Posibilidades de la Instrumentación Actual en UHPLC. Regina Orenga regina_orenga@non.agilent.com 1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity APORTACIONES CLAVE DE LA UHPLC • Reducir Tiempos de Análisis SIN reducir Resolución/Capacidad de Separación de picos. Reducir X 10/20 (1260/1290) veces con respecto a 5µm • Aumentar la Resolución/Capacidad de Separación de picos SIN incrementar tiempo de Análisis. • 1290/1260/1220: La importancia con gradientes de concentración de Trabajar a FLUJOS ELEVADOS para ganar RESOLUCIÓN. Doblar flujo en gradientes DOBLAR LA CAPACIDAD DE SEPARACIÓN DE PICOS • 1290/1260/1220 FLEXIBILIDAD: trabajar como UHPLC o HPLC’s incluso con columnas 4.6mm d.i. a flujos elevados • 1290/1260/1220 Facilidad de transferencia de métodos de HPLC (/UHPLC) de equipos antiguos. Page 2 ¿Qué UHPLC Agilent se Adapta Mejor a Sus Necesidades/ Presupuesto? • La selección del cromatógrafo depende del diámetro y longitud de las columnas de UHPLC que se quieran utilizar. 1220 Infinity 1260 Infinity - Modelo UHPLC 1290 Infinity Pres. Máx bars “Máxima” Longitud Columna UHPLC cm 1.8µm (TP)** Rango d.i. “Delay Columna mm Volume” Bomba µL mL/min Poroshell-120 1220 binario 1260 cuaternario 600 10 (15) cm 15 (20) 3-4.6 (16) 600-900 10 1260 binario 600 10 (15) cm 15 (20) 2.1-4.6 (8) 120 /600-800 5 1290 cuaternario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (16) <350 10 1290 binario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (8) 10 / 45 5 Coste + 2.7µm (SP)** Flujo máx. Página: 3 The Agilent 1200 Infinity Series HPLC 1200 Infinity Series 1260 Infinity 1220 Infinity 1290 Infinity PrepScale LC Low-flow Analytical flow Prep-flow LowFlow LC Isocratic, manual Cap.LC Binary Nano-LC Gradient, manual Binary Binary-SFC Chip-LC Gradient, automated Quaternary Quaternary Bio-Inert Isocratic Page 4 Isocratic Binary Quaternary Agilent 1200 Infinity Series HPLC Raising the Standard in HPLC – UHPLC for EVERY Lab 1220 Infinity LC 1260 Infinity LC 1290 Infinity LC Integracromatográfique s ted 600 bar, 5ml/min 80 Hz Most affordable HPLC and UHPLC 1260/1290 Technology Modular 600 bar, 5ml/min 80 Hz Modular 1200 bar, 5ml/min 160 Hz 2x or 10x UV Sensitivity 100% HPLC Compatible HPLC Price – UHPLC Capability 1st Universal LC by ISET Highest Performance HPLC Service Costs Page 5 The Agilent 1200 Infinity Series - Power range All analytical columns pressure Method Transfer 1200 Higher Resolution Faster Analysis 1000 More viscous solvents 1290 Infinity LC 800 Lower temperatures Semi-prep 600 400 1260 Infinity Binary LC 1260 Infinity Quat./Iso LC 1220 Infinity LC 200 0 0 Page 6 2 4 6 8 10 flow 1260 Infinity Bio-inert HPLC Infinitely Better for Bio-molecule Analysis 100% Bio-inert • Metal-free sample flow path (instrument and column) • Stainless steel–free solvent flow path • Widest pH range (1-13, short-term 14) 600bar power range • From lowest pressure up to highest pressure STM columns Semi prep 10ml/min When is this instrument recommended?? Page 7 1260 Infinity Bio-inert HPLC What´s new compared to our standard 1260 Infinity Quaternary LC Pump titanium based, no corrosion Active Seal included. Autosampler metal-free Capillaries and connections metal-free Detector Flow Cell metal-free pH-range 1-13, shortterm pH 14 600 bar (UHPLC) high resolution Bioseparations Advantatges: •Wide pH range • High salt tolerance • Lowest surface activity Bio-Inertness, no passivation needed 8 Target Applications Biologic Characterization Reverse Phase: Separation of Intact Biologics/Variants Size Exclusion: Aggregate Analysis 9 Ion Exchange: Separation of Isoforms Peptide Mapping: Post-translational modifications Agilent 1290 Infinity LC El UHPLC infinitamente mejor para cubrir todas sus necesidades en LC y LC/MS 1290 Infinity: ¿Qué aporta al mundo del UHPLC? 