endocitosis mediada por receptor

ENDOCITOSIS
Las células eucarióticas poseen un mecanismo mediante el cual
pueden incorporar moléculas del exterior llamado ENDOCITOSIS,
y otro mecanismo para secretar moléculas al exterior llamado
EXOCITOSIS.
Ambos mecanismos están compuestos por un sistema complejo de trafico de vesículas
que involucra la membrana celular y las membranas del ER (retículo endoplásmico) y el
aparato de Golgi, entre muchas otras.
Verde: vía biosintetica
Rojo: vía secretora
Azul: vía de recuperación
El proceso de endocitosis involucra la internalización de
parches de membrana plasmática por distintos mecanismos
El destino del material endocitado depende, en parte, del mecanismo de endocitosis involucrado.
Gaitan, Cell 2003
Las células internalizan fragmentos de su membrana plasmática en forma de
pequeñas vesículas y en un proceso continuo.
Existen dos formas principales de endocitosis:
Pinocitosis: internalización de pequeñas
macromoléculas y fluidos extracelulares. (<150 nm de
diámetro)
Fagocitosis: ingestión de partículas grandes
como microorganismos o debris celular. (> 250nm de
diámetro)
Todas las células eucarióticas están continuamente
ingiriendo fluidos y moléculas por pinocitosis, solo
células especializadas (fagocíticas: macrófagos,
neutrófilos) ingieren partículas grandes.
La tasa de internalización de membrana plasmática
difiere entre células; los macrófagos y fibroblastos
internalizan el equivalente al 100% de su membrana
plasmática cada 30 y 120 min, respectivamente.
El área de la membrana plasmática y el volumen de las
células permanece constante durante el proceso activo de
endocitosis, lo cual implica que es balanceado por un proceso
inverso denominado exocitosis (es un proceso mediante el
cual las vesículas internas de la célula se fusionan con la
membrana plasmática para secretar fluidos o material)
ENDOCITOSIS
membrana
EXOCITOSIS
membrana
PINOCITOSIS
La mayoría de las células eucarióticas incorporan
continuamente fluidos y solutos por medio de pinocitosis.
Gran cantidad de la membrana plasmática de la célula es
incorporada dentro de ella por endocitosis y retorna a la
superficie celular por exocitosis.
El tipo de pinocitosis más estudiada es la denominada
endocitosis mediada por receptor, en donde se internalizan
moléculas específicas selectivamente. Estas moléculas se
encuentran en el espacio extracelular en concentraciones
bajas, como pueden ser hormonas, factores de crecimiento,
anticuerpos, hierro, enzimas, vitaminas y colesterol.
Las moléculas específicas que son internalizadas se pegan a
proteínas denominadas receptores, que están localizadas en
el exterior de la superficie celular y poseen un sitio específico
de pegado a la molécula.
Una vez que la molécula se pega a su receptor, estos se
mueven en la membrana plasmática y se concentran en
pequeñas depresiones llamadas clathrin-coated pits.
Estas depresiones son invaginaciones de la membrana celular
y se encuentran cubiertos por una proteína denominada
clatrina. Estas invaginaciones son utilizadas para la vía
endocítica, en donde macromoléculas específicas son
incorporadas dentro de la célula.
LAS INVAGINACIONES DE CLATRINA
OCUPAN EL 2% DE LA MEMBRANA
PLASMATICA.
LAS VESICULAS (RECUBIERTAS DE
CLATRINA) SE FORMAN EN 1 MINUTO Y EN
SEGUNDOS SE FUSIONAN CON LOS
ENDOSOMAS TEMPRANOS.
EN FIBROBLASTOS SE FORMAN 2500
VESICULAS POR MINUTO
Cuando se desprenden las vesículas de la membrana
plasmática y se liberan al espacio intracelular, se remueve la
cubierta de clatrina.
Las vesículas que aun transportan los receptores y las
moléculas unidas específicamente se fusionan con la
membrana de otra organela denominada endosoma.
La función de los endosomas es empaquetar a las moléculas
en nuevas vesículas y “enviarlas” a diferentes lugares dentro
de la célula.
Endocitosis mediada por
vesículas cubiertas con clatrina
microscopía electrónica
Lodish et al, MCB 2004
Clatrina
Proteína que facilita la endocitosis de receptores en vesículas pequeñas (>0.1 µm de
diámetro) formando y reorganizando una “capa” sobre la cara citoplasmática de la
membrana.
