DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DE PERDIZ MEDIANTE CARACTERIZACIÓN DE SNPS SNPS CHARACTERIZATION TO DISTINGUISH PARTRIDGE SPECIES García, C.B. y M.V. Arruga* Laboratorio de Citogenética y Genética Molecular. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza. Miguel Servet, 177. 50013. Zaragoza. España. *Autor correspondencia: mvarruga@unizar.es PALABRAS CLAVE ADICIONALES Perdiz roja. Perdiz chukar. RFLP. RT-PCR. ADDITIONAL KEYWORDS Red-legged partridge. Chukar partridge. RFLP. RT-PCR. RESUMEN Se han buscado metodologías capaces de diferenciar genéticamente la perdiz roja (Alectoris rufa) de otras especies de perdiz que hibridan con ella (principalmente perdiz chukar, A. chukar) y pueden por tanto poner en peligro la subsistencia de la perdiz roja. Los procedimientos empleados en el presente trabajo se basan en la detección de polimorfismos de una única base nucleotídica (SNPs). Cuando el nucleótido diferente para las distintas especies forma parte del sitio de restricción se detecta mediante el empleo de enzimas de restricción (RFLP). Otra alternativa es la discriminación alélica con PCR a tiempo real (RT-PCR) mediante el empleo de sondas marcadas con fluorocromos diferentes para el alelo de cada especie. Ambas metodologías han demostrado su eficacia en la diferenciación de especies e incluso en la identificación de híbridos tanto en ejemplares silvestres como en aquellos criados en cautividad. SUMMARY Genetic methodologies to distinguish between red-legged partridge (Alectoris rufa) and other partridge species that hybridise with it (mainly chukar partridge or A. chukar) have been developed to protect the survival of the species. The procedures used in this work are for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs). RFLP methodology is used when the polymorphism is in a restriction site of a specific restriction enzyme. Real-time PCR (RT-PCR) allows the allelic discrimination using fluorescent probes with different markers for the allele of each species. Both methodologies are efficient to distinguish both species and to identify hybrids between them in wild animals and captive reared partridges. INTRODUCCIÓN La perdiz roja (A. rufa) es un ave del Orden Galliformes, Familia Phaisanidae, que habita principalmente en la Península Ibérica, Sur de Francia y algunos puntos del Norte de Italia y Sur de Inglaterra (Randi et al., 1992). Además de la importancia cinegética y económica, forma parte de la cultura y tradición de nuestro país y es parte integrante de numerosos ecosistemas. Arch. Zootec. 56 (Sup. 1): 403-408. 2007. GARCÍA Y ARRUGA El número de perdices en su medio natural ha ido disminuyendo por diferentes causas y la producción en cautividad se ha convertido en referente fundamental para el mantenimiento de la especie. Un grave problema existente es la hibridación con otras especies de perdiz (principalmente perdiz chukar o A. chukar). Legalmente (Ley 4/1989, de 27 de Marzo, de conservación de los espacios naturales y de la flora y fauna silvestre) sólo se permite la suelta o repoblación con ejemplares de perdiz roja (A. rufa) y poder identificar a los ejemplares híbridos es de interés para los criadores de la especie para evitar las repoblaciones y sueltas con dichos individuos. La imposibilidad de detección de híbridos por su apariencia externa ha hecho imprescindible el desarrollo de pruebas genéticas con tal finalidad. En el laboratorio de Citogenética y Genética Molecular de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza se buscan desde hace ya varias décadas marcadores genéticos que permitan diferenciar la perdiz roja de otras especies de perdices, así como los híbridos entre ellas. Ya se han desarrollado diversas metodologías capaces de alcanzar dicho objetivo (Arruga et al., 1996, 1998; Saz et al., 1998; García y Arruga, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006a, 2006b) pero se continúa con el estudio de estas especies incorporando las nuevas metodologías que van surgiendo y permiten una identificación de híbridos de forma actual y rápida. Se ha elegido la búsqueda de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) como técnica de estudio debido a su abundancia en el genoma ya que estos Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 404. marcadores son heredados más establemente que otros como las secuencias repetidas (Landegren et al., 1998; Brookes, 1999). Para la identificación de estos polimorfismos de un único nucleótido se parte