[S]/v

Cinética enzimática
CONCEPTO DE ENZIMA
• Los enzimas son catalizadores muy potentes y
eficaces, químicamente son proteínas. Como
catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad
y se recuperan indefinidamente.
• No llevan a cabo reacciones que sean
termodinámicamente desfavorables (no varian el ∆Gr),
no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino
que aceleran su consecución.
aumenta la fracción de moléculas que tienen las energía
suficiente para alcanzar el estado de transición
Continuación…
• Las enzimas, a diferencia de los catalizadores
inorgánicos catalizan reacciones específicas. Sin
embargo hay distintos grados de especificidad.
• La enzima sacarasa es muy específico: rompe el
enlace b-glucosídico de la sacarosa o de compuestos
muy similares.
• Entre los enzimas poco específicos están las
proteasas digestivas como la quimotripsina, que rompe
los enlaces amida de proteínas y péptidos de muy
diverso tipo.
NOMENCLATURA DE LOS ENZIMAS
– nombres particulares
– Nombre sistemático:
3 partes:
el sustrato preferente - el tipo de reacción realizado – terminación “asa“.
Ej: glucosa fosfato isomerasa que cataliza la isomerización de la glucosa-6fosfato en fructosa-6-fosfato. Si es hidrólisis, el segundo componente del
nombre se omite y por ejemplo, la lactosa hidrolasa se llama simplemente
lactasa.
– código de la comisión enzimática (enzyme comission): encabezado por las
letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro números separados
por puntos:
Clase . Subclase . grupos químicos específicos que intervienen en la reacción.
Clase 1: OXIDORREDUCTASAS
Clase 2: TRANSFERASAS
Clase 3: HIDROLASAS
Clase 4: LIASAS
Clase 5: ISOMERASAS
Clase 6: LIGASAS
Enzimas
Factores físicos y termodinámicos que desfavorecen
una Rx enzimática:
• Variación de entropía
• Capa de solvatación
Barreras superadas por
la ENERGÍA DE
FIJACIÓN
• Distorsión de los sustratos
• Alineamiento inadecuado
de los grupos funcionales
Energía procedente de
la interacción enzimasustrato
La enzima superóxido dismutasa (SOD) cataliza la dismutación de
superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno.
Simulación de la droga PPI a la proteina Src
quinasa: topología y cargas complementarias (sitios de
reconocimiento en regiones de unión de elem. de estr. secundaria)
Simulación de la droga PPI a la proteina Src
quinasa: topología y cargas complementarias (sitios de
reconocimiento en regiones de unión de elem. de estr.
secundaria)
El sitio activo involucra aminoacidos separados
en la secuencia primaria (ejemplo: lizosima)
Estructura y función de enzimas
Metodos de catálisis enzimatica
•
Provee una superficie de reacción (sitio activo)
•
Provee un entorno adecuado (hidrofóbico)
•
Permite el acercamiento de los reactivos
•
Posiciona a los reactivos correctamente para la reacción
•
Forma interacciones débiles con los reactivos
•
Provee catálsis ácida/básica
•
Provee nucleófilos
Unión al sustrato
Fuerzas de enlace
•
•
•
Ionicas
Pte de H
van der Waals
Ejemplo: Unión de piruvico a LDH
O
O
O
C
H3 C
H-Bond H
O
C
O
Interacciones posibles
H-Bond
van der Waals
Ionic
O
C
H3 C
vdw-interactions
Ionic
bond
C
O
H3N
Mecanismos catalíticos
Catálisis ácido/base
•
Histidine
+H
NH
N
NH
N
-H
H
No-ionizada
Actua como base
(sumidero de protones)
Ionizado
Actua como ácido
(fuente de protones)
Ataque nucleofílico
H3N
L-Serine
H
CO2
OH
H3N
H
CO2
SH
L-Cysteine
Estabilizacion de
este complejo
Mecanismo de la ribonucleasa pancreatica
Hidroliza polirribonucleótidos en los enlaces Py-X, siendo Py un
nucleótido pirimidínico (C, U) y X cualquier otro nucleótido.
Definiciones
•Consideramos una reacción arbitraria
aA+bBcC+dD
•Se define velocidad de reacción como:
1 d [ A]
1 d [ B ] 1 d [C ] 1 d [ D]
v



a dt
b dt
c dt
d dt
•Se llama ley de velocidad a:
v  f (T , composición)
El quid de la cuestión es
hallar esta f.
Debe determinarse
experimentalmente
Orden de reacción y constante de
velocidad
En muchos casos: v  k (T )[ A] [ B] [ F ] ...
k = constante de velocidad
de reacción.
 = orden de reacción respecto
al componente A.
 = orden de reacción respecto
al componente B.
 +  +…+  = orden total de
reacción.
Ejemplos sencillos
• Primer orden
f (T , composició n)  k[ R]
d [ R]
v
 k[ R]
dt
integrando
[ R]  [ R]0 e  kt
ln [ R]  ln [ R]0  kt
• Segundo orden
f (T , composició n)  k[ R]2
d [ R]
v
 k[ R]2
dt
integrando
1
1

