O
P
O
OH
El compuesto es muy inestable pierde H3PO 4 y se descarboxila dando isopentenilpirofosfato que se isomeriza y dá el 3-3'-dimetil-alil-pirofosfato.
CH2
OH
C
CH2
CH2
O
CH3
CH3
C
CH
CH2
O
CH3
P
OH
O
P
O
O
OH
OH
P
O
O
P
OH
OH
O
Estos dos compuestos se condensan con pérdida de PPi dando geranil-pirofosfato.
seranil-pirofosfato + isopentenil pirofosfato
- PPi
farnesil pirofosfato
El cual experimenta condensaciones reductoras y conducen al escualeno.
3). Conversión de escualeno en colesterol:
El escualeno sufre un ataque del oxigeno formando el 2-3 epóxido, el cual sufre una
ciclización a lanosterol en el cual se producen desplazamientos electrónicos con el cierre de
los cuatro anillos y formación de colesterol.-
TEMA XXII: BIOSÍNTESIS DE LOS AMINOACIDOS
La biosíntesis de los aminoácidos a partir de precursores sencillos, es vital para todas las formas
de vida, puesto que los aminoácidos son los precursores de las proteínas. Sin embargo los
organismos vivos difieren considerablemente en lo que se refiere a las formas de N 2 que son
capaces de utilizar con dicha finalidad.
Los animales superiores pueden utilizar NH3 como fuente de N 2 para la síntesis de aminoácidos
no indispensables, pero son incapaces de utilizar, nitritos y nitratos ó N 2 . Los rumiantes pueden
utilizar los nitritos y nitratos pero solo después que las bacterias de su panza los reducen a NH3 .
Las plantas superiores pueden producir todos los aminoácidos requeridos para la síntesis de
proteínas, a partir tanto de NH3 como de nitratos , como fuentes de N 2 . Pueden utilizar el NH3
como tal o después de su oxidación a nitrato por acción de las bacterias del suelo. Las
leguminosas son capaces de fijar N 2 atmosférico como NH3 por acción de las bacterias que se
encuentran en sus nódulos radicícolas.
Los microorganismos difieren ampliamente en cuanto a su capacidad de efectuar síntesis de
aminoácidos. Algunos no pueden crecer si no se le suministran algunos aminoácidos ya
formados. Otros como E.Coli pueden obtener todos sus aminoácidos a partir de NH3 .
Los veinte aminoácidos se sintetizan gracias a unas secuencias polienzimáticas, algunas de las
cuales son extremadamente complejas como es el caso en las mayoría de las vías biosintéticas,
las sendas de las síntesis aminoácidas son, en su mayor parte, diferentes a las seguidas en sus
degradaciones.
Por una parte los aminoácidos sirven no sólo como bloques de montajes en la síntesis de
proteínas sino también como precursores de muchas biomoléculas que poseen gran variedad de
funciones especializadas. Es frecuente que las rutas de síntesis y degradaciones aminoácidas
incluyan ciertas ramificaciones o extensiones conducentes a la formación de tales productos
especializados.
Ya hemos visto que las formas biológicas de N 2 disponibles son relativamente escasas en los
ambientes inanimados, porque el proceso de fijación de N 2 atmosférico está circunscrito a unos
pocos organismos. Por esa razón la mayoría de los organismos vivos, tienen que observar una
estricta economía en el empleo metabólico de las formas reducidas de N 2 . Nos encontramos así
con ejemplos donde los grupos NH 2 o los productos nitrogenados intermedios, son recuperados
y reutilizados para la síntesis de aminoácidos. Veremos también que la biosíntesis de la mayoría
de los aminoácidos funcionan bajo una regulación y un retrocontrol (feedback) constante gracias
a la acción de enzimas reguladoras.
Además las propias síntesis de las enzimas que catalizan la formación de los aminoácidos se
hallan también bajo control, tales síntesis pueden resultar reprimidas, si la célula dispone de un
suministro exógeno de aminoácido. Ambas formas de regulación constituyen el reflejo de una
intrínseca economía celular que prevalece en la síntesis y en la utilización de los aminoácidos.
BIOSINTESIS DE LOS AMINOACIDOS NO ESENCIALES:
Se definen a éstos como aquellos aminoácidos que pueden ser sintetizados por la rata albina.
Conviene considerar en primer lugar este grupo de aminoácidos, porque la mayoría de los
organismos pueden realizar su síntesis. Además este grupo. se distingue porque sus rutas
biosintéticas son más bien cortas y muestran variaciones relativamente pequeñas de unas
especies a otras.
BIOSINTESIS DE ACIDO GLUTAMICO: GLUTAMINA Y PROLINA:
Las rutas biosintéticas de estos aminoácidos que están íntimamente relacionados son idénticas
en todas las formas de vida. Los tres se degradan por sendas que conducen al α -oxoglutarato,
y los mismos caminos que se emplean para su síntesis. El ácido glutámico se forma desde luego
a partir de NH3 y de ácido α -oxoglutárico por acción de la L-glutamato ~ deshidrogenasa.
NH3 + ácido α−oxoglutárico + NADPH + H+
ácido L-glutámico + NADP+
Esta reacción es de importancia fundamental en la biosíntesis de cualquier aminoácido en todas
las especies, pues se trata de la ruta primaria sino la única de formación directa de grupos
α − amino a partir de NH3 . La transaminación de los ácidos α -oxo con el ácido glutámico como
donador de grupos NH 2 , constituye la senda principal de introducción de grupos α -amino en la
biosíntesis de la mayoría de los aminoácidos.
La Glutamina se forma a partir del ácido glutámico por la acción de la glutamina ~ sintetasa ya
descrita:
Glutamina + ADP + Pi
NH3 + ácido glutámico + ATP
Esta reacción es bastante compleja e implica dos o más etapas intermedias. Se ha observado
que el γ ~glutamil fosfato actúa como intermediario de alta energía ligado a la enzima.
O
C
OH
O
CH2
C
OH
O
CH2
H
P
ácido γ−glutamil-fosfórico
NH2
COOH
ATP + Acido glutámico
γ glutamil~fosfato
+ NH3
ADP +
γ glutamil~fosfato
glutamina + Pi
La prolina se sintetiza a partir de ácido glutámico por inversión de la ruta metabólica, antes
descrita para la oxidación de la prolina.
Los restos de hidroxiprolina que se encuentran en el colágeno y en otras proteínas fibrosas, se
forman a partir de determinados restos de prolina de esas proteínas por acción de la prolinhidroxilasa. Esta oxigenosa de función mixta utiliza el oxoglutarato como correductor y el oxigeno
corno aceptor electrónico. En la reacción se requieren Fe + + + y ácido ascórbico como cofactores.
Sin embargo la prolin-hidroxilasa no transforma la prolina libre en hidroxiprolina.
Acido Glutámico
NADH
NH2
H
C
COOH γ−semialdehído
glutámico
CH2 CH2 CH
O
CH2
inhibición
H2C
H
Acido ∆1~pirrolín
COOH 5 carboxílico
C
HC
N
H2C
CH2
H2C
C
H
N
COOH
H
Prolina
BIOSINTESIS DE ALANINA: ACIDOS ASPARTICO Y ASPARAGINA:
En muchos organismos la alanina y el ácido aspártico se forman por transaminación de ácido
pirúvico y del ácido oxalacético respectivamente.
ALANINA
O
CH3 C
NH2
COOH + HOOC CH2 CH2 C
NH2
COOH
CH3 C
H
Acido pirúvico
O
COOH + HOOC CH2 CH2 C
COOH
H
Acido glutámico
Alanina
Acido oxoglutárico
ACIDO ASPARTICO
O
HOOC
CH2 C
NH2
COOH + Acido glutámico
Acido oxalacético
HOOC
CH2 C
COOH + Acido β-oxoglutámico
H
Acido Aspártico
En algunas plantas estos dos compuestos se producen por Afinación reductora. El ácido
aspártico es el precursor directo de la asparagina. En muchos organismos ésta se forma por una
reacción similar a la catalizada por la glutamin-sintetasa.
NH2
HOOC
CH2 C
NH2
NH2
COOH + NH3 + ATP
H
Acido Aspártico
C
O
CH2
C
COOH + ADP + Pi
H
Asparagina
TIROSINA
Aunque la Tirosina es un aminoácido no indispensable, su síntesis requiere el aminoácido
esencial feniIalalina, como precursor. La tirosina se forma a partir de la fenilalanina por una
reacción de hidroxilación catalizada por la fenil-alanin-hidroxilasa. La cual como hemos visto
participa de la degradación de la fenilalanina.
Fenilalanina + NADPH + H+ + O2
Tirosina + NADP+ + H2O
BIOSINTESIS DE AMINOACIDOS ESENCIALES
Las sendas de la síntesis de los aminoácidos esenciales se han deducido en gran parte, de
estudios bioquímicos y genéticos practicados con bacterias. En general los caminos son
idénticos en la mayoría de las especies bacterianas y plantas superiores. Sin embargo en
algunos casos se observan diferencias de especie en algunas etapas individuales. Las sendas
que llevan a la biosíntesis de los aminoácidos esenciales son más largas que las que llevan a la
síntesis de los no esenciales. También son más complejas posiblemente porque varios
intermediarios sirven también como precursores de muchas otras clases de biomoléculas.
BIOSINTESIS DE METIONINA Y TREONINA
Estos dos aminoácidos esenciales tienen un denominador común: sus esqueletos carbonados
proceden de la homoserina. Análogo de la serina con cuatro átomos de carbono. A su vez la
cadena de carbonos de la homoserina deriva del esqueleto del ácido aspártico, luego de una
serie de reacciones que no tienen lugar en los mamíferos.
El camino metabólico de la reducción del grupo β -carboxílo de ácido aspártico al
correspondiente aldehído se parece a la reducción de 1-3 difosfoglicerato al 3 gliceraldehídofosfato de la ruta de la glicólisis. La homoserina formada en la primera etapa se fosforila a fosfato
de homoserina mediante una reacción que requiere ATP.
El fosfato de homoserina se convierte en Treonina por acción de la Treonín-sintetasa, enzima
que requiere fosfato de Piridoxal. En esta reacción se elimina ácido fosfórico de los carbonos 3 y
4, se obtiene así un doble enlace ∆3,4 que se isomeriza a la posición ∆2,3 y después se hidrata
para formar Treonina.
SINTESIS DE TREONINA
O
COOH ATP
CH2
H
C
OH
C
ADP
O
CH2
apartil
NH2 quinasa
H
C
P
OH NADH
NAD+
H
NH2
ADP
CH2
O
CH2
C
P
CH
C
H
NH2
Semialdehído
aspártico
OH
ENZ.
C
NH2
COOH
Homoserina
CH2
O
N
CH2
COOH
OH
ATP
CH2 OH
NAD+
NADH
O
CH2
O
COOH
aspartil
fosfato
COOH
Acido
aspártico
H
C
H+
CH
- Pi
Complejo enzimático
-homoserin-fosfato
C
N
CH
ENZ.
COOH
COOH
CH3
H+
CH3
H2O
CH
C
N
COOH
C
ENZ.
CH3
H
C
OH
H
C
N
COOH
H2O
CH
ENZ.
H
C
OH + O
H
C
NH2
CH
ENZ.
COOH
Treonina
Se cree que la secuencia completa tiene lugar con el grupo α − NH 2 del sustrato unido al grupo
aldehído del fosfato de piridoxal de la enzima como una base de Schiff, en éste complejo el
átomo de H 2 α es lábil. El producto final de la secuencia, la treonina, es un inhibidor modulador
de la primera enzima del sistema que es la enzima regulador aspartil-quinasa.
METIONINA
La conversión de la homoserina en metionina comienza con la formación enzimática de la
O~succinil homoserina por transferencia de un grupo succinilo del succinil-CoA. En la reacción
siguiente se forma cistationina a partir de la O succinil-homoserina y de la Cisteína la cual, a su
vez escinde, para dar homocisteína ácido pirúvico y NH3 . La Cisitationina puede experimentar
dos tipos de escisión, uno a cada uno de los lados del átomo de azufre, así puede servir como
intermediario de la conversión de Metionina en Cisteína en los mamíferos y de la transformación
de Cisteína en Metionina en las plantas y bacterias.
O
CH2 OH
Succinil CoA
CH2
H
C
H
NH2
CH2 O
C
CH2
CH2
C
Homoserina
S
CH2
NH2 CH2
COOH
COOH
CH2
Cisteína
H
C
CH
H
NH2
C
NH2
COOH
COOH
COOH
O succinil - homoserina
Cistationina
CH3
SH
S
CH2
Piruvato
CH2
+ NH2
H
C
CH2
DA ~ Cobalanina
NH2
N5 ~ Metil
tetrahidroflorato
CH2
H
C
COOH
NH2
COOH
Homocisteina
Metionina
La metilación de la Homocisteína a Metionina en E. Coli tiene lugar por transferencia del grupo
Metilo de N5 ~ metil tetrahicrofolato .
N5 metil tetrahidrofolato + homocisteína
D. A. ~ Co
balamina
tetrahidrofolato + metionina
En esta reacción se requiere Desoxiadenosilcobalamina, que contiene vitamina B12 , su acción
como portador de grupo metilo ( CH3 ) del N5 metil-tetrahidrofolato el cual puede provenir
originalmente de varios donadores de grupos ( − CH3 ) metilo, tales como la colina o la 5adenosil-metionina. A su vez, la homocisteína es uno de los posibles aceptores de grupos
( − CH3 ) metilo.
Funciones Precursoras de los Aminoácidos: Biosíntesis de Porfirinas
Los aminoácidos son precursores de muchas biomoléculas (aparte las proteínas) que ejercen
importantes funciones biológicas, tales como hormonas, vitaminas, coenzimas, alcaloides,
porfirinas, antibióticos, pigmentos y sustancias neurotransmisoras.
Es digno de mención especialmente, el hecho de que los aminoácidos cromáticos, sean los
principales precursores de buen número de alcaloides entre ellos la morfina, la codeína, y la
papaverina, así como de muchas otras sustancias con intensa actividad biológica, tales como la
hormona tiroxina, la hormona de crecimiento vegetal: ácido indolacético, el poderoso
vasoconstrictor neurohumoral: serotonina y las hormonas catecolamínicas: epinefrina y
norepinefrina.
Los aminoácidos son precursores de pequeños péptidos, como el glutatión y de las hormonas
péptidas, como la bradiquinina, oxitocina y la vasopresina. El péptido glutation se sintetiza según
las siguientes reacciones:
Mg++
Glutamilciateina + ADP + Pi
Acido glutámico + Cisteína + ATP
Glutamicisteína + Glicina + ATP
Glutatión + ADP + Pi
La biosíntesis de las Porfirinas cuyo principal precursor es la Glicina requiere especial atención
por la importancia central del núcleo porfirínico en la función de la hemoglobina, de los
citocromos y de la clorofila. Los tetrapirroles se construyen a partir de cuatro moléculas del
derivado monopirrólico Porfobilinógeno, que a su vez se sintetiza según las siguientes etapas:
COOH
COOH
CH2
HSCoA
CH2 NH2
COOH
COOH
CH2
CH2
+
CH2
C
COOH
S CoA
Glicina
O
H
Succinil~CoA
CH2
CH2
C O
C O
C
CH2
NH2
COO H
NH2
Acido δ−amino
levulínico
Acido α−amino
oxoadípico
En la primera reacción la glicina reacciona con el succinil-CoA para dar ácido α -amino β
oxoadípico quien luego se descarboxila para dar ácido amino-levulínico reacción que es
catalizada por la δ amino~levulínico~sintetasa; enzima que requiere fosfato de piridoxal y se
encuentra en el retículo endoplásmico de las células hepáticas. Luego dos moléculas de aminolevulínico se condensan para formar porfobilinógeno bajo la acción de la δ aminolevulínico
deshidrasa.
COOH
COOH
HOOC
CH2
CH2
2 H2O
H
C
C
H
CH2
+
O
C
CH2 COOH
CH2
CH2
C
C
O
CH2 C
CH2
NH2
H
C
C
N
H
NH2
N
H
H
H
Porfobilinógeno
H
Como precursores. de la Protoporfirina actúan cuatro moléculas de porfobilinógeno, a través de
una serie compleja de reacciones, la primera de las cuales la cataliza la
porfobilinógeno~desaminasa. Algunas de las etapas de la serie permanecen aún oscuras. El
hierro no se incorpora hasta que se ha completado la molécula de la protoporfirina. Esta
incorporación requiere una enzima, la hemo-sintetasa o Ferroquelatasa que está localizada en
las mitocondrias.
HOOC
CH2 COOH
CH2
CH2
C
C
CH2 C
C
CH
NH2
CH3 C
C
C
C
CH2
CH
C
C
H
H
C
C
CH3
C
C
CH
N
H
CH2
CH2
H
Porfobilinógeno
CH
H
N
N
CH3
COOH
C
C
CH2
H
HC
C
C
C
C
CH2
CH3
CH
CH2
COOH
Protoporfirina IX
La degradación de la protoporfirina IX, conduce a la bilirrubina y a biliverdina, que son pigmentos
segregados en la bilis.
TEMA XXIII: BIOSINTESIS DE LOS MONONUCLEOTIDOS
Biosíntesis de los nucleótidos de purina. Vías del ácido inosínico hacia los ácidos adenílico y
guanílico. Biosíntesis de los nucleótidos de pirimidina.
----------------------------------------La biosíntesis de ribonucleótidos y desoxiribonucleótidos es un proceso vital ya que estos
compuestos son precursores directos del ADN y del ARN así como de las coenzimas
nucleotídicas. Las rutas metabólicas de formación de sus bases (púricas y pirimidínicas) tienen
una importancia central.
Biosíntesis de nucleótidos purínicos: origen biosintético de los átomos del anillo purínico.
Proviene de los experimentos realizados por Buchanan quién administró a animales precursores
marcados y luego determinó los sitios del núcleo purínico a los que se habían incorporado los
átomos marcados. Esta experiencia se realizó en aves, que excretan el N 2 en forma de ácido
úrico que es un derivado de las purinas.
Ácido úrico:
CO2
Glicina
7
C
N
6
Aspartato
N
5
1
C
C
Formiato
8
Formiato
C
C
4
2
N
N
9
3
amida de la glutamina
Construcción del núcleo púrico:
N9
NH2 de la glutamina
glicina
amidotransferasa
PP
ADP + P
ácido glutámico
P O CH2
H
H
OH
H
H
OH
NH2
R
P
fosforibosilamina
O
P
ATP
OH
fosforibosilpirofisfato (FRPP)
C4 y C5
N7
C8
NH
NH2
"CHO"
CH
CH2
glutamina
CHO
CoF
C
ácido glutamínico
C
NH
NH
O
O
R
R
P
glicinamida ribótido
P
formil - glicinamida ribótido
N3
O
C6
C
N
N1
N
CO2
CH
NH2
"CHO"
CH
CH
CH
C
NH2
N
NH2
R
P
C
C2
N
NH
CH
CH
N
N
R
5−aminoimidazol ribótido
O
CoF
Acidoc aspártico
N
R
P
Inosina 5' - fosfato
Acido Inosínico IMP
P
5−aminoimidazol−4−carboxamida ribótido
Vías del ácido inosínico hacia los ácidos adenínico y guanílico
O
H
N
N
N
IMP (H+ inosínico)
N
R
P
NAD
aspartato
[O]
NADH2
GTP
GDP + Pi
O
H
HOOC
H
N
N
CH2 C
COOH
NH
O
N
N
H
R
H
N
N
P
N
glutamina
H+ glutámico
ATP
AMP + PP
aspartato
AMP
N
R
P
fumarato
O
NH2
H
N
N
H
NH2
N
N
N
N
N
R
N
P
R
GMP (H+ guanílico)
AMP (H+ adenílico)
P
Vías de la biosíntesis de nucleótidos purínicos:
ATP
AMP
base púrica
5−P−Ribosil PP
Ribosa 5 P
Nucleótido
Pi
Ribosa 1 P
base púrica
ATP
Nucleósido
AMP
Nucleótido
Pi
Biosíntesis de GDP, GTP y ADP, ATP:
GMP + ATP
GDP + ADP
GDP + ATP
GTP + ADP
AMP + GTP
ADP + GDP
ADP + GTP
ATP + GDP
Regulación de la síntesis de Nucleótidos Purínicos:
E
PRPP
AMP
ADP
ATP
GMP
GDP
GTP
+
H inosínico
5 fosforibosilamina
En este caso el exceso de ATP, ADP o ME o de GTP, GDP o GMP producen una inhibición a
nivel de la enzima que cataliza la reacción entre el fosforibosilpirofosfato y la 5 fosforibosilamina,
por lo tanto se frena la secuencia metabólica y se inhibe la biosíntesis. Es un caso de
retroalimentación negativa.
Biosíntesis de Nucleótidos de Pirimidina: es una ruta similar a la de los nucleótidos purínicos,
pues las bases libres no son productos intermedios. Esta ruta es más simple y se diferencia en
que la D-Ribosa se acopla después que se ha formado el anillo pirimidínico. El precursor es el
ácido Orótico.
O
C
H
O
N
C
H
C
C
COOH
N
ácido orótico
Acido Aspártico
H2O
carbamil PO≡4
Acido Carbamil Aspártico
PO≡4
PRPP
NAD
Acido Dihidrótico
Acido Orótico
NADH2
Dihidrotasa
PP
fosforibosiltransferasa
Acido Orotidílico
OMP
CO2
Acido Uridílico
OMP
descarboxilasa
UMP
(uridin monofosfato)
UMP + ATP
UDP + ADP
UDP + ATP
UTP + ADP
Biosíntesis de CTP (citidin trifosfato)
H
O
NH2
C
C
C
N
H
ATP
+
C
O
C
O
P
P
P
triofosfato de uridina (UTP)
N
C
H
C
C
H
NH3
H
N
R
ADP + Pi
N
R
P
P
P
triofosfato de citidina (CTP)
En Escherichia Coli (bacteria) el que dona el grupo NH 2 es el NH3 libre. En los mamíferos es el
grupo amido de la glutamina.
Regulación de la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina
Cuando hay un exceso de UTP y de CTP este exceso determina la inhibición de la aspartato
carbamil transferasa, enzima que inicia la ruta de biosíntesis, por lo tanto se produce el
fenómeno de retroalimentación negativa o feedback.
Acido Aspártico
aspartato carbamil transferasa
Acido carbamil
Aspártico
UMP
UTP
CTP
Biosíntesis de desoxi-TMP (timidín-monofosfato)
O
O
C
C
H
O
N
C
H
C
C
H
N5; N10.Metilen
Tetrahidrofolato
FH2
Dihidrofolato
H
N
C
CH3
C
C
H
O
N
desoxi R−P (dUMP)
N
desoxi R−P (d-TUMP)
Reacciones fosfotransferásicas:
ATP + d ADP
ADP + d ATP
ATP + d CDP
ADP + d CTP
ATP + d TDP
ADP + d TTP
ATP + d GDP
ADP + d GTP
Los precursores del ADN (ácido desoxiribonucléico) son desoxi-ribonucleótidos. Los precursores
del ARN (ácido ribonucléico) son ribonucléotidos.
TEMA XXIV: NATURALEZA, ESTRUCTURA Y APLICACION DEL MATERIAL GENETICO
Evidencias de que el ADN es el material genético. Estructura del ADN: Ley de Chargaff, estudios
de difracción con rayos X. Modelo de Watson y Crich. El dogma central de la Biología Molecular.
Replicación del ADN: replicación semiconservativa.
-------------------------------------------La genética estudia la transmisión hereditaria y la variabilidad de los caracteres de los
organismos).
En este capítulo veremos las bases bioquímicas de algunas cuestiones centrales, que plantea la
continuidad genética y la evolución de los organismos vivos.
a. ¿Cuál es la naturaleza molecular del material genético y de sus unidades fundamentales,
los cromosomas, los genes, los símbolos de código?
b. ¿Cómo se replica la información genética para pasar de una generación a otra?
c. ¿Cómo se transcribe la información en la célula?
d. ¿Cómo se traslada la información genética a la secuencia de aminoácidos de las moléculas
proteicas?.
Los extraordinarios avances en el conocimiento de la base molecular de la genética han
provocado une revolución intelectual en biología, que se considera comparable a la que
comenzó con la teoría de Darwin sobre el origen de las especies. Todos los campos de la
biología han resultado profundamente influidas por tales avances, de tal modo que en la
actualidad no se puede estudiar problema bioquímico alguno prescindiendo de su fondo
genético. El conocimiento actual de la base molecular de la genética deriva de los avances
realizadas en tres campos científicos diferentes: la genética, la bioquímica y la física molecular.
A. En el campo de la genética, ¿que progresos hubieron?
Al principio el único medio de llevar a cabo análisis genéticos consistía en realizar
experiencias con apareamientos debidamente orientados, es decir ya teniendo un
conocimiento de los resultados de la reproducción sexual. Experiencias de esta clase
presenta grandes limitaciones en cuanto al tiempo de generación que es relativamente
grande y el número de descendientes que es relativamente pequeño.
Supongamos, ejemplo, que se investigan fenómenos genéticos utilizando cobayos cono
animales de experimentación. Se eligen progenitores apropiados y se identifican por
anticipado los caracteres de la descendencia. El período de gestación es de 10 semanas y el
número de descendientes es de 2 a 4. Con este número de descendientes se revela una
pequeña parte de los rasgos potenciales capaces de ser transmitidos por los padres y para
estudiar la reproducción de los descendientes hay que esperar que los cobayos alcancen la
madurez sexual.
El desarrollo de la genética microbiana ha aportado un gran avance. Los microorganismos y
particularmente las bacterias se multiplican rápidamente (algunos a intervalos de 15').
Otro progreso experimental que es el uso de rayos X y otros agentes mutagénicos, que
incrementan la velocidad de mutaciones espontáneas.
MUTACION: alteración de un gen que puede ser espontánea o inducida (rayos X, radiación
U.V., etc.
Como las propiedades de la célula están controladas por genes los caracteres pueden
cambiar por mutación. De esta manera se pudo conocer la secuencia de los genes en los
cromosomas y saber que los genes poseen un gran número de locus que pueden
experimentar mutación; y que químicamente están constituidos por ácido desoxiribonucléico.
Pero el desarrollo más importante en el campo de le genética fue:
1.- La enunciación de la hipótesis de "un gen - una enzima", por Beadle y Tatum que dice
que los genes se expresan a través de proteínas, por lo tanto, las mutaciones darán
origen a proteínas alteradas.
2.- El descubrimiento de Avery y Col, que demostraron que el ADN contiene la información
genética.
B. En el campo de la bioquímica, muchos avances experimentales importantes se hicieron
posibles gracias a la mejora de métodos cromatográficos, que hicieron posible el análisis
cuantitativo de la composición aminoácida y de la secuencia de las proteínas' y mostraron
que le secuencia varía según función de la proteína. También se llegó a establecer la
composición y estructura covalente de los ácidos nucleicos. Uno de los desarrollos más
significativos consistió en el descubrimiento de la equivalencia de ciertas bases del ADN que
se convirtió en un elemento importante para deducir su estructura tridimensional.
C. En el campo de la física molecular la aplicación de difracción de rayos X a la conformación
de moléculas de proteínas fibrosas y globulares llevó al concepto de que cada tipo de
molécula proteica posee una conformación específica, que determina su función biológica.
Pero el hecho fundamental fue la aplicación de los rayos X al análisis de la estructura
tridimensional del ADN. En 1953 Watson y Crick postularon una estructura de doble hélice
para el ADN que sugirió un mecanismo sencillo por medio del cual la información genética
puede transferirse de la célula progenitora a la célula hija. La hipótesis de Watson y Crick fue
pronto ampliada y extendida hasta llegar a lo que Crick denominó el dohma central de la
genética molecular, el cual establece que la información genética fluye del ADN al ARN y de
éste a las proteínas; relación frecuentemente simbolizada así:
ADN
ARN
proteínas
El dogma central definió tres procesos principales de la preservación y transmisión de la
información genética.
1. Réplica, es decir la copia del ADN con formación de moléculas hijas idénticas.
2. Transcripción, por el cual el mensaje genético del ADN es transcripto en forma de
ARN para ser llevado a los ribosomas.
3. Traducción, por la cual el mensaje genético es descifrado y convertido en el alfabeto
de 20 letras de la estructura proteica.
Evidencias de que el ADN es el material genético
Aunque el ADN se descubrió en los núcleos celulares en 1869, no se identificó como portador
directo de la información genética hasta 1943. Avery y Col hallaron que una cepa no virulenta de
la bacteria Pneumococcus puede transformarse de modo hereditario, en una cepa virulenta por
simple adición de un ADN extraído de un neumococo virulento. Lo que sucede es que el ADN se
incorpora covalentemente al ADN de la célula receptora donde se replica con la célula huésped.
De especial significación son los experimentos de Hershey y Chase. Marcaron el ADN de las
partículas vírales e incubaron con la célula huésped mientras que la proteína viral no.
En 1955 Pauling mostró que en la anemia falciforme los glóbulos rojos se presentan en forma de
hoz debido a una alteración de la molécula de hemoglobina. Lo que ocurría es que en la
hemoglobina normal su cadena tiene un ácido glutámico en posición G, mientras que en la
anemia falciforme tiene valina. Este hallazgo deja en claro algo fundamental: una mutación
puntual en el ADN puede determinar el cambio de un aminoácido de la secuencia polipeptídica
de una proteína.
ESTRUCTURA DEL ADN
Se hicieron numerosos estudios tendientes a conocer la Estructura del ADN. En 1938 Astbury
observó que sometiendo al ADN al análisis de difracción de rayos X presentaba reflexiones que
corresponden a un espaciado regular de 3,4 Å a lo lardo del eje de la fibras. Si bien el significado
de ésta observación no estaba bien clara, porque se sabía que el ADN utilizado era impuro.
Sim embargo, más tarde Franklin y Wilkins obtuvieron datos más precisos operando con fibras
de ADN altamente purificadas y encontraron dos periodicidades de 3,4 Å y de 34 Å. En el
periodo 1949 - 1953 Chargaff y Col explicaron métodos cromatográficos cuantitativos para la
determinación analítica de las 4 bases del ADN. De dichos estudios se obtuvieron las siguientes
conclusiones:
1. Las muestras de ADN aisladas de diferentes tejidos de una misma especie poseen igual
composición de bases.
2. La composición de bases del ADN varia de una especie a otra.
3. La composición de bases del ADN de una determinada especie no cambia con la edad,
con el estado de nutrición ni con los cambios ambientales.
4. En todos los ADN examinados el número de restos de adenina es igual al de restos de
timina (es decir: A = T); el número de restos guanínicos es igual al de los citosínicos (G =
C ).
La equivalencia de bases observadas en el ADN plantearon la posibilidad de que existe un nivel
de organización estructural de las moléculas del ADN que sea compatible con ciertas
equivalencias de bases, pero incompatibles con otras. Además ya se pensó en una
conformación tridimensional para el ADN. De esta manera el escenario ya estaba dispuesto para
proponer la conformación tridimensional del ADN. Es decir se contaba con tres elementos.
1. Tamaño de las bases;
2. Periodicidades observadas;
3. Equivalencia de ciertas bases.
El interés en el problema se acrecentó ante la difícil interrogación de como podía replicarse el
ADN con tanta fidelidad.
En 1953 Watson y Crick postularon un modelo tridimensional preciso para la estructura del ADN,
basado en los datos de rayos X de Franklin y Wilkins y en las equivalencias de bases
observadas por Chargaff. Este modelo no solo explicaba las propiedades físicas y químicas del
ADN, sino que sugería un mecanismo por medio del cual la información genética podía
replicarse con exactitud. El modelo estructural del ADN de Watson y Crick consiste en dos
cadenas polinucleotídicas dextro-helicoidales, arrolladas a un mismo eje y constituyendo una
doble hélice. Las bases púricas y pirimídicas de cada hebra se encuentran en el interior de la
doble hélice.
El aparejamiento de las bases apartadas por ambas hebras es tal que solamente ciertas bases
encajan en el interior de la estructura de manera que puedan unirse unas a otras por puentes
hidrógeno. Las bases son:
A-T
y
G-C
que son las parejas que muestran exacta equivalencia:
núcleo de
AyG
N
núcleo de
TyC
N
N
N
N
Si el par sería A - G serían demasiado grandes para poder encajar dentro de la doble hélice de
estas dimensiones.
Si la pareja fuera G - T las bases se encontrarían muy distanciadas para poder formar enlaces
hidrógeno estables.
A
A
G
T
T
C
A
T
T
A
C
A
G
G
T
C
Además los enlaces hidrógeno entre A – G y C – T son más débiles que A – T y G – C, o sea
que la doble hélice implica aquellas parejas que poseen el máximo de estabilidad. ¿Por que las
dos periodicidades observadas con los rayos X?. Se postuló que la periodicidad de 3,4 Å se
debe a que las bases están apretadamente apiladas al eje y mantienen una distancia de 3,4 Å
de centro a centro. En cada espira de la hélice hay 10 nucleótidos y de una espira a otra hay 34
Å.
Las bases hidrófobas están en el interior de la hélice, los restos carbohidratos y los fosfatos que
poseen carga eléctrica están expuestas al H 2 O . Así resulta que la doble hélice está estabilizada
no sólo por los puentes hidrógeno entre les bases complementarias sino también por
interacciones hidrofóbicas entre dichas bases apiladas. Las dos cadenas polinucleótidas de la
doble hélice no son idénticas ni en la composición ni en la secuencia de bases. Ambas cadenas
son complementarias una de la otra. Esta estructura conduce a un mecanismo por medio del
cual la información genética puede replicarse con precisión. Dado que las dos hebras son
complementarias una de la otra, y contienen información genética complementaria, se postuló
que durante la división celular la réplica del ADN podría ocurrir por separación de las dos hebras,
con lo que cada una haría de patrón especificador de la secuencia de bases de una nueva
hebra complementaria sintetizada. EI resultado final de este proceso consistiría en la formación
de dos moléculas hijas de un ADN de doble hélice, cada una de las cuales contendría una de las
hebras del progenitor. (Ver ilustración página 681 de Lenhinger).
REPLICACION DEL ADN
De acuerdo al dogma central de la genética molecular, quedó establecido que:
ADN
ARN
proteínas
O sea que éste dogma definió tres procesos fundamentales de los cuales el primero es el de
REPLICA, es decir la "copia" del ADN con formación de moléculas hijas. Veremos como sucede
éste proceso a nivel molecular. La característica más sorprendente de la hipótesis de Watson y
Crick, desde el punto de vista genético, en su postulado de que las dos hebras del ADN
duplohelicoidales son complementarias.
La réplica de cada una de ellas conduce a dos moléculas hijas de ADN; cada una contiene las
hebras del ADN progenitor. Este proceso se denomina réplica semiconservadora.
Pero ¿Cómo pueden replicarse simultáneamente las dos hebras del ADN de modo que se
formen al mismo tiempo?. Éste mecanismo requiere tres enzimas:
- ADN - polimerasa dependiente del ADN
- ADN - ligasa
- Endodesoxiribonucleasa
ADN - polimerasa
Cataliza la síntesis de enlaces internucleótidos. Posee los siguientes requerimientos:
1). presencia da ADN preformado
2). presencia de los cuatro desoxiribonucleótidos trifosforados, los mono y dífosforados son
inactivos.
3). Mg++
¿Qué papel desempeña el ADN preformado? Se han propuesto dos alternativas:
1. Que actúa como cebador, es decir que al proporcionar un extremo o puntos de
crecimiento, se pueden adicionar nuevos mononucleótidos.
hebra patrón
hebra cebadora
2. 0 bien podría ser utilizado como patrón sobre el cual la enzima podría construir una hebra
complementaria al ADN preformado.
nd ATP
d
nd GTP
ADN preformado
nd CTP
Mg++
nd TTP
d
d
d
ADN
|
AMP
|
GMP
|
CMP
|
TMP
+
4 PPi
Teniendo en cuenta estos requerimientos la reacción global sería así.
Mecanismo de acción de la ADN - Polimerasa
Si partimos de una hebra cebadora de ADN o sea de un ADN preformado:
OH
HO
P
H2C
O
O
H
Base
H
H
O
H
P
O
O
HO
H
O
Base
H
H
OH
H
O
H
O
H
P
OH
O
O
P
OH
P
OH
O
P
O
PPi
H2C
OH
PPi
O
O
H
+
H2C
OH
H
Base
P
OH
H
Base
H
H
OH
H
OH
H2C
O
H
Base
H
H
OH
H
OH
Hay un ataque al átomo de fósforo alfa del nucleótido trifosforado entrante y provoca el
desplazamiento de su crudo pirofosfato, con formación de enlace internucleótido. El PPi formado
es rápidamente hidrolizado por una pirofosfatasa por lo cual la reacción es muy exergónica. La
dirección de la síntesis es por lo tanto 5’ --- 3'.
ADN ligasa
1. Enlaza extremos de moléculas de ADN produciendo formas circulares. Ej.: bacterias.
2. Cataliza la reparación de roturas de una cadena de ADN.
Requerimientos de la ADN ligasa
1. Presencia de NAD que actúa como fuente de grupos adenilo.
2. Una hebra intacta de ADN.
Mecanismo de acción de la ADN ligasa
O
Base
CH2
O
P
NMN
OH
NAD
AMP
5'
Dinucleótido
constituído
NMN y AMP
OH
H
OH
3'
H
Base O
1. Enzima + NAD --------------- En - AMP + NMN.
Se forma un complejo entre En y AMP y se forma NMN como producto secundario.
2. El grupo adenilo es transferido por la Enzima al extremo 5’ fosfato.
3. El extremo 3' OH desplaza al grupo adenilo y forma el enlace fosfodiéster.
OH
O
Base O
CH2
O
P
OH
O
O
P
OH
H2C
ó
Base O
Adenina
CH2 O
HO
P
O
O
OH
Base O
Base O
Mecanismo de replicación
Antes de hablar de la replicación es importante acotar que la cadena de ADN recién sintetizada
se prolonga en dirección opuesta a la cadena de ADN patrón, es decir, tiene una polaridad
opuesta o antiparalela.
P
3'
A
T
cebadora
T
5'
3'
P
P
3'
5'
T
3'
P
A
T
P
3'
5'
5'
3'
Kornberg: postuló que la réplica comienza con la producción de una mella o una rotura en una
hebra por acción de una endonucleasa. Unidades de MN adicionadas por la ADN polimerasa:
5'
5'
3'
5'
3'
3'
La ADN polimerasa se fija a dicha rotura y comienza a prolongar el extremo 3' unidades de
mononucléotidos (MN). (–)
El extremo 5' se desplaza de la estructura duplex. Se sugiere que el extremo 5' puede estar
sujeto por adherencia a la membrana celular. La réplica continua durante cierto trecho mientras
que el extremo 5' se va "pelando". La ADN polimerasa se desplaza de lugar, o salta, desde la
hebra patrón intacta a la hebra mellada en el sitio donde se separan ambas hebras y comienza a
adicionar unidades de mononucleótidos utilizando como patrón la fibra mellada. La replicación
continúa hasta que el extremo se ha replicado por completo y entonces la enzima se retira.
La endonucleasa rompe en la horquilla la hebra formada y el proceso vuelve a repetirse con la
ADN polimerasa, que adiciona nuevas unidades de mononucleótidos. Los dos nuevos
segmentos formados sobre la hebra patrón son unidos por la ADN ligasa y comienza un nuevo
ciclo.
3'
endonucleasa
5'
3'
ADN polimerasa
5'
3'
ADN ligasa
5'
TEMA XXV: LA TRASCRIPCION DE LA INFORMACION GENÉTICA
ARN mensajero: teoría y propiedades del mensajero. La polimerasa del ARN dependiente del
ADN. Mecanismo de acción: unión, iniciación, elongación y terminación de la trascripción. La
replicasa del ARN.
------------------------------------------------Evidencias de que el ARN transporta la información genética:
El ARNm es un buen candidato para transportar la información por una serie de evidencias:
1. El ARN tiene una estructura semejante a las cadenas del ADN y sus bases nucleotídicas
pueden formar puentes hidrogeno con las bases del ADN siguiendo las reglas de
complementariedad de Watson y Crick.
2. El ARN puede contener y transmitir información genética; esto lo demuestra el hecho de
que algunos virus no contienen ADN y su ARN puede actuar como agente infeccioso. Ej,
el virus del mosaico del tabaco que causa infecciones virales en las hojas de las plantas.
3. El ARN se sintetiza en el núcleo, pero los ribosomas que están en el citoplasma, donde se
realiza la síntesis proteica, contienen mas del 70% del ARN celular.
PROPIEDADES DEL ARN MENSAJERO:
1. Recambio: en bacterias el ARNm tiene un activo metabolismo, se sintetiza y degrada
rápidamente. Esta propiedad fue la clave de su aislamiento e identificación. Sin embargo
existen ARN muy estables Ej.: el ARNm de los reticulocitos.
2. Relación entre la secuencia de bases del ADN y el ARN celular: el ARNm se sintetiza
sobre una matriz de ADN o sea que el ARNm es el portador de la información. La enzima
que cataliza esta síntesis es la ARN polimerasa dependiente del ADN.
Mecanismo de acción de la ARN polimerasa:
Para obtener esta enzima en forma pura, Richard Burgen realizaron una electroforesis en gel de
poliacrilamida. Así se pudo detectar 4 bandas por tinción de los polipéptidos.
Lo que interesaba saber era si los 4 polipéptidos intervenían en la actividad de La enzima. Para
ello eliminaron uno de los polipéptidos que denominaron factor σ (sigma).
La eliminación de este factor cambió las propiedades de la enzima ya que perdió su capacidad
de usar como matriz al ADN. La adición de factor σ restauraba la propiedad de la enzima de
usar ADN como matriz.
Mecanismo de acción de la ARN polimerasa:
A. Unión de la ARN polimerasa al ADN:
σ
unión reversible
σ
unión estable: σ reconoce al promotor
σ
las hebras del ADN se separan
La ARN polimerasa se une reversiblemente al ADN en varios sitios de éste. Sin embargo
cuando esta unión se hace en una región especifica que es el gen promotor el factor σ
reconoce la secuencia nucleotídica y estabiliza el complejo ADN-ARN polimerasa.
Esta estabilización permite que la enzima inicie la separación de las hebras de la doble hélice
del ADN permitiendo la iniciación de la trascripción.
B. Inicio de la trascripción
A
T
T
A
C
T
G
A
G
G
A
C
T
A
T
G
A
T
A
C
T
G
A
G
G
T
A
T
A
C
T
C
σ
G
C
T
G
A
C
σ
3'
P
P
P
A
OH
P
P
P
OH
OH
5'
P
P
P
C
T
G
A
A
T
T
A
C
T
G
A
G
G
Se forma el primer enlace
internucleótido
A
C
T
G
A
T
A
P
P
C
T
G
A
P
P
C
σ
OH
+
P
P
5'
Una vez unida la enzima a un promotor en el ADN, se inicia la transcripción por unión de dos
nucleótidos trifosforados a la enzima. En general todos los ARN comienzan a sintetizarse por
ATP y GTP. Al tomar posición los dos primeros sustratos, el OH − 3' del nucleótido trifosforado
iniciador ataca el enlace fosfodiéster entre los fosfatos alfa y beta del segundo nucleótido y se
forma el primer enlace internucléotido.
Elongación de las cadenas nucleotídicas:
A
T
T
A
C
T
G
A
G
A
C
T
G
A
T
G
A
La enzima se desplaza
por la hebra del ADN
P
P
P
C
T
C
G
A
G
P
σ
P
A
P
OH
Cuando el producto de la elongación llega a un tamaño critico el factor σ se libera.
Las cadenas nucleotídicas crecen por adición secuencial de ribonucleótidos al extremo 3' del
dinucleótido iniciador.
La entrada de los diferentes sustratos depende de la complementariedad con las bases de la
hebra del ADN que sirve de matriz.
Terminación de la transcripción:
1.
secuencia terminadora
reconocida por la enzima
2.
factor ρ de terminación
ρ
(Ro)
ADN
ARN
enzima
Ocurre por medio de dos mecanismos:
1. Terminación codificada por una secuencia de ADN que es reconocido por la enzima.
2. Por medio de un factor proteico adicional el cual tiene la propiedad de causar la
terminación de la trascripción en sitios donde no funciona el primer mecanismo.
Conclusión: la célula resuelve el "problema geográfico" transcribiendo la información genética
contenida en el ADN del núcleo en un ARN que actúa como mensajero, pues lleva la información
a los ribosomas citoplasmáticos donde se realiza la síntesis proteica.-
TEMA XXVI: EL CODIGO GENETICO
El codón: unidad de información, primeras ideas sobre la clave genética. Universalidad de la
clave genética.
--------------------------------------------Vamos a considerar dos cuestiones:
1. ¿Cómo se traslada el lenguaje de cuatro letras de los ácidos nucleicos al de veinte letras
de las proteínas?.
2. ¿Cuál es, la correspondencia entre la secuencia nucleotídica y la secuencia de
aminoácidos?.
Mediante consideraciones matemáticas, parecía probable que cada aminoácido fuera codificada
por un número pequeño de nucleótidos consecutivos de la cadena ADN. Puesto que el ADN
contiene sólo cuatro bases y las proteínas contienen veinte aminoácidos, es obvio que se
requiere más de un nucleótido para codificar cada aminoácido. Si se disponen los nucleótidos en
grupos de dos, rinden 4 2 = 16 combinaciones. Las 4 bases en combinaciones de 3, pueden
codificar 4 3 = 64 aminoácidos distintos. O sea que un código de tripletes es utilizado para
codificar aminoácidos.
Composición de los Tripletes: los experimentos que se realizaron para conocer la composición
de los tripletes fueron utilizando polirribonucleótidos sintéticos como mensajeros de ribosomas
aislados de E. Coli. Incubaron ácido uridílico (poli - U) en una serie de tubos que contenían
ribosomas de E. Coli privados de mensajero, además de todo lo necesario para la síntesis
proteica, incluyendo todos los aminoácidos. Este estudio demostró que la cadena polipeptídica
recién formada contenía solamente fenilalanina. En consecuencia, sugirieron que el vocablo del
código para la fenilalanina era el triplete UUU.
Por experimentos similares hallaron que el poli C codifica prolina, el poli A lisina, etc.
Posteriormente prepararon polímeros de nucleótidos variando la relación cuantitativa de los
distintos mononucleótidos que permitió identificar la composición de 50 vocablos del código para
los distintos aminoácidos. Estos experimentos no sólo permitieron establecer como se "deletrea"
el vocablo del código de cada aminoácido, sino que permitieron comprobar que algunos
aminoácidos eran codificados por más de un triplete.
Por ejemplo:
fenilalanina es cofificada por
UUU − UUC −
serina es cofificada por
UCU − UCC − UCA − UCG −
El triplete de bases nucleotídicas que se encuentran en el ARNm y que codifica un aminoácido
de denomina “codón”
Características generales del código:
1. El código aminoácido es un código degenerado, es decir que hay más de un vocablo de
codificación para la mayoría de los aminoácidos.
2. Otra característica del código genético consiste en que no requiere señal indicadora del
final de un codón y comienzo del siguiente.
3. 3 de los 64 tripletes no codifican ninguno de los aminoácidos y son: UAG - UAA - UGA.
Estos tripletes constituyen una señal de terminación de las cadenas polipeptídicas.
Universalidad del código: los vocablos del código aminoácido son idénticos en el hombre, en
virus y en bacterias, es decir, es universal. A esta conclusión se llegó luego de una serie de
ensayos. Se comparó 50 aminoacil - ARNm diferentes procedentes de especies muy distantes, y
observaron sus respectivas capacidades para ser reconocidos por los codones aminoácidos
previamente establecidos de E. Coli. Para ello se ensayó la capacidad de tales aminoacil - ARN t
para unirse a ribosomas de E. Coli empleando sintéticos y se halló que en todos los casos los
aminoacil - ARN t respondían
perfectamente a los codones de E. Coli unidos a los
ribosomas de este microorganismo Considerando conjuntamente este hallazgo sugieren que el
lenguaje genético es idéntico en todas las especies.
TEMA XXVII: LA TRADUCCION DE LA INFORMACION GENETICA
Necesidad de una molécula adaptadora: el ARN de transferencia. El anticodón. Función de los
ribosomas. El mecanismo de traducción: iniciación, elongación, translocación y terminación.
-----------------------------------------------------Vamos a considerar ahora la tercera gran cuestión que plantea la continuidad genética de los
organismos vivos.
¿Cómo se traslada la información genética contenida en la secuencia nucleótida del ARNm , de
tal suerte que los aminoácidos se engarcen formando una cadena polipeptídica con una
secuencia aminoácida específica?
Trataremos los mecanismos enzimáticos por medio de los cuales se constituye la cadena
polipeptídica, es decir como se realiza la síntesis proteica. Además veremos el funcionamiento
de los ribosomas asegurando la adecuada transferencia de la información del ARNm , y el papel
adaptador del ARN t .
Estructura ribosómica: los ribosomas sometidos a condiciones especiales se disocian en dos
subunidades 50 S y 30 S cada uno de los cuales contiene ARN y varias proteinas.
contiene dos componentes
50 S
30 S
ARN y 30 proteinas diferentes
contiene una molécula de ARN
ribosomático y 20 proteinas diferentes
Estructura del ARN t :
El ARN t , posee una conformación tridimensional similar a una hoja de trébol de manera que
presentan sus cadenas el máximo de aparejamiento intracatenario.
G
A
|
C
|
C
Locus de enlace aminoácido
Anticodón (unión al ARNm)
Todas las moléculas de ARN t tienen en un extremo la misma secuencia terminal C − C − A . El
último resto, el ácido adenílico, es el locus que se esterifica al resto aminoácido. Además existe
un triplete de bases que es distinto en todos los ARN t y representa el anticodón es decir, el
triplete nucleótido especifico complementario de los tripletes del codón del ARNm .
La molécula de ARN t contiene otro locus de unión para la enzima activadora. Una característica
de la estructura es la presencia de bases secundarias además de las normales A – U – G y C.
La mayoría son formas metiladas de las bases principales. El ARN t es solamente un
"adaptador" de manera que puede ser adaptado al lenguaje de tripletes nucleótidos del código
genético.
Estadíos de la síntesis proteica:
- Primer estadío: activación
Los 20 AA se eterifican al ARN t correspondiente. Las enzimas que participan son: aminoacilARN t -sintetasas que tienen:
a. tres locus de unión:
o
para el AA
o
para el ARN t
o
para el ATP
b. son específicos:
o
para cada AA
o
para el correspondiente ARN t
La reacción tiene lugar en el citoplasma.
Primera fase de activación: se forma un producto intermedio unido a la enzima:
Mg++
ácido amino acil adenílico + PPi
ATP + AA
O
H
O
C
C
P
R
O
P
O
P
O
OH +
CH2
O
OH
Adenina
NH2
R
H
O
C
C
NH2
O
O
P
OH
O
CH2
O
+
Adenina
PPi
Segunda fase de activación: consiste en la transferencia del grupo aminoacilo del AMP al
ARN t :
aminoacil - ARNt + ácido adenílico
ácido-aminoacil.adenílico + ARNt
O sea que la reacción global sería
AA + ARNt + ATP
aminoacil - ARNt + AMP + PPi
Tenemos entonces cada AA con su correspondiente ARN t .
- Segundo estadío: en ribosomas. Los ribosomas tienen que captar al ARNm y al
ARN t − AA .
30 S
LP
LA
50 S
Los ribosomas tienen dos locus de unión.
1. El locus peptidílico: (LP) para el ARN t que tiene unido el AA iniciador de la síntesis
que es la metionina la cual tiene su grupo amino bloqueado por un grupo formilo con
el objeto.
a. que el grupo amino no forme enlace peptídico.
b. que el locus peptidílico sólo acepte al ARN t que tiene metionina.
2. El locus aminoacílico: que permite la entrada secuencial de los ARN t − AA .
El ribosoma para que puedan unirse el ARNm y el ARN t − AA debe disociarse en sus dos
subunidades. Participan en este proceso factores proteicos F1 F2 F3 (llamados también
disociasaribosomal) y GTP. Estos factores permiten la disociación de los ribosomas y
además la unión del ARNm en el lugar donde se inicia el mensaje.
30 S
30 S
30 S
50 S
AA
AA
50 S
- Tercer Estadío: Elongación
La prolongación de una cadena tiene efecto en tres fases principales:
1.- Los ribosomas con su ARNm , tienen unido en el LP el ARN t − AA iniciador de la
síntesis (metionina). En el estadío de elongación, al locus aminoácido se une por su
anticodón el ARN t − AA de acuerdo al triplete de bases del codón. Este proceso
requiere GTP y un factor T que es una proteína que cataliza este proceso de
elongación.
LP
LA
(metionina) AA
AA
2.- En la segunda fase se forma el enlace peptídico por reacción entre el grupo amino del
nuevo aminoacil - ARN t captado con el grupo carboxilo del AA ya existente en el LP.
NH
NH
R
CH
C
R
O
CH
HO
LP
O
O
LP descargado
C
NH
NH2
R
R
CH
C
O
C
H
C
LA
O
O
LA
O
ARNm
Para la formación del nuevo enlace peptídico es necesaria una enzima denominada
peptidil-transferasa. El ARN t "descargado" que ya no lleva su AA, continúa unido al LP.
El peptidil ARN t recién alargado está unido al LA.
3.- En la tercera fase del ciclo de alargamiento el peptidil - ARN t se desplaza físicamente
desde el LA al LP y desaloja de este último al sitio del ARN t “descargado”. Esta
compleja reacción de translocación se cree que es resultado de un cambio de
conformación en el ribosoma, que tiene lugar a costa de la hidrólisis del GTP. Para esta
fase se requiere una proteína especifica denominada factor G. Simultáneamente con la
translocación del peptidil - ARN t tiene lugar la del ARNm que desplaza un codón a lo
largo del ribosoma.
O
CH
NH
R
C
H
C O
LP
O
LA
El proceso se repite, es decir entrando ARN t − AA al LA hasta que el ARNm codifica la
terminación.
- Cuarto Estadío: Terminación de la cadena polipeptídica
La terminación de una cadena polipeptídica completa y su despegue del ribosoma está
señalada en el ARNm por tres codones especiales de terminación. La liberación del
polipeptidil- ARN t del ribosoma, es inducida por un factor de liberación protéico que está
unido al ribosoma y provoca la hidrólisis del enlace éster entre el polipéptido y el ARN t . El
ribosoma 70 S se aparta del ARNm y queda libre. Cuando experimenta disociación en sus
subunidades 50 S y 30 S puede recomenzar un nuevo ciclo.-
TEMA XXVIII: REGULACION DE LA SÍNTESIS PROTEICA
Teoría de Jacob y Monod: Regulación transcripcional. Inducción. Represión.
-----------------------------------------------------Las células vivas disponen de mecanismos que regulan la cantidad de proteínas que se
sintetizan.
Estos mecanismos de regulación fueron estudiados en células bacterianas y se observó que la
cantidad de enzimas que se acumula en el medio depende de la naturaleza de los nutrientes. En
base a todos estos estudios se distinguió dos tipos de respuestas:
1. De inducción enzimática
2. De represión enzimática
INDUCCION
Si estamos en presencia de una inducción a la enzima que se induce a que se sintetice se
denomina enzima inducible. Esta enzima inducible se encuentra en pequeña cantidad en el
medio, pero cuando se agrega un sustrato sobre el cual debe actuar su concentración aumenta
para transformar a ese sustrato en un metabolito que puede ser utilizado por la célula. Ej.: un
tipo de E. coli usa como fuente de carbono a la glucosa. Si en el medio en lugar de colocar
glucosa colocamos lactosa, la célula inmediatamente comienza a sintetizar β -galactosidasa que
desdobla la lactosa en galactosa y glucosa. Si volvemos a colocar glucosa, la enzima β galactosidasa deja de sintetizarse y alcanza un nivel bajo. La mayoría de las enzimas inducibles
catalizan las reacciones del catabolismo. Estas enzimas inducibles son diferentes a las enzimas
constitutivas que se forman a velocidades constantes independientemente de la presencia del
sustrato (por ej. las enzimas de la glicólisis).
REPRESIÓN ENZIMATICA
La célula tiene enzimas requeridas para la síntesis de los 20 aminoácidos. Si agregamos al
medio un aminoácido, por ej. histidina, la enzima que le sintetizaba es reprimida y desaparece de
la célula. Todas las enzimas inducibles están codificadas por genes. En los genes hay locus que
determinan la formación de las enzimas. Un locus se denomina gen estructural, que es el que
determina la secuencia de aminoácidos de la enzima. El otro locus, llamado gen regulador, es
interruptor, es decir que está determinando si el gen estructural se transcribe o no. O sea que el
gen estructural codifica una enzima que se sintetiza normalmente siempre que el gen regulador
no reprima su síntesis.
Regulador
Estructural
¿ Cómo funciona el gen regulador tanto en la represión como en la inducción?
Jacob y Monod formularon una hipótesis general respecto a la función de los genes estructural y
regulador) en los 2 procesos.
- Inducción: el gen regulador transcribe un ARN mensajero que codifica una proteína
denominada represor.
regulador
ARNm
operador
estructural
Este represor tiene un locus de unión específico próximo al gen estructural. Este locus se
denomina operador.
¿Qué sucede en una inducción, es decir cuando se agrega al medio un sustrato que debe
degradarse?. El sustrato, que sería el inductor, se combina con el represor formando un
complejo inductor-represor inactivo, que no puede unirse al operador.
represor
inductor
El gen estructural queda libre y comienza a transcribirse y por lo tanto se sintetiza la enzima.
La unión represor-inductor es reversible, o sea que cuando se elimina el inductor la síntesis
de la enzima que lo degrada es reprimida.
- Represión: Si agregamos al medio un aminoácido por ej. histidina, la célula no necesita
utilizar las enzimas que lo sintetizan.
regulador
ARNm
operador
estructural
represor
En este caso, la histidina se une al represor y forma un complejo represor-correpresor que se
combina al operador; el gen estructural no se transcribe y por lo tanto no se sintetiza
histidina.
Regulación coordinada: también existe un mecanismo de regulación coordinada por el cual un
grupo de enzimas puede ser reprimida o inducida por un sólo represor o por un sólo inductor.
Por ejemplo, para sintetizar histidina se necesita un grupo de enzimas. Todas se encuentran
codificadas en los genes ocupando locus vecinos.
operador
z
x
a
b
codifican las síntesis de histidina
Este grupo de genes relacionados constituyen un operón; o sea que el operón se encuentra
codificando todas las enzimas que participan en la biosíntesis de histidina.
¿Cómo se reprime un operón completo actuando un represor?
Cuando el represor se une al operador no se sintetiza ninguna de las enzimas del operón. Si se
elimina el represar se sintetizan todas las enzimas que codifica el operón.-
BIBLIOGRAFIA
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