1290 Infinity NO solo es un equipo capaz de proporcionar unos rangos mayores de Flujo y de Presión… 1290 Infinity es un equipo INNOVADOR 1290 Infinity incorpora grandes avances en todos sus módulos, que una vez más, marca la diferencia tecnológica. Tecnología Bombas 1290 Infinity UHPLC - Máxima Potencia y Robustez Bombas UHPLC 1290 Infinity Robustez y alta capacidad de disipación de calor Nuevo material del pistón: SSiC* (Carburo de silicio sintético). Proporciona Mejor Conductividad térmica y menor fricción para menor desgaste. Permite una optima disipación de calor • Mayor presión x flujo (1200bar at 2 ml/min) • Alarga el tiempo de vida de los sellos/ intervalos de mantenimiento (>150L) • Un solo sello para fase normal y reversa SSiC*: Material cerámico de alta dureza formado por Carburo de Silicio sintético. Volumen Embolada variable (patentado) menor desgaste y mejores prestaciones. Capilares Multi-Capa para un óptimo intercambio de calor entre los cabezales de las bombas. 1290 Infinity Bomba Binaria: nuevo diseño La siguiente generación en Tecnología de Bombas UHPLC µ-Desgasificador Válvula de selección de 4 disolventes Gradientes binarios 4 Motores de alta precisión: independientes para cada pistón Mezclador “Jet Weaver“ Alta velocidad y resolución 1200 bar @ 2.0 mL/min 1000bar @ 3.5ml/min 800 bar @ 5.0 mL/min Volumen muerto: 10 µl / 45 µl Amortiguador electrónico de pulsos Bombas de alta resolución Canal Pistones de Carburo de Silicio A Intercambiador de calor multicapa Canal B Válvula de Purga automática Procesador de doble núcleo dedicado al control de pulsos Motores de 300 picolitros por paso (0.0003µL) Largos intervalos de mantenimiento Corrección Automática Fugas > 150 Litros de disolvente Automatismo Purga automática 1290 Infinity LC – Delay Volume and Mixing Noise - How to achieve lowest delay volume, lowest noise and highest RT precision? 1200 Series Solvent A 1200 Series Solvent B Passive Damper 180-580 µl Passive Mixer 400 µl Very Good Noise ~ 800 µl 1290 Inifinity Solvent A 1290 Inifinity Solvent B 5 µl / 40µl DV: Active Damping < 5µl + Microfluidic Mixing 35µl 80x / 20x lower = Lowest Noise < 50% Page 15 1290 Infinity Binary Pump Amortiguación electrónica de pulsos Motor del Pistón • Motores independientes OF O F N HPLC 1200 para cada pistón-> minimas oscilaciones en la linea de base • Pasos de 300 picolitros 1290 Inifinity 1290 Chanel UHPLC 1290 Inifinity A Chanel B Page 16 Agilent Jet Weaver: Nuevo sistema de mezclado Mezclador de alta eficacia. PLACA ACERO INOXIDABLE CON MICROCANALES DE 35µl de volumen La mas alta eficiencia de mezcla con el mínimo volumen para un bajo nivel de ruido • V=35 µl, para aplicaciones UV estándar. Tecnología: • Tecnología Propietaria de Microfluidos Multi-capa. • Bandas de difusión de acero con estructuras de (100x120µm) Page 17 La Historia de la Bomba Cuaternaria 1290 Infinity es una Historia sobre EXACTITUD!! Los 3 Puntos Cruciales para conseguir las máximas prestaciones en una bomba cuaternaria con mezclado a baja presión: 1. Conocer y tener muy bien caracterizados los eluyentes utilizados. La Historia de la Bomba Cuaternaria 1290 Infinity es una Historia sobre EXACTITUD!! Los 3 Puntos Cruciales para conseguir las máximas prestaciones en una bomba cuaternaria con mezclado a baja presión: 1. Conocer y tener muy bien caracterizados los eluyentes utilizados. 