de información de secuenciación de otras especies aviares, principalmente de pollo, que además de ser la especie aviar más estudiada genéticamente, se ha comprobado que tiene una alta homología cromosómica con la perdiz roja (Kasai et al., 2003). Para la posterior detección de los SNPs identificados se emplean dos procedimientos: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) y RT-PCR (Real-Time PCR). MATERIAL Y MÉTODOS Se extrae DNA de 468 perdices rojas silvestres, 22820 criadas en granja (pertenecientes a 26 granjas distribuidas en toda la Península y las islas Baleares), 142 perdices chukar de distintas procedencias (España, Argentina, Chipre, Cerdeña y Grecia) y de 4 ejemplares híbridos de perdiz roja y perdiz chukar obtenidos por cruzamiento directo. Los 15 SNPs utilizados han sido previamente identificados por secuenciación directa y en su caracterización se han empleado dos metodologías: La PCR-RFLP y la RT-PCR. La PCRRFLP es una técnica cuyas primeras referencias datan de publicaciones en 1979 y 1980 (Kiko et al., 1979; Reilly y Thomas, 1980). El SNP forma parte de la secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción y se puede usar ésta para detectarlo. Tras la am- CARACTERIZACIÓN DE SNPS EN PERDICES plificación por PCR del fragmento analizado, se digiere el producto con la enzima de restricción específica. Si se produce la digestión o no, se puede M C H R C H 1000 pb 500 pb inferir la existencia o no de dicho nucleótido diferente en ambas especies. En el caso de RT-PCR se realiza una discriminación alélica mediante un termociclador a tiempo real usando sondas Taqman ® marcadas con fluorocromos diferentes para cada alelo (Johnson et al., 2004; Llambí et al., 2006). Con las secuencias de las perdices, se han diseñado cebadores convencionales específicos del gen que hibriden en ambas especies y sondas marcadas con fluorocromos diferentes para A. rufa y A. chukar. 400 pb 300 pb Figura 1. Imagen de un gel de agarosa a una concentración de 1,5% en la que se observa el producto de PCR y posterior digestión con enzima de restricción. Las calles C, R y H corresponden a perdices chukar, rojas e híbridas respectivamente. Se ha señalado con una flecha la banda diagnóstica que permite diferenciar las perdices chukar e híbridas de las perdices rojas. (Image o f a 1.5% concentrated agarose gel in which PCR products of gene A amplification and digestion with restriction enzyme are observed. Lanes marked as C, R and H corresponded to lanes where digested PCR products of chukar partridges, red-legged partridges and detected hybrids respectively. Diagnostic band that allows to differentiate chukar and hybrid partridges from the red ones is shown with an arrow and corresponds to the digestion band of the PCR product with the restriction enzyme). RESULTADOS Mediante PCR-RFLP el alelo de perdiz chukar es el reconocido por la enzima de digestión por tanto, sólo ocurrirá el corte en perdices chukar puras o en híbridos de perdiz roja con esta otra especie (figura 1). Durante la realización de la reacción de RT-PCR con las sondas TaqMan® marcadas fluorescentemente, FAM para perdiz roja y VIC para perdiz chukar, se observa el aumento de fluorescencias para cada una de las muestras en los sucesivos ciclos. Si únicamente aumenta la fluorescencia de FAM el ejemplar es una perdiz roja pura y si aumenta la de VIC es una perdiz chukar. Si aumentan ambas fluorescencias la muestra corresponde a una perdiz híbrida (figura 2). Se han detectado ejemplares híbridos tanto en los ejemplares silvestres distribuidos por diferentes puntos de España como en las granjas analizadas. Los porcentajes de hibridación han resultado diferentes según la localización de origen de las muestras, Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 405. GARCÍA Y ARRUGA ducto de PCR, la identificación alélica manual y la falsa identificación alélica por una digestión enzimática incompleta. Entre las principales aplicaciones de las metodologías descritas destacan la comprobación de existencia de ejemplares híbridos en las poblaciones silvestres y en las criadas en granjas, así como la identificación de los ejemplares híbridos para que los productores puedan eliminarlos de sus granjas como reproductores y finalmente la posibilidad de averiguar el porcentaje de hibridación en la granja. En las diferentes granjas estudiadas se han encontrado porcentajes de hibridación muy distintos, por lo tanto conviene encontrando una gran variabilidad en los