Formación de vesículas cubiertas con clatrina en la
membrana celular
Secuencia de eventos moleculares durante la endocitosis
mediada por vesículas de clatrina
Proteínas adaptadoras se asocian a la membrana, reclutan proteínas cargo y clatrina.
Dinamina media la fisión de la vesícula con hidrólisis de GTP. Proteínas accesorias
desensamblan la cubierta en un proceso que depende de la hidrólisis de ATP.
ATP hidrólisis
GTP
hydrolysis
Gundelfinger, NRMCB 2003
Proteínas adaptadoras reconocen señales de endocitosis
en el tallo citosólico de proteínas de transmembrana
señales reconocidas por proteínas adaptadoras citosólicas
AP2 NPXY
ej. integrinas, receptor de LDL
AP2 YXXØ
ej: receptores de transferrina, M6P
AP2 LL
ej: caderinas, receptor de Fc
Eps ubiquitina ej: EGFR, E-caderinas
AP2
N: Asn
P: Pro
Y: Tyr
L: Leu
X representa cualquier aminoácido
Ø representa un residuo hidrofóbico
Distintos compartimientos
o "estaciones" del flujo
vesicular endocítico
La distinción de endosomas tempranos y
tardíos se basa en el tiempo post
internalización, localización subcelular,
pH, y en la presencia de proteínas
marcadoras.
MT
pH6
pH5
Las moléculas internalizadas pueden reciclar tanto
a partir de endosomas tempranos como tardíos.
Los cuerpos multivesiculares se forman por la
invaginación de la membrana de los endosomas
tardíos.
El transporte endocítico depende de
microtúbulos (MT)
pH4.5
Sorkin & Zastrow, NRMCB 2002
Destino de las proteínas
endocitadas
reciclado de receptores
reciclado de receptores y sus ligandos
desensibilización y reciclado de receptores
degradación en lisosomas
La diferencia en los receptores incorporados en la célula mediante
el proceso de endocitosis mediada por receptor es que una vez
que liberan las moléculas que transportaron y que abandonan el
endosoma pueden dirigirse a diferentes destinos. No como ocurre
durante la fagocitosis en donde todo el material que entra a la
célula termina en los lisosomas para su degradación
Reciclado de receptores
Un ejemplo de endocitosis mediada por receptor es la
incorporación de colesterol en células de mamíferos.
Este descubrimiento fue realizado por Michael Brown y
Joseph Goldstein, quienes estudiaban la internalización
del colesterol en células del torrente sanguíneo. Dicho
estudio fue galardonado con el Premio Nobel en
Medicina en el año 1985.
El colesterol sanguíneo es transportado en
complejos lipoproteicos = partículas de LDL
(low density lipoprotein)
Cuando las células necesitan colesterol para la síntesis de
membrana, sintetizan el receptor de LDL que es una proteína de
transmembrana. Estos receptores se localizan en las
invaginaciones (“pits”) de clatrina y al unir LDL comienza la
endocitosis.
Una fracción de la membrana endocitada retorna a la superficie (reciclado). El
receptor de LDL es reciclado mas de 100 veces antes de ser degradado. Cada ciclo
dura ~10-20 min.
Reciclado de receptores
Las partículas de colesterol LDL se unen a
receptores de LDL en la superficie de las
células y son endocitadas en vesículas de
clatrina. El receptor LDL posee la señal de
endocitosis NPXY la cual es reconocida por
partículas AP2 y clatrina.
Los receptores endocitados se disocian de
las partículas LDL en el medio ácido de los
endosomas tardíos y son reciclados a la
superficie.
N: Asn
P: Pro
Y: Tyr
Las partículas de LDL son transportadas al lisosoma en
donde enzimas digestivas las degradan en aminoácidos,
colesterol y ácidos grasos. Luego el colesterol es liberado al
citoplasma donde es utilizado para la síntesis de membrana
nueva.
Cuando se acumula colesterol en la célula se apaga la
síntesis del receptor LDL dentro de la célula.
Aderem, Alan, and David M. Underhill. "Mechanisms of Phagocytosis in Macrophages." Annual Review of
Immunology 17 (1999): 593–623.
Alberts, Bruce, et al. Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Publishing, 2000.
Mukherjee, Sushmita, Richik N. Ghosh, and Frederick R. Maxfield. "Endocytosis." Physiological Reviews
77 (1997): 759–803.
Schmid, Sandra L. "Clathrin-Coated Vesicle Formation and Protein Sorting: An Integrated Process."
Annual Review of Biochemistry 66 (1997): 511–548.
Reciclado de
receptores y ligandos
Las células incorporan hierro a través
de la endocitosis mediada por receptor
de ferro-transferrina. En el medio ácido
de los endosomas tardíos el hierro se
disocia y se exporta al citosol.
La apotransferrina y su receptor
permanecen unidos y son reciclados a
la superficie, donde se disocian.
Desensibilización y reciclado
de receptores
EGF
auto
phosphorylation
Los receptores unidos al EGF se
autofosforilan y activan vías de señalización
intracelulares.
Los receptores se endocitan en vesículas
con clatrina.
En los endosomas tempranos una fracción
de los receptores son defosforilados y
reciclados a la superficie.
EGF: epidermal growth factor
Sorkin & Zastrow, NRMCB 2002
dephosphorylation
Transporte de receptores y ligandos a lisosomas
Endosomas tempranos que transportan proteínas endocitadas (azul) y vesículas que transportan
proteínas lisosomales desde el trans-Golgi (rojo y verde) se fusionan con endosomas tardíos. Las
proteínas a ser degradadas se internalizan por invaginación formando cuerpos multivesiculares.
Eventualmente, los cuerpos multivesiculares se fusionan con lisosomas.
la internalización de receptores
tirosina kinasas (EGFR) en los
cuerpos multivesiculares impide
su reciclado y termina la
señalización.
citosol
Sorkin & Zastrow, NRMCB 2002
La mono-ubiquitinilación actúa como una señal
de direccionamiento al lisosoma
Receptores tirosina kinasa activados (ej. EGFR), E-caderinas, etc. pueden ser monoubiquitinados por E3ubiquitina ligasas (ej. Cbl). Esto constituye una señal que es reconocida por proteínas adaptadoras (ej. Eps15,
Hrs, STAM) que contribuyen a concentrar los receptores en cuerpos multivesiculares (MVB) y a su degradación
en lisosomas.
Mosesson / Yarden, IMAJ 2006
FAGOCITOSIS
La fagocitosis es un tipo de endocitosis en donde se
ingieren partículas grandes o microorganismos enteros. Es
un proceso mediado por actina. Extensiones de la membrana
plasmática envuelven el material ingerido formando vesículas
grandes llamadas FAGOSOMAS.
Eucariontes unicelulares (Protozoa) se alimentan a través de
este medio, mientras que los animales superiores poseen
células especializadas para tal fin como los macrófagos o
neutrófilos.
Estas células ingieren microorganismos y también están
involucradas en la limpieza de células apoptóticas o
senescentes.
Neutrófilos: se encuentran en gran cantidad en
sangre, pueden entrar rápidamente a los tejidos y
fagocitan patógenos durante una inflamación aguda.
Macrófagos: están fuertemente relacionados con los
monocitos en sangre, estas células predominan en
inflamaciones crónicas.
Células dendríticas y linfocitos B: la fagocitosis en
estas células es importante durante la elaboración de
una respuesta inmune específica y no durante la
destrucción directa del patógeno
La fagocitosis consiste en la ingesta de partículas
grandes a partir de la formación de pseudópodos
Microscopía electrónica de barrido de un macrófago fagocitando dos eritrocitos.
Las flechas señalan los bordes de las extensiones citoplasmáticas ricas en
actina denominadas pseudópodos, que engolfan los eritrocitos.
Alberts et al., MBC 2002
Microscopía electrónica de un neutrófilo fagocitando una
bacteria, que está en proceso de división.
Existe fagocitosis de:
Microorganismos
Partículas insolubles
Células dañadas o muertas
Debris celular
Diferentes etapas durante la fagocitosis
Quimiotaxis
Adherencia
Formación de pseudópodos
Formación del fagosoma
Formación del fagolisosoma
La fagocitosis se inicia por el pegado de partículas
(material inerte, microorganismos o células muertas) a
receptores en la superficie celular, posiblemente a
extensiones cortas, “pseudopodos”, presentes en la
superficie de células como pueden ser los macrófagos.
Posteriormente los eventos rápidos de señalización promueven la
reorganización del citoesqueleto (mayoritariamente actina) y como
consecuencia la extensión de los pseudopodos. A pesar que la mayoría de
los modelos de fagocitosis proponen a la membrana plasmática como la
principal fuente de membrana para la formación de los fagosomas
(proceso de invaginación) (Aa) se ha demostrado que otras
endomembranas también contribuyen a este proceso.
Los endosomas reciclados, que son reclutados a la superficie
celular mediante el proceso denominado exocitosis (Ab), han
sido identificados como potencial fuente de membrana para la
formación de los fagosomas.
También se ha demostrado que otra importante fuente de membrana que
está involucrada en la fagocitosis es el retículo endoplásmico (ER), en un
proceso denominado fagocitosis mediada por ER (Ac). Existen muchos
trabajos en donde se muestra que las proteínas que usualmente están en la
membrana plasmática o en los endosomas reciclados (Rab4 y Rab11) y en
ER (calreticulina y calnexina) también están presentes en los fagosomas
indicando la potencial participación de estas membranas en la fagocitosis.
En algunos casos se demostró que los lisosomas también se fusionan con la
membrana plasmática durante la fagocitosis (Ad). Se pudo observar que en
algunos fagosomas se encuentran asociadas proteínas lisosomales (LAMP)
y proteínas reticulares (calnexina) lo que indica que ambas organelas
participaron en la contribución de membrana para la biogénesis de dicho
compartimiento.
Luego de su formación, los fagosomas maduran en fagolisosomas mediante una serie
de eventos de fusión con endosomas tempranos (EE), endosomas tardíos (LE) y
lisosomas (Ly). Este proceso de maduración permite a los fagosomas adquirir
propiedades microbicidas y la habilidad de procesar antígenos.
Factores importantes que ayudan a destruir
microorganismos en los fagolisosomas
Proteínas NADPH oxidasa: están en las membranas de los
fagolisosomas y generan radicales oxígeno que reaccionan con proteínas,
lípidos y otras moléculas biológicas.
Oxido nítrico: reacciona con radicales oxígeno y generan moléculas que
dañan otras moléculas biológicas.
Proteínas antimicrobianas: proteasas, elastasas. Son esenciales para
eliminar varias bacterias. Otra proteína antimicrobiana es la lisosima que actúa
sobre la pared celular de algunas bacterias gram positivas.
Péptidos antimicrobianos: defensinas y otros péptidos. Atacan la
membrana celular de la bacteria.
Transportadores de hidrógeno: acidifican el fagolisosoma provocando la
eliminación de varios microorganismos. También activan proteasas
Algunos patógenos intracelulares
que han coexistido durante largos
períodos de tiempo con su
huésped han desarrollado diversas
estrategias para escapar a los
mecanismos defensivos de sus
huéspedes, como por ejemplo la
degradación en fagolisosomas.
- mycobacteria, Salmonella y la forma promastigote de Leishmania alteran la maduración del fagosoma
inhibiendo la fusión con LE y Ly (no hay degradación ni muerte de los microorganismos).
-Coxiella y la forma amastigote de Leishmania sobrevive dentro de los fagolisosomas.
- Brucella y Legionella pueden inducir fusión de la membrana plasmática del fagosoma con elementos de la
vía biosintetica permitiendo su replicación en compartimientos con características de ER.
Endocitosis independiente de clatrina
Microscopía electrónica de caveolas
membrana
plasmática
100 nm
vesícula con
clatrina
caveolas
Las caveolas están presentes en la mayoría de las células. Se forman en dominios especializados de la
membrana plasmática ricos en colesterol, glicoesfingolípidos y proteínas unidas por GPI (glico fosfatidil inositol)
denominados "lipid rafts".
Caveolina: es la principal proteína estructural de las caveolas. La selección del cargo esta determinada por la
composición lipídica de la membrana de la caveola.
Acoplamiento entre exocitosis y endocitosis en el terminal pre-sináptico
1. Los neurotransmisores (rojo) son almacenados en vesículas sinápticas que se acumulan ancladas a la membrana.
La fusión de membranas es prevenida por la proteína sinaptotagmina.
2. En respuesta a potenciales de acción, se abren canales de calcio, sinaptotagmina une calcio y altera su conformación,
permitiendo la fusión de las vesículas y la liberación de los neurotransmisores al espacio sináptico.
3. Endocitosis acoplada recicla los transportadores de neurotransmisores.
4. Recarga de las vesículas con neurotransmisores.
Lodish et al, MCB2004
Coordinación de eventos de endocitosis y exocitosis
La unión de insulina a su receptor genera señales intracelulares que promueven la translocación
de endosomas especializados conteniendo GLUT4 a la membrana plasmática. La expresión del
GLUT4 en la superficie promueve la captación de glucosa.
adipocito o célula muscular
GLUT4
GLUT4
endosoma de
reciclado
Autofagocitosis
Autofagocitosis o Autofagia es
el término que se utiliza para
la degradación de
componentes citoplasmáticos
en los lisosomas.
Pasos secuenciales de la autofagia
Secuestro de material
(transporte a los lisososmas)
Degradación
Generación de aminoácidos / péptidos
(utilización de los productos obtenidos)
Cada uno de estos pasos cumple diferentes funciones de acuerdo en el contexto
celular en el que se encuentre.
Existen tres tipos principales de autofagia
- Microautofagia
- Macroautofagia
-Autofagia mediada por chaperonas
Microautofagia: es la invaginación directa de
materiales a los lisosomas.
Lisosoma
autofagosoma
o vacuola
autofagica (AV)
Half-life of AV ~10min
Mizushima N. et al 2007
Macroautofagia: es el secuestro de organelas o de proteínas en una
vesícula de doble membrana llamada autofagosoma o vacuola
autofagica (AV) dentro de la célula. La membrana externa del
autofagosoma se fusiona con el lisosoma en el citoplasma para
formar el autofagolisosoma o autolisosoma en donde se degrada su
contenido a partir de las hidrolasas lisosomales.
Lisosoma
autofagosoma
o vacuola
autofagica (AV)
Half-life of AV ~10min
Autofagia mediada por chaperonas (CMA): es el
término que se utiliza para describir la degradación de
proteínas citosólicas específicas que contienen una
secuencia peptídica determinada. Las chaperonas se
unen a estas proteínas y las transportan a los
lisosomas por medio de un receptor. (este es un
proceso selectivo y sólo involucra proteínas, no
transportan organelas, contrariamente a la autofagia
en donde el sistema de degradación es en general no
selectivo).
Lisosoma
autofagosoma
o vacuola
autofagica (AV)
Proteína 31Atg
Half-life of AV ~10min
Mizushima N. et al 2007
Uno de los principales factores que es considerado como
disparador del proceso de autofagia es la reducción de
nutrientes.
Levaduras: falta de nitrógeno es el principal estimulo para
inducir autofagia.
Plantas: falta de nitrógeno y carbono.
Mamíferos: sistema altamente complicado. Depleción total de
aminoácidos. Efecto individual de los aminoácidos. Depende
el tipo de célula.
Aun no se conoce como censan la falta de alguno de los aminoácidos.
(candidato: GCN2, proteína kinasa de pegado a tRNA)
Mizushima N. et al 2007
Otra postura es la que considera que la autofagia debería
estar regulada por un sistema altamente organizado.
Se cree que el sistema endocrino, en particular la insulina,
regula la autofagia in vivo. (Autofagia en hígado es suprimida
por insulina y aumentada por glucagon).
También contribuyen a la regulación de la autofagia otras
hormonas y factores de crecimiento.
Mizushima N. et al 2007
DEGRADACIÓN y REUTILIZACIÓN
Una vez que el material es degradado en los lisosomas /
vacuolas, las unidades monoméricas (ej. Aminoácidos) son
exportados al citosol para ser reusados.
Atg22 (levaduras)
Avt3, Avt4 (levaduras) SLC36A1 / LYAAT-1 transportador lisosomal de
aminoácidos (mamíferos).
Aun no se conoce contribución de la autofagia para la
reutilización de lipidos y carbohidratos.
Autofagia es una vía de degradación lisosomal que es
escencial para la sobrevida, la diferenciación, el desarrollo
y el mantenimiento de la célula.
Autofagia cumple principalmente un rol adaptativo de
proteger a los organismos de diversas patologías, como
pueden
ser
infecciones,
cancer,
enfermedades
neurodegenerativas.
Sin embargo, esta función puede ser
destructiva o nociva para el organismo.
Excesiva degradación por autofagia causa
muerte celular.
Control de calidad
Eliminacion de exceso de organelas no necesarias (peroxisomas, mitocondrias)
Streptococcus, Shigella, Mycobacterium. Algunos microorganismos (Brucella,
Legionella) utilizan la via autofagica para sobrevivir. (vacuolas protectivas)