2. Disponer de una bomba inteligente – Amortiguación Activa – con una bomba de alta resolución (~300 pL por paso del motor) 3. Nuevo mezclador InletWeaver basado en la super-eficiente tecnología Jet Weaver: Premezcla el eluyente antes de entrar en el cabezal de bombeo Mezclador opcional situado después del cabezal de bombeo (sólo para condiciones muy críticas- p.e. TFA) La Bomba Cuaternaria 1290 Infinity ofrece la mayor exactitud y precisión en todo tipo de aplicaciones. Bomba Cuaternaria 1290 Infinity Herramientas que proporcionan sus elevadas Prestaciones 1. 4-channel Degasser 2. MCGV (MultiChannelGradient-Valve) 7 8 3. Inlet-Weaver 9 4. Pump Head 5. Multi-PurposeValve 6. In-line Filter 7. Switchable Jet Weaver Mixer 8. Bomba peristáltica lavado pistones 9. Sensor presión 10. Sensor de fugas disolvente 1 5 4 2 6 3 4 10 Válvula Multifunción para la Mayor Comodidad y Flexibilidad Purga Automática (controlada por software) Válvula Multifunción para la Mayor Comodidad y Flexibilidad Filtrado eluyentes en línea para proteger columna en aplicaciones con volumen de retardo estándar Válvula Multifunción para la Mayor Comodidad y Flexibilidad Lavado Automático del filtro en contracorriente (backflush) Válvula Multifunción para la Mayor Comodidad y Flexibilidad. Mezclado Extra para el mínimo rizado/ruido de la línea de base en las aplicaciones más exigentes (TFA como modificador) Bomba Cuaternaria 1290 Infinity: BlendAssist (Asistente de Mezclas) Heramienta de software para la dilución en línea de tampones y modificadores: • Mejora la reproducibilidad de los tiempos de retención (inter-día). • Facilita la programación del gradiente con diferentes concentraciones a partir de soluciones stock. Water Water 1% TFA Ejemplo 2 Métodos con distinto % modificador: 1. 5 to 95% gradiente de ACN con 0.1% TFA en Agua y 0.08% TFA en ACN. 2. 20 – 80% gradiente de ACN con 0.5% TFA en Agua y 0.4% TFA en ACN. Sin BlendAssist: se deben preparar manualmente los 4 eluyentes requeridos o programar complejos gradientes (%A, B, C, D). ACN ACN 29-11 m 1% TFA Con BlendAssist: 1. Definir el factor de dilución de las soluciones stock. 2. Programar un sencillo gradiente binario orgánico/acuoso!! 1290 Infinity Cuaternario: Asistente Preparación Mezclas “On-line: BlendAssist*” Heramienta de software para la dilución en línea de tampones y modificadores: Mejora la reproducibilidad y Facilita la programación del gradiente. Programar un sencillo gradiente binario BlendAssist calculará el factor de dilución necesario, * BlendAssist standard incluido en bombas 1290 Cuartenarias. Opcional “BlendAssist Pro“ con funciones adicionales Bomba Cuaternaria 1290 Infinity Conclusiones Más Amplio Rango de Potencia: hasta 1200 bars (a 2mL/min) y hasta 10ml/min de flujo máximo. La Mejor Precisión y Exactitud de Composición del mercado, independiente del disolvente y en todo el rango de composiciones, flujos y presiones. Todo tipo de aplicaciones con prestaciones tipo bombas binarias con mezclado a alta presión. Blend Assist dilución en línea de soluciones stock de modificadores/ tampones ISET-ready! (emulación de otras bombas) Menor precio que la bomba binaria 1290 Infinity. La máxima Flexibilidad! Costes de operación y mantenimiento similares a bombas de HPLC. 1290 Infinity Compartimento Columnas Termost. - Mejora en Facilidad de uso y Versatilidad: New valve drive and valve head New prolonged HX-carrier with 3rd hand (not shown) Nueva guía Capilares New leak funnel New door-open sensor modified lowdisp HX Nuevo Aislamiento Térmico: fácil cierre del compartimento RFID-tag, stores type, pressure range, valve switches Nuevas válvulas ALta Presión: 2PS/6PT, 2PT/10PT and 9PT/8PS. Rápido intercambio de distintas válvulas 1290 Infinity UHPLC: Infinitas Soluciones !!! - Automatización Flexible Desarrollo de métodos y Multi-Métodos • Hasta 3 compartimentos de Columna para un máximo de 8 Columnas, 26 Solventes y 6 zonas de temperatura. • MD: ChromSword and AutoChrom • Multi-Métodos: ChemStation, EZAccess Regeneración Automática de Columna • 2000 muestras/día con inyecciones superpuestas y offline data analysis Preparación de muestra “Online“ • Enriquecimiento • ……. 29 Soluciones 1290 Infinity LC - 2000 muestras/día usando ACR (Reg. Aut. de Columna) • Análisis y Regeneración de columna simultáneos con válvula de 2 posiciones / 10 puertos • Tiempos de ciclo más cortos y mayor capacidad de análisis de muestras para laboratorios de HT y desarrollo de métodos • Respuestas más rápidas en los controles de calidad durante la fase de producción o de liberación de producto acabado 1290 Infinity Diode-Array Detector Mejora Sensibilidad x10 “versus” Detectores 1200-VWD/DAD - Comparación celdas “Max-Light High Sensitivity vs 1200-VWD“ La Solución: Fibra no recubierta (sílice fundida) V r4 F L 24 Dm 2 Mayor Sensibilidad: hasta x10 veces. Celda “Max-Light Sin aumento de la dispersión del pico High Sensitivity“ (60 mm x σ Vol.: 4 µL) S/N: 2944 1200-VWD S/N: 253 V2 Muestra: Antraceno, 835 pg/µL Col.:: 4.6x150mm ZORBAX SB C18, 5 µm Fase móvil: Agua/Acetonitrilo = 20/80 Flujo: 1.5ml/min Detección 251nm, PW >0.1min, Volumen inyección : 5µl Temp. columna: 40°C (10 mm x σ Vol.: 14 µL) Technical Note: 5990-5326EN 1290 Infinity Diode Array Detector - How the optics work Mirror Grating Programmable slit Deuterium lamp Max-Light cartridge cell 1024 element diode-array Max-Light Cartridge Cell - Optofluidic waveguides Non-coated fiber (fused silica) High Light Transmission due to Total-Internal Reflection (TIR) principle (~ 100 % Light efficiency) Optofluidic Waveguides • Long path length • Small cell volume • High light transmission Benefits: Highest Sensitivity (S/N) with small cell volumes (dispersion effects) More reliable and robust peak integration (automated) due to nearly no Refractive Index and thermal effects (solvent temperature) Cartridge design for ease of use Page 33 Highest S/N Rango Dinámico x30 con HDR-DAD Combina 2 DAD‘s con celdas Max-Light de 3.7 mm y 60 mm Detector Signal [AU/cm] Computing the signals from 60 mm path-length for the low concentration 3.7 mm path-length for the high concentration 3.7 mm path-length 60 mm path-length 10 x higher sensitivity 30x lower Limit of Detection (LOD) Conc ~3x higher upper [µg/mL] limit