mismos. DISCUSIÓN Ambas metodologías (RFLP y RTPCR) han demostrado ser pruebas efectivas para la identificación de ejemplares híbridos y complementan la información obtenida con otros marcadores (Arruga et al., 1996, 1998; Saz et al., 1998; García y Arruga, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006a, 2006b). La realización de RT-PCR supera muchos problemas asociados con RFLP como que evita la manipulación de pro- Homocigoto alelo roja Heterocigoto Homocigoto alelo chukar Figura 2. Discriminación alélica de las muestras de perdiz por el aumento de fluorescencia durante la realización de RT-PCR.. (Allelic discrimination of partridge samples with different increases of fluorescences during RT-PCR reaction). Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 406. CARACTERIZACIÓN DE SNPS EN PERDICES estudiar cada caso en concreto. Se puede evitar la desaparición de la perdiz roja en pureza, que todavía está en nuestras granjas y en el campo, asegurando que las sueltas o repoblaciones se realicen con animales de origen conocido y certificado genéti- camente como ausente de hibridación. Para los productores de perdiz roja, eliminar los individuos híbridos de entre sus reproductores, les aporta un valor añadido a sus productos de venta además de ayudarles a cumplir con la legislación vigente. BIBLIOGRAFÍA Arruga, M.V., M.T. Tejedor, M.R. Villaroel, A. Heriz, E. Ferreira and F.J. Abenia. 1996. Genetic studies of Alectoris rufa and A. graeca in Spain. Arch. Zootec., 45: 339-344. Arruga, M.V., M.T. Tejedor, J. Saz, L.V. Monteagudo y M. Villarroel. 1998. Avances en la determinación de la pureza genética de la perdiz roja. II Jornadas técnicas PROGALTER. Expoaviga, 98: 9-14. Brookes, A.J. 1999. The essence of SNPs. Gene, 234: 177-186. García, C.B. y M.V. Arruga. 2002. Contribución al conocimiento de la base genética de la perdiz roja española. V Congreso de la Sociedad Española para los Recursos Genéticos Animales y III Congreso Ibérico sobre Recursos Genéticos Animales. ISSN: BAG 16660390. García, C.B. y M.V. Arruga. 2003. Estudios genéticos en perdiz roja española (Alectoris rufa L.). ITEA, 24: Tomo II: 543-545. García, C. B. y M. V. Arruga. 2004. Aplicación del estudio de DNA al conocimiento de la estructura genética de la perdiz roja (Alectoris rufa, L.). Veterinaria, 39: 61-64. García, C.B. and M.V. Arruga. 2005. Advances in DNA analysis by RAPD methodology in a little studied genetically avian species (Alectoris rufa, L.). Poultry Avian Biol. Rev., 16: 81-86. García, C. B. and M. V. Arruga. 2006a. Application of RAPD methodology to preserve the purity of wild red-legged partridges (Alectoris rufa, L.). Wildlife Biol. Practice, 2: 13-16. García, C.B. and M.V. Arruga. 2006b. Comparative genetic analysis between red-legged partridges (Alectoris rufa) and chukar partridges (A. chukar): identification of single-nucleotide polymorphisms. Anim. Res., 55: 335-342. Johnson, V.J., B. Yucesoy and M.I. Luster. 2004. Genotyping of single nucleotide polymorphisms in cytokine genes using realtime PCR allelic discrimination technology. Cytokine, 27: 135-141. Kasai, F., C.B. García, M.V. Arruga and M. Ferguson-Smith. 2003. Chromosome homology between chicken (Gallus gallus domesticus) and the red-legged partridge (Alectoris rufa); evidence of the occurrence of a neocentromere during evolution. Cytogenet. Genome Res., 102: 326-330. Kiko, H., E. Niggermann and W. Ruger. 1979. Physical mapping of the restriction fragments obtained from bacteriophage T4 dc-DNA with the restriction endonucleases SmaI, KpnI and BglII. Mol. Gen. Genet., 172: 3003-3012. Landegren, U., M. Nilsson and P-Y. Kwok. 1998. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis. Genome Res., 8: 769-776. Llambí, S., C.B. García y M.V. Arruga. 2006. Una nueva era para el diagnóstico genético en salud y producción animal. Albéitar, 93: 3234. Randi, E, P.U. Alkon and A. Meriggi. 1992. A new model of Alectoris evolution based on biochemical analysis. Gibier Faune Sauvage, Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 407. GARCÍA Y ARRUGA 9: 661-666. Reilly, J.G. and C.A. Thomas Jr. 1980. Lenght polymorphisms, restriction site variation, and maternal inheritance of mitochondrial DNA of Drosophila melanogaster. Plasmid, 3: 109- Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 408. 115. Saz, J., M.V. Arruga, M.T. Tejedor, M. Villarroel and D. Savva. 1998. Genetic differentiation in Alectoris rufa and A. graeca from Spain. Hungarian J. Anim. Product., 48: 86-89.