 kt
[ R] [ R]0
Gráficos de primer orden
CH3NC  CH3CN
v= [CH3NC]
Gráficos de segundo orden
NO2 + CO  NO + CO2
v= [NO2]2
Para una reacción química común, la
velocidad en el tiempo cae debido a:
• Disminuye la concentración de reactivo
• La reacción inversa se hace importante al aumentar la [P]
• La reacción alcanza un equilibrio
PoS
tiempo
Para una enzima, la velocidad en el tiempo
cae debido a:
Disminuye la concentración de reactivo (sustrato)
• La reacción inversa se hace importante al aumentar la [P]
• El producto puede inhibir a la enzima
• Cambios de PH o temperatura pueden modificar a la
enzima en el curso de la reacción
• Al disminuir la [S] puede disminuir la saturación de la
enzima
Unidades de actividad enzimática
Unidad internacional: cantidad de enzima que cataliza la formación
de 1 micromol de producto por minuto en condiciones óptimas
Katal: cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 mol de
producto por segundo en condiciones óptimas.
La cantidad de una enzima entonces se expresa usando una
VELOCIDAD
La concentración de una enzima es la cantidad de enzima
(expresada en unidades) por unidad de volumen
La actividad específica de una enzima es la cantidad de enzima
(expresada en unidades) por miligramo de proteína
El mecanismo de Michaelis-Menten
La representación más utilizada, no es la más recomendable ya que da
impresiones extremadamente engañosas de los errores experimentales: así para
pequeños valores de v, pequeños errores en la medida de v, conducen a grandes
errores en 1/v, mientras que para valores grandes de v los mismo pequeños
errores en la medida de v conducen a errores apenas apreciables en 1/v.
1/v
1/[S])
2.2. Representación de Hanes
Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos,
1
1
Km 1 

 
  S 
 v V max V max S  
S  
v

Km
S

V max V max
S   
La representación de [S]/v frente a [S], da una recta:
v
y
=
Km   1 


S 
 V max   V max 
b
+
m
x
- Esta representación se conoce como representación de Hanes, representación de
Woolf o de Hanes-Woolf.
[S]/v
Pendiente = 1/Vmax
corta en el eje [S]/v en un punto = Km/Vmax,
corta en el eje [S] en un punto = - Km

m = tg = 1/Vmax
- Km
Km/Vmax
[S]
¿Cómo afectarán los errores de medida de la velocidad de reacción en esta
representación?
* En esta representación, como puede verse en la siguiente figura, los errores en [S]/v
son un reflejo mucho más fiel de los errores cometidos al medir el valor de v. Por este
motivo, la representación de Hanes es preferible a otras linealizaciones de la ecuación
de Michaelis-Menten.
[S]/v
[S]
2.3.Representación de Eadie-Hofstee.
1
1
Km 1 

 
  vV max
 v V max V max S  
Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax
obtenemos,
Vmax = v + (Km v)/[S]
y reordenando
v
v  V max  Km
S 
y =
b
-
m
x
Esta representación se conoce como representación de Eadie-Hofstee
v
Vmax
m = tg = -Km

Vmax/Km
v/[S]
La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:
- pendiente = -Km
- corte en el eje v = Vmax
- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km
Aspectos Positivos
v
Esta representación en general proporciona resultados
realmente buenos, ya que v aparece en ambas coordenadas
como factor multiplicativo, por lo que los errores cometidos en la
medida de v, harán que la curva se acerque o aleje del origen en
lugar de hacerlo paralelamente al eje de ordenadas.
Aspectos Negativos
v/[S]
Esta representación, contrariamente a la
de dobles inversos que hace aparecer
como buenos malos resultados, hace
aparecer como malos, buenos resultados,
dificultando grandemente el ocultamiento
de puntos que se desvíen de la recta.
Por lo que esta representación es la más adecuada para el
estudio de comportamientos que se desvíen del modelo de
Michaelis-Menten.
S 
k cat E 0

L v
S
S 0
KM
vS   K M   vmax 2
M
e
c
a
n
i
s
m
o
d
e
M
i
c
h
a
e
l
i
s
M
e
n
t
e
n
0
.
5
v
m
a
x
0
.
4
0
.
3
0
,
5
v
m
a
x
d[P]/t
L v  k cat E 0  vmax
0
.
2
0
.
1
0
.
0
K
M
0
1
0
2
0
[
S
]
3
0
Competicion de sustratos
KM y Vmax dependen del enzima y del sustrato
Supongamos 2 proteinas A y B hidrolizadas por el mismo enzima
Si las [A] y [B] son chicas ([A] <<KM,A y ([B] <<KM,B)
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA