analisis morfogenetico de la gastrulacion en peces teleosteos

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE POSTGRADO
ANALISIS MORFOGENETICO DE LA GASTRULACION EN
PECES TELEOSTEOS ANUALES DEL GENERO
AUSTROLEBIAS
LUISA PEREIRO GONZALEZ
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS
Director de Tesis: Prof. Dr. Miguel Concha
Co-Director de Tesis: Prof. Dr. Jochen Wittbrodt
2008
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE POSTGRADO
INFORME DE APROBACION TESIS DE
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS
Se informa a la Comisión de Grados Académicos de la Facultad de
Medicina, que la Tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas
presentada por el candidato.
LUISA PEREIRO GONZALEZ
ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito
para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biomédicas en Examen de
Defensa de Tesis rendido el día 18 de agosto de 2008.
Prof. Dr. Miguel Concha
Director de Tesis
Dpto. de Anatomía y Biología del Desarrollo, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile
COMISION INFORMANTE DE TESIS
PROF. DR. JUAN LARRAIN
PROF. DR. MARCELO ANTONELLI
PROF. DR. JUAN FERNANDEZ
PROF. DR. NORBEL GALANTI
Presidente Comisión de Examen
2
Dedicatoria
A mis viejos, por heredarme lo más valioso y necesario
para esta tesis, la convicción de que “ h ay que
agarrarse con uñas y dientes en la búsqueda del
conocimiento ” .
Para Uds.
parres.
3
Agradecimientos
A Jochen Wittbrodt por devolverme la pasión por la ciencia y por marcar un rumbo,
que seguramente será un ejemplo a seguir.
A Felix Loosli por enseñarme los trucos de la biología molecular y por los post-it con
chistes que me dejabas (¿o eran en serio?).
A todos los integrantes del laboratorio Wittbrodt, por hacerme sentir en casa.
A Nibia Berois y María José Arezo por enseñarme lo que es un equipo de trabajo y
por el entusiasmo compartido de trabajar con “Cynolebias”.
A Miguel Concha, por aceptar el desafío de trabajar con un organismo nuevo.
A Luis Cifuentes por cuidar a los peces, a Alejandra Catenaccio por la
colaboración/paciencia y a Steffen Hartel por todos los aportes, humanos y
científicos.
Al Dr. Juan Fernandez por su poesía humana y su sabiduría científica (también por
el pez-pollo).
A toda la comisión evaluadora por el esfuerzo para que esta tesis fuera posible y por
el entusiasmo en la discusión de los resultados.
A las secretarias del postgrado, Mónica y Paola, por la buena disposición constante
y “muchachas las dejo tranquilas, ya pueden dejar de soñar conmigo”.
A Marcello Antonelli por sus comentarios positivos sobre mi trabajo y por ser un
ejemplo de humildad.
A “Moni” integrante del laboratorio de Jorge Allende, por estar siempre dispuesta a
ayudar y prestarme toda clase de soluciones.
A Eugenia Díaz por el té, la charla, la honestidad y el ejemplo de dedicación.
A Soledad De La Piedra por sus nuevos aportes al entendimiento del desarrollo
embrionario de Austrolebias y también por el buceo.
A María Eugenia Cabrejos por todos los consejos de biología molecular (gracias por
la información de páginas web a consultar, aún la uso) y de la vida.
A todos los integrantes del laboratorio de Miguel Allende, por ofrecerme siempre ese
huequito para trabajar y hacerme sentir una más.
4
A Florencio Espinoza (Floro) por permitirme invadir su oficina, con el trabajo de la
tesis y por el cariño de siempre.
A mi padre por enseñarme el disfrute también de las pequeñas cosas y las ganas de
aprender.
A mi madre por darme los valores que me acompañan día a día y apoyarme incluso
a cruzar Los Andes.
A mis hermanas: Tere, Alicia e Inés y mis seis sobrinos, por estar siempre conmigo,
en todas.
A la Pim, mi cuarta hermana, por todo lo vivido y todo lo que nos queda...
A todos mis amigos de Uruguay, repartidos por todo el mundo, por todas las
experiencias vividas.
A Cathy y Jorge por el cariño de todos los días.
A Rosario, Benjamín y Matías por permitirme aprender todos los días algo nuevo y
por ayudar en la construcción de una familia.
A Miguel (el mio) por el apoyo incondicional, la actitud positiva frente a la vida y por
ser mi justo complemento.
5
Indice de materias
1
4
6
Resumen
Abstract
Introducción
1.- Peces anuales del género Autrolebias: como modelo de estudio de la
7
12
gastrulación
2.- La gastrulación en vertebrados
2.1.- Eventos Morfogenéticos de la Gastrulación
13
2.2.- Combinación de movimientos celulares durante la gastrulación en
diversos organismos
2.3.- Internalización endomesodérmica: el blastoporo y brachyury
17
20
2.4.- Formación y mantenimiento del organizador, expresión del gen
22
goosecoid
2.5.- goosecoid y brachyury en la gástrula de vertebrados
2.6.- Establecimiento de ejes y rompimiento de la simetría
2.7.- El primordio de la cola: ¿una continuación de la gastrulación?
3.- Gastrulación en peces teleósteos
3.1.- Gastrulación “tipo” en peces teleósteos
3.2.- Gastrulación “atípica": peces anuales, Austrolebias
25
25
30
31
32
36
3.3.- Semejanzas y diferencias entre Austrolebias y otros organismos
40
vertebrados
42
42
Hipótesis de trabajo
Objetivo general
42
43
Objetivos específicos
Metodología
1.- Mantenimiento y reproducción de los adultos, cultivo y manejo de
43
embriones
2.- Análisis morfológico del proceso de agregación celular
2.1. Microscopía de campo claro
44
44
45
46
2.2. Microscopía Confocal
2.3. Cortes histológicos
6
3.- Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación
3.1.- Clonamiento de genes de interés
3.2.- Preparación de sondas
47
47
50
51
3.3.- PCR en Tiempo Real
3.4.- Hibridación in situ
4.- Análisis de destino celular durante la agregación
Resultados
1. Análisis morfológico del proceso de agregación celular en Austrolebias
1.1.- Descripción y definición de estadíos de agregación celular
1.1.a.- Estadíos de agregación celular
1.1.b.- Estadíos de eje embrionario y somitogénesis inicial
1.2.- Estudio morfológico a través de cortes histológicos
2. Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación
2.1.- Clonamiento de fragmentos génicos de Austrolebias
2.2.- Análisis de secuencias de goosecoid y brachyury
53
54
56
56
56
58
67
70
73
73
2.3.- Expresión temporal de gsc y bra mediante PCR en Tiempo Real
74
82
2.4.- Estudio del patrón de expresión de goosecoid y brachyury
84
3. Estudio de mecanismos celulares morfogenéticos involucrados en el
proceso de agregación
3.1.- Análisis de destino celular durante la agregación
93
93
3.2.- Estudio dinámico, por microscopía en tiempo extendido, del
proceso de agregación temprano
3.2.1a.- Poblaciones celulares del agregado
3.2.1b.- Poblaciones celulares externas al agregado
99
100
102
3.2.2.- Epitelialización y migración centrípeta de células embrionarias
103
durante la agregación
3.2.3.- Análisis del proceso de internalización celular en AIIIm
Discusión
1.- El blastoporo en Austrolebias: ¿sin surco y con anillo?
108
112
113
2.- Tejido extraembrionario posterior: posible función instructiva de la
formación del embrión.
116
7
3.- ¿Cómo se forma un embrión a partir de un grupo de células?
4.- Resumen de los resultados obtenidos
Conclusión
Bibliografía
Apéndice
122
126
128
129
136
Indice de tablas
Tabla 1. Comparación de tiempos post-fecundación entre peces anuales y no
anuales.
39
Tabla 2. ARNs polimerasas utilizadas en la transcripción de las sondas de gsc y bra.
Tabla 3. Estadíos, tiempos y características del proceso de agregación
51
69
Tabla 4. Porcentajes de identidad de gsc (A) y bra (B) en comparación con
otros vertebrados y entre si.
76
Tabla 5. Ensayos realizados para el estudio del destino celular
99
Indice de figuras
Figura 1.- Ciclo de vida y hábitat de Austrolebias
Figura 2.- Filogenia de peces teleósteos
Figura 3.- Tipos de movimientos celulares durante la gastrulación
10
11
16
Figura 4.- Morfogénesis temprana en las cuatro especies de vertebrados
más estudiadas
19
Figura 5.- Esquema que compara algunos estadíos del desarrollo embrionario de
34
D.rerio y Austrolebias
Figura 6A.- Estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje
60
embrionario y somitogénesis temprana
Figura 6B.- Esquemas de los estadíos del proceso de agregación celular, formación
del eje embrionario y somitogénesis temprana
Figura 7.- Análisis por microscopía confocal del proceso de agregación tardío
8
61
64
Figura 8.- Estudio histológico del proceso de agregación celular y formación
72
del eje embrionario
Figura 9.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de goosecoid (gsc)
Fig 10.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de brachyury (bra)
78
79
Figura 11.- Comparación de secuencias aminoacídicas de goosecoid de
Austrolebias con sus ortólogos de otros organismos vertebrados
80
Figura 12.- Comparación de secuencias aminoacídicas de brachyury de
Austrolebias con sus ortólogos de otros organismos vertebrados
Figura 13.- Estudio de la expresión temporal de goosecoid y brachyury
Figura 14.- Hibridación in situ simple de goosecoid y brachyury
Figura 15.- Análisis del patrón de expresión de brachyury durante el estadío AV
Figura 16.- Hibridación in situ doble de goosecoid y brachyury
Figura 17.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación temprano
Figura 18.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación medio
81
83
86
89
92
95
97
Figura 19.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación
98
celular tardío
Figura 20.- Análisis de poblaciones celulares del agregado en el estadío AIIIm
Figura 21.- Proceso de epitelialización durante la agregación celular temprana
101
104
Figura 22.- Migración centrípeta de células embrionarias en el agregado de
107
estadío AIIIm
Figura 23.- Proceso de intercalación (B-E) e internalización (F-J) en estadío
110
de AIIIm
9
Resumen
Durante la gastrulación, las células de la blástula experimentan una
redistribución dramática para originar un embrión multilaminar. Esto ocurre a través
de movimientos celulares altamente coordinados mediante los cuales, grupos
definidos de células se internalizan desde la superficie formando un blastoporo y
dando origen al endomesodermo. Los movimientos celulares que ocurren durante
este proceso varían entre especies y las principales diferencias radican en la
topología, contextos geométricos y citomecánica de los distintos comportamientos
celulares que los embriones usan. En los vertebrados, el proceso de internalización
celular de la gastrulación ocurre formando dos patrones morfo-topológicos
fundamentales: en anillo (observado en el blastoporo de anfibios y peces) o en línea
o surco (visto en amniotas). En todos los casos, la gastrulación ocurre al mismo
tiempo que el proceso de epibolia.
El género de peces teleósteos anuales Austrolebias habita cuerpos de aguas
continentales altamente inestables y su desarrollo embrionario está adaptado para la
sobrevivencia en ellas. Los peces anuales tienen dos características que los
distinguen: (a) existe un proceso de dispersión-agregación de las blastómeras
profundas previo a la formación del eje embrionario, (b) pueden ocurrir detenciones
reversibles del desarrollo (diapausas) en tres estadios específicos del desarrollo. Por
otro lado, los procesos de epibolia y gastrulación están separados tanto en el tiempo
como espacio, y el eje embrionario se forma a partir de células que se agrupan
formando una estructura de tipo discoidal. En esta tesis la pregunta a responder es
si la gastrulación en Austrolebias está influenciada por la morfología discoidal de la
gástrula y si esta ocurre siguiendo patrones morfogenéticos semejantes a los de
otros embriones discoidales (p.e. embrión de pollo) o si por el contrario, debido a su
pertenencia al grupo de los teleósteos, la gastrulación ocurrirá según lo descrito para
otros peces teleósteos, como es el caso del pez cebra. Los objetivos planteados
fueron: (1) caracterizar y describir el proceso de agregación celular; (2) estudiar la
posible existencia de estructuras tipo nodo y surco primitivo en Austrolebias; (3)
1
analizar el destino de las células que se agregan; y (4) investigar como ocurre el
proceso de internalización del endomesodermo, durante la gastrulación en
Austrolebias. Para el análisis y descripción morfológica del proceso de agregación
celular se utilizaron tres abordajes: microscopía DIC, microscopía confocal y cortes
histológicos. Estos abordajes descartaron la presencia de una línea o surco primitivo,
característico de los embriones discoidales. Para poder marcar las regiones
celulares participantes en el proceso de gastrulación, se clonaron los genes
goosecoid (marcador de nodo) y brachyury (marcador del blastoporo), y se estudió
sus patrones de expresión por hibridación in situ. Se observó que la expresión
temprana de estos genes no se asemeja a la de otros embriones discoidales, pero
tampoco es completamente equivalente al de otros teleósteos. brachyury por
ejemplo, se expresa en un patrón circular, dentro del cual goosecoid ocupa una
posición periférica. Más tardíamente, sin embargo, la expresión de brachyury
adquiere un patrón similar al de otros peces teleósteos evidenciando la forma de
anillo.
Por otro lado, el estudio de destino celular reveló que las primeras células que
se agregan son extraembrionarias, las que posteriormente migran y se concentran
en la región caudal del embrión, siendo reemplazadas en el centro del agregado por
las células embrionarias definitivas. El análisis in vivo del comportamiento y
movimiento celular por microscopía confocal corroboró que el agregado inicial
corresponde a un tejido extraembrionario. A medida que las células embrionarias se
organizanan al centro del agregado, el tejido extraembrionario se desplaza
inicialmente a la periferia y finalmente a la región posterior del agregado. El
organizador (evidenciado por la expresión de goosecoid) está contenido en la zona
central del agregado celular, y el proceso de internalización del endomesodermo
parecería ocurrir a través de un blastoporo en forma de anillo, el cual sólo se hace
evidente en estadíos tardíos de agregación. Las células que se internalizan
tempranamente se desprenden de la superficie como células en botella sugiriendo
un proceso de delaminación.
Se concluye que posiblemente los procesos morfogenéticos que ocurren
durante la gastrulación de Austrolebias se asemejen más al de otros teleósteos que
2
al de embriones discoidales. Las diferencias principales con otros organismos de
peces teleósteos radicarían en la baja densidad celular de sus embriones y el
desacoplamiento que existe entre el proceso de epibolia y los movimientos de
internalización celular. Esto obligaría a los embriones de Austrolebias a cursar un
proceso único de agregación celular previo al inicio de la gastrulación, generando
una arquitectura celular nueva, dentro de la cual se adaptaría la topología de los
procesos inductivos.
3
Abstract
During gastrulation, cells in the blastula undergo a dramatic redistribution to
give rise to a multilayered embryo. This transformation occurs through a series of
highly coordinated cell movements that allow the internalization of groups of cells
from the surface to form the endomesoderm and the blastopore. The organization of
cells to carry out this process varies among species, and the main differences
between them lie in the topology, geometrical context and mechanical constraints
present in the different embryos. In vertebrates, cell internalization during gastrulation
is characterized by one of two possible morphogenetic events: the formation of a ring
(observed surrounding the blastopore of fish and amphibians) or a streak or furrow
(present in amniotes). In all cases, gastrulation is concomitant with the process of
epiboly.
Annual fish of the genus Austrolebias inhabit highly unstable freshwater
bodies and their development has adapted for survival under these conditions.
Embryos of these fish display two features that distinguish them: (a) there is a
dispersal-agregation of the deep blastomeres prior to the formation of the embryonic
axis; (b) a reversible arrest of development (diapause) can occur at three specific
developmental timepoints. On the other hand, the processes of epiboly and
gastrulation itself are temporally and spacially disconnected and the embryonic axis
forms from a group of cells that congregate into a discoidal structure. The question
addressed in this thesis, was whether gastrulation in Austrolebias is influenced by the
disc shape of the gastrula and thus follows the mode of cell internalization of other
discoidal embryos (e.g., avian embryos), or whether its morphogenetic movements
resemble more closely those of other teleosts, such as those of the zebrafish. The
specific aims of this work were: (1) to characterize and describe the process of cell
aggregation; (2) to search for the presence of a node or furrow in the gastrula of
Austrolebias; (3) to follow the fate of the cells that aggregate to form the embryo; and
(4) to establish the mechanism of internalization of the endomesoderm during
gastrulation in this fish. For the morphological analysis and descriptive aspects of this
4
thesis, three approaches were used: DIC microscopy, confocal microscopy, and
histological sectioning. This analysis demonstrated that there is no structure
comparable to the amniote primitive streak in Austrolebias. To label the cells that
undergo internalization, the marker genes goosecoid (specific for the node or
organizer) and brachyury (specific for the blastopore) were cloned, and their
expression patterns were revealed by in situ hybridization. Early expression of both
genes is unlike that found in other discoidal embryos, though it is not entirely
comparable to that of other teleosts either. brachyury, for example, is expressed in a
circular pattern, with goosecoid expressing cells located eccentrically, occupying a
peripheral position. Later on, however, brachyury expression adopts a pattern similar
to that of other fish, forming a ring of expression.
Analysis of cell fate in these embryos revealed that the first group of cells to
arrive at the aggregation site are extraembryonic, as they subsequently become
positioned at the caudal end of the embryo and are replaced at the center of the
agregate by the definitive embryonic cells. The in vivo analysis of the behavior of
these cells using time-lapse confocal microscopy, confirmed this finding. The
organizer (distinguished by the expression of goosecoid) is localized at the center of
the aggregate, and the process of endomesoderm internalization occurs through a
ring-shaped blastopore, a structure that only becomes distinguishable during the late
aggregation stages. The earliest cells to ingress abandon the surface adopting a
bottle shape, suggesting they do so through a process of delamination.
The conclusion from this study, is that the morphogenetic events occurring
during gastrulation in Austrolebias resemble more closely those of other teleosts than
those of discoidal embryos beloning to other groups of vertebrates. The differences
observed with other fish are related to the low cell density found in the pre-gastrula
stage embryos and the uncoupling of epiboly and cell internalization. Thus,
Austrolebias embryos must go through an obligatory, and unique, aggregation stage
prior to gastrulation, requiring a novel cellular organization in which the ensuing
inductive processes must be accomodated.
5
Introducción
La evolución de los metazoarios ha producido tanto una complejidad
fenotípica como mecanismos del desarrollo encargados de generar dicha
complejidad. Durante el desarrollo, una célula única se transforma en un organismo
compuesto por múltiples tipos celulares, organizados en una distribución espacial
que es arquitectónicamente compleja y al mismo tiempo funcionalmente coherente.
Uno de los principales desafíos de la última década ha sido entender cómo, a partir
de interacciones génicas y comportamientos celulares, los distintos tipos o estados
celulares se establecen en tiempo y espacio en un organismo en desarrollo (SalazarCiudad et al., 2003).
La embriogénesis de los vertebrados involucra una combinación coordinada
de proliferación, especificación de destino y movimiento celular. Luego de la
inducción de las hojas embrionarias, la blástula es transformada por los movimientos
de la gastrulación, en un embrión multilaminar con rudimentos de cabeza, tronco y
cola (Solnica-Krezel, 2005).
En los bilateria es conocida la existencia de genes conservados tanto en
estructura como en función. En particular dentro del grupo de los vertebrados el
estudio de un número limitado de organismos, ha permitido describir mecanismos de
desarrollo, algunos de los cuales son claramente conservados entre grupos lejanos,
y que en algunos casos se han considerado representativos de todo un grupo, como
el de los peces teleósteos. A partir del estudio de una decena de especies de
teleósteos de órdenes lejanos y diversos, se ha descrito el desarrollo embrionario
considerándolo representativo de todo el grupo. Pero ¿será este tipo de desarrollo
realmente representativo de todos los peces teleósteos? En esta tesis se analiza el
desarrollo embrionario y en particular el proceso de gastrulación, en un pez teleósteo
anual que aparentemente presenta rasgos del desarrollo embrionario sumamente
derivados, los cuales posiblemente estén relacionados con el éxito de estrategias
para sobrevivir en un habitat inestable.
6
La introducción ha sido subdividida en tres secciones. En la primera se hará
mención brevemente de las características del modelo en estudio en relación a su
modo de vida, habitat y relaciones filogenéticas. En la segunda sección se
describirá, en forma comparada, las características principales del proceso de
gastrulación en distintos organismos vertebrados. En la tercera sección se
comparará la gastrulación de los peces teleósteos más estudiados (gastrulación
“típica”) y los peces teleósteos anuales (gastrulación “atípica”), considerando para
esto último la información existente sobre Austrolebias.
1.- Peces anuales del género Austrolebias como modelo de estudio de la
gastrulación
Dentro del orden Cyprinodontiformes existen géneros que presentan ciclos de
vida anual. Estos son peces que habitan masas de agua temporales en las que,
durante los períodos estivales de sequía, ocurre la muerte tanto de adultos como de
formas post-embrionarias. Estos peces dejan sus huevos enterrados en el sustrato,
los cuales permanecen vivos gracias a varias características particulares de su
desarrollo embrionario. La eclosión de dichos huevos ocurre en la siguiente estación
lluviosa y en pocas semanas los juveniles alcanzan la madurez sexual (Figura 1).
Esta estrategia reproductiva sugiere una plasticidad de respuesta a un entorno
sumamente variable. Ejemplos de géneros que poseen este ciclo de vida son
Austrofundulus, Austrolebias, Rachovia y Pterolebias de Sudamérica y Aphyosemion
y Nothobranchius de África (Wourms, 1964, 1967, Wourms 1972, a,b,c).
La capacidad de las poblaciones de peces anuales para sobrevivir a las
estaciones secas, está localizada en sus huevos. Estos son resistentes a la
desecación y exhiben un modelo de desarrollo embrionario que difiere del descrito
para otros peces y vertebrados. Las dos características fundamentales que definen a
los peces anuales son:
(1) el desarrollo temprano se caracteriza por presentar una fase de dispersión
total de las blastómeras profundas durante el proceso de epibolia y una posterior
agregación de éstas, previo a la formación del eje embrionario.
7
(2) poseen la capacidad de experimentar detención reversible del desarrollo
embrionario (diapausa) en tres momentos definidos: diapausa I (fase dispersa),
diapausa II (embrión somítico antes o después de la formación del tubo
endocardíaco) y diapausa III (pre-eclosión). En los géneros Austrolebias y
Nothobranchius las diapausas I y II son facultativas, siendo la diapausa III la única
obligatoria (Wourms, 1972 a, b, c).
El género Austrolebias Costa, 1998a (Cyprinodontiformes, Rivulidae)
constituye un ejemplo de peces anuales presentes en regiones bajas de Argentina,
Uruguay y Brasil. El mismo ha sido objeto de estudio en diferentes áreas: a nivel
eco-etológico y morfológico (Vaz Ferreira et al. 1964, Vaz Ferreira y Sierra, 1973),
aspectos citogenéticos (Máspoli y García, 1988, García et al., 1993, 1995), análisis
filogenéticos (García et al., 2000, 2001, 2002), estudio de parámetros morfométricos
y ultraestructurales (Loureiro y de Sá, 1996, 1998) y taxonómicos (Loureiro et al.,
2004). A su vez se realizó la caracterización de los estadios del desarrollo en A.
viarius (la cual no difiere mayormente en otras especies de este género) y se
establecieron los tiempos de desarrollo de cada estadio (Arezo et al. 2005).
Estos estudios del desarrollo embrionario, han permitido obtener información
en cuanto a la descripción de las características más sobresalientes de los distintos
estadíos embrionarios, así como una descripción ultraestructural del proceso de
dispersión (100% de epibolia) (Wourms 1972a, b y c; Carter & Wourms 1991; Arezo,
et al., 2005). Dichos trabajos pioneros abrieron interrogantes en cuanto a las
características únicas de estos peces teleósteos. Para la descripición de su
desarrollo se habla de un proceso de “dispersión-reagregación” entre las etapas de
clivaje/epibolia y formación del eje embrionario (Wourms, 1972b).
El orden Cyprinodontiformes al que pertenecen los peces anuales del género
Austrolebias, se ubica filogenéticamente más cercano a los Beloniformes donde se
ubica la especie Orizias latipes (medaka) y Tetraodontiformes al que pertenece
Takifugu rubripes (Fugu) teniendo un antecesor común hace 195 millones de años.
Los Cypriniformes, orden al que pertenece Danio rerio (pez cebra), tiene un
antecesor común con los Cyprinodontiformes (Austrolebias) que existió hace 290
millones de años (ver filogenia en Fig. 2). Tanto pez cebra, medaka como Fugu
8
presentan un desarrollo embrionario similar, en cuanto a sus características
morfológicas, es posible que la aparición de las innovaciones en el desarrollo
embrionario, características del género Austrolebias, serían más recientes y
derivadas del patrón descrito para estos teleósteos.
9
A
B
5
4
6
3
1
2
Figura 1.- Ciclo de vida y habitat de Austrolebias A. Ciclo de vida de peces anuales. 1-2.
Puesta de huevos durante periodo de invierno, 2-3 muerte de adultos a medida que los charcos
se secan y los huevos quedan enterrados en el sustrato durante el verano, 3-4 período de lluvias
donde los charcos se llenan de agua y nacen las larvas, 4-6 desarrollo y maduración de larvas a
adultos, inicio del nuevo periodo reproductivo (modificado de Wourms, 1972 c) B Charco típico
donde habita Austrolebias. En particular habitat de A. charrua en Rocha, Uruguay.
10
Orizias latipes
Takifugu rubripes
Danio rerio
Figura 2.- Filogenia de peces teleósteos
11
2.- La gastrulación en vertebrados
La morfogénesis es un proceso fundamentalmente biomecánico, propiedad
especialmente cierta para la gastrulación, una de las mayores transformaciones
morfogenéticas en el desarrollo (Keller et al., 2003). La gastrulación es un proceso
que implica una redistribución dramática de las células de la blástula a través de
movimientos altamente coordinados de células y tejidos. El embrión en el estadío de
blástula consta de numerosas células cuya posición relativa es establecida durante
el clivaje. Cuando la gastrulación comienza, estas células adquieren nuevas
posiciones y nuevos vecinos, estableciéndose un plan corporal multilaminar que
consta de tres hojas embrionarias: externa (ectodermo), interna (endodermo) e
intermedia (mesodermo). Los movimientos celulares que ocurren en este proceso
involucran a la totalidad del embrión y la migración en una zona particular de éste,
implica
necesariamente
la
coordinación
con
movimientos
que
ocurren
simultáneamente en otra región del embrión (Gilbert, 2000).
Gastrulación significa formación de una cavidad gástrica, el arquenterón, en el
cual ocurrirá la digestión en el organismo adulto. En la mayoría de los animales la
formación del endodermo ocurre al mismo momento que la formación de la tercer
hoja embrionaria, el mesodermo. Pero sin embargo esto no ocurre siempre, y la
formación del mesodermo puede estar temporalmente separada de la formación de
la cavidad gástrica. Sin embargo el término gastrulación es comúnmente utilizado
como un sinónimo de la formación del endomesodermo (Technau & Scholz, 2003).
Figura 2.- Filogenia de peces teleósteos Análisis filogenético entre diez especies de
peces teleósteos, modelo de estudio en diferentes áreas, pertenecientes a siete órdenes
diferentes, donde se estiman los tiempos de divergencia. En rojo se indican los órdenes y
especies de teleósteos a las que se hace referencia en el texto: Beloniformes al cual
pertenece el modelo medaka (Orizias latipes), Tetraodontiformes pertenece Fugu (Takifugu
rubripes) y Cypriniformes al que pertenece el pez cebra (Danio rerio). En azul se indica el
orden Cyprinodontiformes (flecha), dentro del cual está el género de peces anuales
Austrolebias. Los valores a la derecha de los nodos representan la edad estimada (en
millones de años atrás, MYA) del último antecesor común (en recuadro rojo se indican los
antecesores comunes de los peces de interés). Modificado de Steinke et al. 2006.
12
Los embriones vertebrados despliegan un plan corporal conservado, con un
eje rostrocaudal elongado. A lo largo del eje dorsoventral, el sistema nervioso toma
la posición más dorsal, por encima de la notocorda y flanqueado por los somitos
bilaterales (Solnica-Krezel, 2005). Las hojas embrionarias son las distintas capas
celulares que se forman tempranamente en el desarrollo embrionario (durante la
gastrulación) y dan origen a todos los tejidos del adulto. Por ejemplo, el ectodermo
va a originar al sistema nervioso y la epidermis, el endodermo al intestino medio (y
algunos órganos internos en vertebrados) y el mesodermo a la sangre, tejido
muscular y en los vertebrados a los huesos y algunos órganos internos (Technau &
Scholz, 2003). Por otro lado la terminología “endodermo, mesodermo y ectodermo”
no es correcta en estricto sentido. El sufijo - dermo es usado para referirse a un
tejido diferenciado, como el tejido epitelial. Por el contrario el sufijo - blasto indica un
tejido proliferativo, no diferenciado. Por lo tanto parece más apropiado hablar de
mesoblasto, endoblasto y ectoblasto como una hoja embrionaria proliferativa con
diferentes destinos posibles, durante la embriogénesis de los animales (SalviniPlawen & Splechtna, 1979). De todos modos, y a los efectos de esta tesis, la
referencia a las hojas embrionarias se hará como se acostumbra tradicionalmente:
ectodermo, mesodermo y endodermo.
2.1.- Eventos Morfogenéticos de la Gastrulación
Los movimientos que ocurren durante la gastrulación varían de especie a
especie, lo que sugiere la existencia de una variada gama de estrategias para
generar el mismo plan corporal básico. Esta diversidad, sin embrago, contrasta con
el hecho de que los diversos embriones utilizan un repertorio limitado de
comportamientos celulares, el cual está sumamente conservado a lo largo de la
filogenia (migración de células únicas con conducta de gateo, migración de
poblaciones de células, rearreglo celular, cambio de forma celular, cambio en la
adhesividad celular, transición epitelio-mesénquima y mesénquima-epitelial, división
celular, crecimiento, apoptosis). La diferencias entre especies radican, entonces, en
las distintas combinaciones de comportamientos celulares que los embriones usan,
13
las cuales acontecen a su vez, en diferentes contextos geométricos y mecánicos, así
como en tiempos disímiles (Keller et al., 2003). Esta diversidad de combinaciones de
mecanismos morfogenéticos surgida durante la evolución sería, en parte,
consecuencia de distintas estrategias reproductivas y ciclos de vida, lo que involucra
la evolución a su vez de huevos de diferentes tamaños, cantidad y proporción de
vitelo así como de distintas tasas de desarrollo. Lo fundamental para entender la
gastrulación, en un sentido amplio y profundo, reside por lo tanto, en entender el
diseño celular biológico y biomecánico de la gástrula, producido estocásticamente
durante la evolución (Keller et al., 2003).
Uno de los eventos fundamentales de la gastrulación es la formación de las hojas
embrionarias. Este proceso usualmente involucra la combinación de uno o más de
los siguientes tipos de movimientos celulares en las distintas especies (Figura 3):
-
Invaginación: plegamiento localizado de una lámina de células (Ej. formación
de endomesodermo en Xenopus [Keller, 1981])
-
Involución: movimiento coordinado de una población de células hacia
posiciones más profundas dentro del embrión (Ej. movimiento de las células
del margen del blastodermo hacia el interior para generar el hipoblasto en el
pez cebra [Warga & Kimmel, 1990] y Barbus conchonius [Wood &
Timmermans, 1988])
-
Ingreso (“Ingression”): movimiento de células individuales hacia posiciones
más profundas del tejido, cambiando las relaciones entre ellas durante el
proceso (Ej. formación del hipoblasto a partir del epiblasto en Fundulus
[Trinkaus, 1996] y pez cebra [Carmany-Rampey & Shier, 2001], formación del
endomesodermo a través del surco primitivo en pollo [Hashimoto & Nakatsuji,
1989]).
-
Delaminación: desprendimiento de células individuales a partir de una capa
de células epiteliales, generando una capa paralela y más profunda a la
primera (Ej. formación del hipoblasto en Salmo gairdneri [Ballard, 1966] y del
hipoblasto primario en pollo [Eyal-Giladi et al., 1992]).
14
-
Epibolia: movimiento de capas epiteliales que se dispersan como una unidad,
a fin de cubrir las capas profundas de un embrión, la que puede llevarse a
cabo por una activa intercalación radial de células (Ej. movimiento del
ectodermo presuntivo sobre el endodermo presuntivo por activa intercalación
radial de células en Xenopus [Keller, 1980]; movimiento de la capa celular
envolvente (EVL), blastómeras profundas (BP) y capa sincicial vitelina (YSL)
sobre el vitelo en pez cebra [Kimmel et al., 1995]; movimiento de las células
ectodérmicas presuntivas sobre la envoltura vitelina en el pollo [New, 1959]).
El otro gran movimiento que ocurre durante la gastrulación es el de extensión
convergente. Este involucra la migración en dirección medio-lateral de células de las
tres hojas embrionarias, lo que lleva a un angostamiento lateral y elongación a lo
largo del eje antero-posterior del tejido. Los comportamientos celulares que dirigen la
extensión convergente se conocen bien en Xenopus, y en un grado menor en los
teleósteos. Se basan en la intercalación activa de células a lo largo del eje mediolateral del embrión. Se ha visto que la intercalación medio-lateral es dirigida por la
actividad protrusiva unipolar o bipolar de las células, dependiendo de la hoja
germinal involucrada. Las células inicialmente se elongan, luego se alinean en el
sentido medio-lateral y posteriormente se intercalan (Keller, 1976, 1980, Concha &
Adams, 1998). Finalmente, estudios en pez cebra y Fundulus, indican la existencia
de convergencia en ausencia de movimientos de extensión en regiones laterales de
la
gástrula,
en
las
cuales
las
células
migran
hacia
regiones
dorsales
predominantemente por medio de filolamelipodios y casi no se intercalan (Trinkaus
et al., 1992, Concha & Adams, 1998).
15
Invaginación
Ej. endodermo
de erizo
Delaminación
Ej. hipoblasto de
mamíferos y aves
Involución
Ej. mesodermo
en anfibios
Ingreso
Ej. mesodermo de erizo,
neuroblastos Drosohila
Epibolia
Ej. ectodermo en
anfibios y erizo
Figura 3.- Tipos de movimientos celulares durante la gastrulación. La gastrulación de
un organismo cualquiera, involucra una combinación de estos movimientos. Modificado de
Gilbert, 2000.
16
2.2.- Combinación de movimientos celulares durante la gastrulación en
diversos organismos
El oocito de la rana Xenopus presenta una cantidad de vitelo intermedia
(mesolecito) en relación a otros organismos, el cual está desplazado hacia el polo
vegetal, determinando de esta forma un clivaje total pero enlentecido en el
hemisferio vegetal. Esto genera una blástula cuyas células vegetales (futuro
endodermo) serán de mayor tamaño que las animales (ectodermo y mesodermo
presuntivo) y con un blastocele desplazado hacia el polo animal. Cuando la
gastrulación comienza, ciertas células localizadas justo debajo del ecuador, cambian
dramáticamente su morfología (células en botella) e involucionan a través de una
región circunscrita del dorso del embrión, el labio dorsal del blastoporo. Estas
primeras células se transformarán en células faríngeas del intestino anterior
(endodermo). El próximo evento de la gastrulación involucra la invaginación de las
células de la zona marginal, a la vez que las células animales realizan epibolia y
convergencia hacia el blastoporo (Figura 4). Las siguientes células en involucionar
formarán la placa precordal y la notocorda. Posteriormente, las células del
mesodermo involucionado realizan convergencia y extensión, y se mueven como
una lámina de células sobre la superficie interna del blastocele en dirección al polo
animal del embrión (Keller, 1980, 1981).
En el caso del pez cebra, la blástula tiene la forma de una copa invertida
sobre el vitelo. Esta polaridad se adquiere debido a que su huevo es telotecito (con
gran contenido de vitelo, al igual que en otros teleósteos) y el clivaje es meroblástico
discoidal (clivaje parcial según un disco). Durante la gastrulación las células del
blastodermo profundo se expanden sobre el vitelo por medio de intercalación radial
(movimiento de epibolia) y posteriormente a través de movimientos de involución y/o
ingreso (ver discusión abajo). El borde del blastodermo se pliega hacia el interior, a
lo largo de toda la circunferencia del embrión, formando una región marginal
bilaminar
(epiblasto-hipoblasto)
denominada
anillo
germinal
(Figura
4).
Posteriormente, las células de la región dorsal del embrión se reorganizan por
movimientos de convergencia generando el escudo embrionario (Warga & Kimmel,
17
1990), una estructura homóloga al labio dorsal del blastoporo en anfibios y al nodo
de Hensen, en aves. Finalmente, al igual que en anfibios, el embrión adquiere su
forma alargada a través de movimientos de convergencia y de extensión
convergente (Solnica-Krezel & Eaton, 2003; Keller 2002; 2003).
Los embriones amniotas, como las aves y los mamíferos, adquieren forma de
disco (Ej. pollo y humanos) o copa (Ej. ratón) y están formados por una lámina de
células epiteliales. En ambas geometrías (disco y copa), el primer signo morfológico
de la gastrulación es la formación del nodo de Hensen y el surco primitivo. Este
último se forma a lo largo de la línea media embrionaria como consecuencia del
ingreso o delaminación de células epiteliales del epiblasto en un proceso
denominado transición epitelio-mesenquimática (Figura 4). Una vez que el surco
primitivo se ha establecido, las células mesenquimáticas comienzan una migración
anterolateral y se diferencian en células endomesodérmicas (Vakaet, 1984; EyalGiladi, 1991; Psychoyos & Stern, 1996; Hashimoto & Nakatsuji,1989) .
18
Rana
Pez
polo animal
blastodermo
Pollo
Ratón
proximal
polo animal
blastodermo
epiblasto
vitelo
vitelo
cel. vit.
blast. prof
distal
polo vegetal
polo vegetal
EVL
blastocele
linea primitiva
vitelo
margen
blastodermo
labio dorsal
blastoporo
50% epibolia
8000 células en blastodermo
Estadío XIV
600-700 células en epiblasto
Estadío 10
5000 células en blástula
6.5 días post coitum
600 células en epiblasto
Figura 4.- Morfogénesis temprana en las cuatro especies de vertebrados más
estudiadas. A. Apariencia de los embriones antes de la gastrulación. Escala de barras:
peces, 500-600 μm; rana, 1-2mm; pollo, 2-3mm; ratón, 700 μm. Las flechas verdes
indican la dirección de movimiento de la epibolia. Las líneas rojas indican las regiones
donde comienza a internalizarse el endomesodermo (blastoporo): peces, margen del
blastodermo; rana, labio dorsal del blastoporo; pollo y ratón, línea primitiva. B.
Mecanismo de formación de las hojas embrionarias. En el pez cebra las células
superficiales del margen forman el hipoblasto moviéndose por involución. En la rana, el
endomesodermo se forma por invaginación de las células de la blástula a través de la
cincunferencia del blastoporo, localizado en la mitad más vegetal del embrión, seguido
este movimiento por involución. En el pollo y el ratón las células del epiblasto “ingresan”
individualmente a través de un surco primitivo lineal, para originar el endomesodermo.
Los movimientos de internalización celular están indicados por diferentes colores a cada
lado del embrión. C. Comparación de los mapas de destino de diferentes gástrulas
tempranas, mostrando una regionalización similar en los tejidos progenitores. En cada
esquema el organizador se encuentra representado como una región roja. Orientación
de embriones: pez y rana - vista lateral izquierda; pollo - vista dorsal; ratón - la mitad
izquierda del epiblasto está representada en una posición invertida, con su extremo
proximal hacia abajo. se: ectodermo superficial, ne: neuroectodermo, mes: mesodermo,
org: organizador, yolk end. endodermo que contiene vitelo, ks. media luna de Koller.
Modificado de Gilbert & Raunio,1997; Concha, 1998.
19
2.3.- Internalización endomesodérmica: el blastoporo y brachyury
El blastoporo es la región por donde las hojas embrionarias, endodermo y
mesodermo
se
internalizan,
en
el
embrión
temprano.
Los
precursores
endomesodérmicos se internalizan vía el blastoporo en la rana, el margen del
blastodermo en el pez y el surco primitivo en los amniotas (Solnica-Krezel, 2005).
Por lo tanto, estas estructuras son homólogas entre si, en los diferentes organismos
y de modo genérico le llamaremos blastoporo en esta tesis. En los distintos
vertebrados analizados hasta la actualidad se han distinguido dos formas básicas de
blastoporo: en anillo (Ej. en anfibios y peces) y en línea/surco (Ej. amniotas). Las
variaciones principales entre organismos, están dadas en términos de los
comportamientos celulares que acontecen en la internalización del endomesodermo,
algunos de los cuales están aún en discusión.
En relación al orden en el cual las hojas embrionarias se internalizan existen
similitudes pero también diferencias entre los distintos organismos. En el pez cebra
los movimientos de internalización se inician en el margen del blastodermo axial,
donde se formará el organizador, y luego rápidamente se propaga la internalización
por todo el margen (Warga & Kimmel, 1990). En la rana y el pez cebra los primeros
tejidos que se internalizan son el mesodermo dorsoanterior y el endodermo. Esto
contrasta con el pollo y el ratón, donde la línea primitiva aparece primero en la futura
región caudal del embrión, luego se elonga hacia la futura región cefálica
adquiriendo una forma lineal (Vakaet, 1970). La expansión de la línea está
acompañada por el ingreso de células mesendodérmicas destinadas a transformarse
en tejido extraembrionario y posterior. Solamente una vez que la línea primitiva
alcanza su largo máximo, se forma el nodo de Hensen en su extremo rostral, por el
cual ingresará el endomesodermo dorsoanterior (Schoenwolf, 1992). Por lo tanto, la
internalización temprana en el pez cebra y la rana involucra tejidos dorsoanteriores,
mientras que en amniotas, lo primero que se internaliza es tejido extraembrionario y
posterior (Solnica-Krezel, 2005). Sin embargo, una vez que comienza la
internalización del endomesodermo, ésta también ocurre siguiendo un orden similar
al visto para otros organismos. En pez cebra, pollo y ratón el endodermo es
20
internalizado via el blastoporo, por la región proximal al organizador. (Lawson &
Schoenwolf, 2003).
Con respecto a la formación del mesodermo, existe una tendencia en todos
los vertebrados donde la organización rostrocaudal de los tejidos mesodérmicos
refleja el orden temporal de su internalización, a través de una posición específica
proximo-distal al blastoporo, por lo tanto la internalización de estructuras rostrales
precede la de las caudales. Otro aspecto común de la internalización, es que la
organización
mediolateral
de
los
tejidos
mesodérmicos
y
probablemente
endodérmicos, está asociada con el orden espacial a través del cual se mueven por
el blastoporo, en relación al organizador. El mesodermo axial se mueve a través de
la región axial del blastoporo: Ej. por el labio dorsal del blastoporo en ranas, el
escudo en peces y el nodo en amniotas, y se internaliza la placa precordal que
precede al cordamesodermo. Sin embargo, el mesodermo intermedio y la placa
lateral se internalizan a través de regiones más distales (al organizador) del
blastoporo (Solnica-Krezel, 2005).
brachyury (bra) es un gen cuya expresión se ha detectado en todos los
vertebrados, en el blastoporo/línea cuyas células contribuyen masivamente a la hoja
embrionaria mesodérmica (Smith et al., 1991). Este no es simplemente un gen
restringido al mesodermo, sino que más bien restringido al blastoporo (Technau &
Scholz, 2003). Un análisis comparativo de los patrones de expresión de bra en
distintos grupos indentifica su sitio original de expresión en la región del blastoporo
(Technau, 2001). En los vertebrados el dominio de expresión de brachyury, el cual
está bajo el control de la vía Nodal, corresponde al mesodermo presuntivo (SchulteMerker et al., 1992, Smith et al., 1991). Se ha propuesto que el rol ancestral de
brachyury fue controlar los movimientos celulares que permiten la internalización,
más que el control de la diferenciación celular (Gross & McClay, 2001).
bra es un factor de transcripción con un dominio de unión al ADN altamente
conservado (Kispert et al., 1995), el dominio-T (T-box). Este dominio comprende
180-200 aminoácidos en la porción N-terminal de la proteina y un dominio de
activación C-terminal, menos conservado (Kispert et al., 1995). Los genes con
dominio-T aislados, de una amplia gama de organismos, comparten un alto grado de
21
identidad aminoacídica (40-90%) en el dominio-T. Todos los genes con dominio-T
estudiados tienen roles importantes en el desarrollo embrionario temprano,
principalmente, pero no exclusivamente en el tejido mesodérmico (Papaioannou &
Silver, 1998).
El gen bra apareció primero en metazoarios y tempranamente especifica el
blastoporo/boca de los Cnidarios, el cual corresponde al organizador de dichos
organismos. El origen de la expresión de bra en el mesodermo se remonta al
mesodermo visceral caudal de los poliquetos, insectos y hemicordados. En los
vertebrados bra es inicialmente panmesodérmico en la zona marginal para volverse
tardíamente restringido al mesodermo axial (notocorda), el cual representa las
células de la línea media que se segregan de la región del blastoporo (Technau,
2001). Por lo tanto, bra uno de los factores de transcripción involucrado en la
diferenciación y determinación temprana del mesodermo de los vertebrados, se
expresa primero en la zona marginal de la blástula tardía, el mesodermo presuntivo,
pero se mantiene restringido a la notocorda y el organizador de la cola (“tailbud”),
durante la gastrulación (Ej. mesodermo axial y posterior). Por lo tanto actúa en la
especificación temprana del mesodermo posterior y la formación de la notocorda
(Technau, 2001).
2.4.- Formación y mantenimiento del organizador, expresión del gen goosecoid
La actividad del “organizador”, el que fue descrito inicialmente por Spemann y
Mangold en 1924, es una de las demostraciones más claras de la importancia de la
comunicación célula-célula en la generación de diversidad de tejidos, durante el
desarrollo embrionario. El organizador es un centro inductor de la formación del eje y
puede generar la formación de ejes ectópicos si es transplantado a otra zona de un
embrión (Spemann & Mangold, 1924; Joubin & Stern , 2001).
A pesar de las diferentes estrategias reproductivas y geometrías del huevo, el
organizador puede ser identificado en todos los vertebrados. Esta estructura es
establecida en el estadío de gástrula bajo la influencia de una región especial
conocida como el centro de Nieuwkoop en anfibios. El centro de Nieuwkoop es una
22
región dorso-vegetal del embrión, definida por su habilidad para inducir la formación
de un organizador, sin contribución celular a éste, ni a las estructuras axiales
derivadas (Bachvarova, 1998). Las estructuras homólogas en los distintos
vertebrados que contienen al organizador son: el labio dorsal del blastoporo en
anfibios, el escudo embrionario en pez cebra y el nodo de Hensen en pollo.
La región organizadora consiste en una población de células que está
continuamente cambiando, las cuales adquieren y pierden las propiedades
organizadoras de acuerdo a su posición en un tiempo determinado (Joubin & Stern,
1999). La pregunta que surge entonces es ¿cómo se mantiene la actividad
organizadora durante el tiempo necesario? Se propone que al menos en pollo, las
mismas vías de señalización molecular involucradas en el posicionamiento del
organizador, estarían jugando un rol en su regeneración. La regeneración sería una
consecuencia del mecanismo normal de mantenimiento del nodo. Este mecanismo
asegura que exista un grupo constante de células no organizadoras (células que no
han entrado aún al nodo) que pueden responder a las señales liberadas por el
organizador y tranformarse, por ejemplo, en tejido neural. A su vez permite la
migración de las células alejándose del nodo, sin formar parte de éste (Joubin &
Stern, 2001).
goosecoid (gsc) de Xenopus, fue el primer gen aislado específico de
organizador (Blumberg et al., 1991; Cho et al., 1991). A partir del descubrimiento de
que gsc se expresaba en el organizador, fue posible visualizar, mediante el análisis
de la expresión de dicho gen, una región del embrión con actividad inductiva. Por lo
tanto el organizador de Spemann se convirtió en un grupo concreto de células y dejó
de ser solamente un concepto embriológico (De Robertis, 2004). Por lo tanto gsc es
uno de los primeros genes expresados en la región organizadora de todos los
vertebrados estudiados y especifica la futura región dorsal, a lo largo del eje anteroposterior (De Robertis et al., 1992).
El gen gsc, es un factor de transcripción que codifica para una proteína de
unión al ADN con un dominio homoebox. Puede inducir la formación de un eje
secundario parcial si su ARNm es microinyectado en un embrión temprano,
indicando que este gen puede ejecutar parte de las actividades del organizador de
23
Spemann (Cho et al., 1991). gsc es activado por Nodal y β-catenina nuclear en la
región dorsal del embrión (ver abajo). Una de las funciones de los factores de
trascripción presentes en el organizador, es activar la producción de moleculas
señalizadoras, las que permiten el reclutamiento de células vecinas hacia destinos
dorsales (Niehrs et al., 1993). Dentro de los factores secretados por el organizador
se encuentran: Chordin y Noggin. Estas moléculas de señalización cumplen un rol
inhibiendo a los factores de crecimiento en el espacio extracelular. En particular
Chordin y Noggin son antagonistas de BMP (bone morphogenetic proteins,
inductores de destino ventral y lateral), impidiendo la unión con sus receptores.
Dichos factores secretados antagonistas de BMP, son importantes para el
establecimiento de los tres ejes en el embrión (Niehrs et al., 1993).
En Xenopus la expresión de gsc más intensa comienza en el labio dorsal del
blastoporo y se extiende a la placa precordal en la neurula tardía (Cho, et al., 1991).
En pollo gsc comienza su expresión en la hoz de Koller del blastodisco, desde donde
las células migran al extremo anterior de la línea primitiva, el nodo de Hensen y
posteriormente la placa precordal, marcando el endodermo faríngeo y el mesodermo
de la cabeza. Su expresión continúa hasta la somitogénesis (Izpisua-Belmonte et al.,
1993). En el pez cebra gsc se expresa inicialmente en las primeras células que se
internalizan por la región dorsal del margen en la gástrula temprana. Durante la
gastrulación estas células se mueven delante de las células que formarán la
notocorda. Cuando se aprecia la doble expresión de gsc y bra se observa que al
inicio los dominios de expresión se solapan, separándose tardíamente. El límite
posterior de expresión de gsc marca el extremo anterior de la notocorda, por lo tanto
el solapamiento con bra es de pocas células. La expresión de gsc dura hasta la
somitogénesis temprana en el pez cebra. Las células que expresan gsc darán origen
a la glándula de eclosión (“hatching gland”), el endodermo faríngeo y el mesodermo
de la cabeza. La placa precordal (región anterior del hipoblasto) también se marca
con gsc.
24
2.5.- goosecoid y brachyury en la gástrula de vertebrados
Morfológicamente la gástrula del pez cebra, Xenopus, pollo y ratón son bien
diferentes. Sin embargo usando dos marcadores gsc y bra, es posible definir
regiones homólogas. Por lo tanto el escudo embrionario (pez cebra), labio dorsal del
blastoporo (rana), el nodo de Hensen temprano (pollo) y el extremo de la línea
primitiva (ratón) se consideran homólogos, ya que expresan altos niveles de ARNm
de gsc e inician el movimiento celular que llevará al desarrollo del mesendodermo en
la región de la cabeza (Schulte-Merker et al., 1994). De modo similar el anillo
germinal (pez cebra), la zona marginal (rana), y la línea primitiva (pollo y ratón) son
homólogos, ya que expresan bra y dirigen la formación del resto del mesodermo. Las
mismas células que expresan gsc en el embrión temprano también inician la
expresión temprana de bra en el lado dorsal, al menos en el pez cebra (SchulteMerker et al., 1994). La expresión de gsc llega hasta el tejido más anterior, el borde
anterior de la placa precordal, mientras que bra en estadíos tardíos del desarrollo, se
expresa específicamente en los tejidos más posteriores, como la notocorda posterior
y el organizador de la cola (“tailbud”), tanto en embriones de pez cebra (SchulteMerker et al., 1992), Xenopus (Gont et al., 1993) como en ratón (Herrmann, 1990).
2.6.- Establecimiento de ejes y rompimiento de la simetría
El cigoto contiene todas las instrucciones para su desarrollo embrionario en el
genoma cigótico y en moleculas citoplasmáticas maternas. La contribución relativa
de la regulación materna y cigótica varía entre los vertebrados y esto se refleja
particularmente en la velocidad y el patrón de los clivajes tempranos, en
consecuencia en la morfología de la blástula (Solnica-Krezel, 2005). Los peces y las
ranas se desarrollan externamente y la velocidad de su desarrollo embrionario,
asegura que se formen rápidamente larvas independientes (Solnica-Krezel, 2005).
Estos embriones constan de un gran almacenaje de energia en la forma de vitelo y
de determinantes maternos que median el desarrollo, hasta el estadío de blástula
media, cuando el genoma cigótico se vuelve transcripcionalmente activo y toma el
25
control (Newport & Kirscher, 1982; Kane & Kimmel, 1993). El vitelo está
generalmente concentrado en el hemisferio vegetal y se distribuye en las
blastómeras vía el clivaje completo, como en los embriones de rana, o se deposita
en una célula vitelina separada, como se observa cuando el clivaje es incompleto en
los embriones de peces y aves. Por lo tanto, la blástula de los peces consiste en un
grupo de blastómeras en la región animal, sobre una gran célula sincicial vitelina
(Solnica-Krezel, 2005).
Los embriones pueden ser básicamente de dos tipos, en función de como se
establece el destino de sus células, (a) mosaico: el destino celular está establecido
por la localización de determinantes maternos, los cuales son diferencialmente
heredados, (b) regulatorios: la interacción celular determina el destino celular. En
general se considera que los amniotas (aves y mamíferos) son extremadamente
regulatorios, mientras que la mayoria de los invertebrados, cordados inferiores y
anamniotas son más mosaico. Además existen otras diferencias como el tamaño del
huevo, el momento de inicio de la transcripción cigótica y la velocidad del desarrollo.
Sin embargo, entre los vertebrados se ha descubierto que existe una gran
conservación entre los mecanismos intercelulares de señalización, los que regulan el
destino celular y la polaridad embrionaria antes de la gastrulación (Stern, 2006).
Los embriones de vertebrados tempranos además del eje animal-vegetal,
establecen un segundo eje que es usualmente referido como anterior-posterior (A-P)
en los amniotas y dosal-ventral (D-V) en los anfibios y peces. Se ha visto que estos
ejes están determinados tempranamente por gravedad en el pollo y por el punto de
entrada del espermatozoide en la rana (Eyal-Giladi, 1997). La formación de este
segundo
eje
establece
la
región
del
organizador
en
un
lado
de
la
blástula/blastodermo y por lo tanto impone una simetría bilateral en el embrión
vertebrado (Spemann & Mangold, 1924).
En todos los vertebrados los mecanismos genéticos y moleculares presentes
en la inducción de las hojas embrionarias, involucran cascadas de factores de
transcripción y vías de señalización altamente conservadas, que resultan en una
distribución relativamente similar de las hojas embrionarias en los diferentes
embriones de vertebrados durante la gastrulación (Solnica-Krezel, 2005). La
26
inducción de los precursores del endodermo y mesodermo, involucra la señalización
mediante ligandos de Nodal de la superfamilia TGF-β (Transforming Growth Factor
beta), aunque las vías moleculares que activan la expresión de los genes nodal
inicialmente pueden ser distintas (Shier, 2004).
El evento crucial de rompimiento de la simetría temprana, involucra el
transporte asimétrico a lo largo de microtúbulos de determinantes dorsales tanto en
rana como en pez cebra (Elinson & Rowning, 1988, Jesuthasan & Strahle, 1997).
Este proceso culmina con el enriquecimiento y la localización nuclear de β-catenina,
un efector transcripcional de la vía de señalización Wnt canónica, en la futura región
dorsal de la blástula, la región señalizadora conocida como el centro de Nieuwkoop
(Schneider et al., 1996). A su vez β-catenina activa vías genéticas que establecen al
organizador en la región dorsal de la gástrula. Los genes blanco de β-catenina
incluyen a los genes nodal o genes que promueven la expresión de nodal,
generando un gradiente dorso-ventral de actividad de señalización de Nodal
(Gritsman et al., 2000). Probablemente uno de los roles principales del organizador
es limitar la actividad ventralizante y posteriorizante de BMP (Bone Morphogenetic
Protein) y ligandos de Wnt canónico, durante la gastrulación. β-catenina promueve la
producción de antagonistas secretados de Wnt y BMP, además de factores de
transcripción como Bozozok en pez cebra. También promueve la expresión de
factores de la familia FGF (Fibroblast Growth Factor), así como de sus reguladores
negativos. La expresión de FGF en la región dorsal del embrión, contribuye al
establecimiento del patrón dorso-ventral, restringiendo la expresión de los genes
BMP (Furthauer et al., 2004).
La plasticidad de los embriones tempranos de pez cebra y pollo, abre la
interrogante de cómo se integra el blastodermo para formar un solo embrión.
¿Existen mecanismos similares que previenen la formación de organizadores
ectópicos durante la gastrulación, así como de líneas primitivas ectópicas durante la
polarización inicial del blastodermo? (Joubin & Stern, 2001).
En particular en el pez cebra el vitelo parece ser una estructura
extraembrionaria importante como recurso de señales tempranas que generan
patrones, y es esencial para la induccción celular dorsal y marginal. Los
27
determinantes dorsales están localizados en el polo vegetal del embrión. La
naturaleza molecular de dichos determinantes dorsales se desconoce, pero se sabe
que su función está relacionada con la estabilización y translocación nuclear de βcatenina a la futura región dorsal y la activación de genes como bozozok, chordin,
dickkopf1 (dkk1) y squint (sqt) (Schneider et al., 1996). Luego de la transcripción
cigótica sqt y β-catenina se concentran en la zona dorsal del YSL. Este proceso
establece el organizador de la blástula en el lado dorsal del embrión, el cual es
comparable con el centro de Nieuwkoop de anfibios (Schneider et al., 1996).
El cigoto de pollo está también dotado de una gran cantidad de vitelo y divide
el citoplasma celular incompletamente formando células pequeñas al centro de la
célula vitelina. Las divisiones posteriores generan un epitelio monolaminar grueso, el
epiblasto. Este tejido va a dar origen al embrión y consiste en una zona central (zona
pelúcida) rodeada por una zona periférica (área opaca). Por debajo de ésta capa
superficial se ubica el endodermo primitivo, conocido como hipoblasto primario,
mientras que el hipoblasto secundario (endoblasto) marca la futura región posterior
del blastodermo (Kochav, et al., 1980). Si bien estos tejidos forman estructuras
extraembrionarias, juegan un papel activo en el establecimiento de patrones en el
embrión (Keller & Davidson, 2004). En el pollo existen tres tejidos extraembrionarios
que parecen estar involucrados con la inducción de la línea primitiva:
1- El hipoblasto primario/endoblasto, el cual se forma debajo del epiblasto
embrionario antes de la gastrulación e inhibe la formación de la línea primitiva, y es
desplazado posteriormente por el endoblasto hacia la zona anterior,
2- La hoz de Koller parece contribuir con células a la formación de la línea
primitiva (Izpisua-Belmonte et al., 1993; Bachvarova et al., 1998, Callebaut et al.,
1998a; 1998b),
3- La zona marginal posterior (PMZ), el cual es un tejido que induce la
formación de una línea primitiva ectópica, si es transplantado en un embrión
temprano (Khaner et al., 1985), pero sin contribuir con células a la línea primitiva
inducida. A su vez las vías Vg1/Nodal y Wnt8C/β-catenina nuclear están activas en
la PMZ del pollo (Hume & Dodd, 1993). Parecería que la PMZ es la única que
cumple todos los requisitos para ser el equivalente al centro de Nieuwkoop en pollo:
28
actúa antes de la gastrulación, e induce la formación de un organizador pero sin una
contribución celular a las estructuras axiales (Joubin & Stern, 2001).
En resumen, se propone que los tres tejidos (hipoblasto/endoblasto, hoz de
Koller y PMZ) tienen una actividad inductora del eje, teniendo la habilidad de influir
en la formación de la línea primitiva. Sin embargo, sus mecanismos de acción e
importancia relativa difieren. La hoz de Koller tiene capacidad inductiva pero
probablemente solo porque contiene células destinadas a formar el nodo de Hensen.
La influencia más temprana viene dada por la PMZ, donde se solapa la actividad de
Vg1 y wnt. La actividad de ambos genes induce la expresión de Nodal en el área del
epiblasto vecina, pero Nodal es capaz de actuar (induciendo el mesendodermo)
únicamente una vez que el hipoblasto (que expresa Cerberus) ha sido desplazado
por el endoblasto (Stern, 2004).
El hipoblasto es uno de los tejidos que se forma más tempranamente en el
embrión de pollo y expresa Cerberus el cual inhibe a Nodal, expresado por el
epiblasto. La línea primitiva solo se puede formar una vez que el hipoblasto fue
desplazado por otro tejido extraembrionario, el endoblasto, que no expresa
Cerberus. Por lo tanto este mecanismo controla tanto el momento, como la posición
en la formación de la línea primitiva (Bertocchini & Stern, 2002).
En amniotas, la línea primitiva es el sitio de formación de mesodermo y
endodermo, donde la parte más anterior (incluído el nodo de Hensen) origina el
mesodermo más dorsal/axial y el endodermo definitivo. Progresivamente las
regiones más posteriores dan origen al mesodermo ventral/lateral, así como al
extraembrionario (Psychoyos & Stern, 1996). La iniciación de la actividad de
señalización de Nodal ocurre una vez que el hipoblasto fue desplazado lejos del sitio
de formación de la línea primitiva, lo cual permite que comience el proceso de
formación del mesodermo, pero al mismo tiempo se generan gradientes de la
actividad de Nodal, los que van a contribuir eventualmente, a generar patrones en
los descendientes de la línea primitiva. El eje antero-posterior de la línea va a
corresponder con el eje axial-lateral del mesodermo (Bertocchini & Stern, 2002).
Por lo tanto las vías que involucran la señalización por Vg1, Wnt, Nodal, FGF
y BMP, son altamente conservadas en los vertebrados, independientemente de si los
29
embriones de éstos, son principalmente regulatorios o mosaico, en términos del
mecanismo que establece las asimetrías de destino celular en el embrión temprano
(Stern, 2006).
2.7.- El primordio de la cola: ¿una continuación de la gastrulación?
El desarrollo de la región posterior del embrión (región lumbosacra y cola) en
los vertebrados está retrasada en el tiempo en relación a la gastrulación. En
amniotas esta ocurre mediante el reemplazo del nodo en regresión y la línea
primitiva por una masa celular de tipo blastema de mesénquima, conocida como el
primordio u organizador de la cola (“tailbud”). Esta se ubica a continuación de las
estructuras axiales (tubo neural, notocorda, intestino) y paraxiales (somitos),
formadas en etapas tempranas de la gastrulación (Kispert et al., 1995). Por otro lado
se describió que el primordio de la cola expresa bra en amniotas (Kispert et al.,
1995). Se sugiere que el desarrollo de la cola en amniotas es en esencia una
continuación de la gastrulación, al igual que en anfibios (Knezevic et al., 1998).
En este período ha terminado tanto el ingreso masivo de células del epiblasto
para formar tejido axial, así como la formación de nuevo endodermo. Además el
nodo comienza a perder su capacidad de inducir tejido neural (Stern, 2004).
En el pez cebra, al inicio de la gastrulación las células marginales convergen y
se extienden de acuerdo a su posición a lo largo del eje dorso-ventral. Mientras que
las células marginales dorsales involucionan y se extienden hacia el polo animal, las
más ventrales (llamadas células de la zona de “no convergencia y no extensión”) se
desplazan sobre el vitelo. Al final de la gastrulación, la agregación de las células
marginales, establece el primordio de la cola, el cual contiene células derivadas del
organizador dorsal y células marginales ventrales (Kanki & Ho, 1997). Por lo tanto, la
formación de la región caudal del embrión de pez cebra, no resulta de la actividad de
un organizador dorsal, sino que de la actividad de un organizador independiente, el
organizador de la cola, localizado en el margen ventral de la blástula y el cual resulta
de la triple estimulación de las vías de señalización BMP, Nodal y Wnt8 (Agathon, et
al., 2003).
30
3.- Gastrulación en peces teleósteos
La observación directa de los embriones translúcidos de peces teleósteos ha
aportado evidencia crucial sobre la forma en que las células se mueven durante la
gastrulación. Todos los movimientos descritos a la fecha en los teleósteos tienen su
contraparte en otros organismos vertebrados (Kimmel et al., 1989) (Figura 4). En
particular, la gastrulación de los teleósteos parece ser cualitativamente muy similar a
aquella de los anfibios, mientras que la gastrulación de los anfibios comparte mucho
con la de los reptiles, aves y mamíferos (ver Fig. 4). Es posible entonces que exista
más uniformidad evolutiva durante el desarrollo temprano de los vertebrados de lo
que antes se creía (Trinkaus, 1990). A su vez los mapas de destino son
suficientemente consistentes entre los distintos organismos vertebrados, como para
pensar que ciertos mecanismos, que permiten el establecimiento de patrones
corporales, se han conservado durante la evolución (Tam & Quinlan, 1996) (Figura
4). La importancia de comparar los mismos procesos del desarrollo en diversos
organismos radica, entonces, en dilucidar los mecanismos conservados que
permitan explicar la generación del plan corporal básico en estos organismos.
Dentro de los vertebrados, los peces representan el grupo más grande y diverso.
Su posición evolutiva relativa a otros vertebrados, así como su habilidad para
adaptarse a una amplia variedad de ambientes, los transforma en un excelente
modelo experimental (Powers, 1989). Los teleósteos son un grupo monofilético de
peces óseos muy diverso, que pertenecen a la subclase Actinopterygii (Nelson,
1984).
El pez cebra (Danio rerio) es un teleósteo que representa uno de los
organismos de estudio de vertebrados más utilizado en biología del desarrollo. En
este modelo ha sido posible realizar estudios de genómica funcional y mutagénesis,
lo que ha permitido avanzar en el conocimiento de genes importantes durante el
desarrollo. Otros peces teleósteos, como son Fundulus y Orizias latipes (Medaka),
presentan un desarrollo embrionario similar al de pez cebra, en particular durante el
proceso de gastrulación, donde se generan estructuras celulares equivalentes como
son el anillo germinal y el escudo embrionario. A este modelo de gastrulación que
31
involucra a la mayoría de los teleósteos estudiados hasta el momento le llamaremos:
“gastrulación tipo”.
3.1.- Gastrulación “tipo” en peces teleósteos
Si bien hablar de características típicas o atípicas dentro de los teleósteos
probablemente no sea conceptualmente muy correcto, considerando que éste es el
grupo de peces más diverso y especiado de los existentes y que sólo una decena de
especies han sido investigadas a nivel de biología del desarrollo, para los efectos de
este trabajo y con el fin de facilitar la discusión de los objetivos que se abordarán,
haremos esta distinción. Dentro del grupo de especies con gastrulación “tipo” se
encuentra el pez cebra (Warga & Kimmel, 1990), Medaka (Iwamatsu, T., 1994),
Fundulus heteroclitus (Armstrong & Child, 1965), Barbus conchonius (Gevers &
Timmermans, 1991) y salmónidos (Ballard,1973a). El elemento común entre estas
especies es que la gastrulación es un fenómeno concomitante a la epibolia, y que
acontece a partir de un grupo de células localizadas en el polo animal del huevo
telolecito (blástula) (Figura 5). Debido a que Fundulus y pez cebra han sido los
organismos más estudiados dentro de este grupo a nivel de la gastrulación, nos
referiremos a ellos como representantes del modelo de gastrulación “tipo”, y
entregaremos información relevante a otras especies cuando sea necesario.
En anfibios y peces la gastrulación es precedida y acompañada por la epibolia
(Solnica-Krezel & Driever, 1994). Previo al inicio de la epibolia en el pez cebra ocurre
la transición de la blástula media (entre los ciclos 10 y 13 de división celular) donde
las células pierden la sincronía y comienza la expresión del genoma embrionario
(Kane & Kimmel, 1993). Es durante este período donde el blastodermo se separa en
tres dominios. Las células del margen del blastodermo colapsan y liberan sus
núcleos hacia el vitelo subyacente, constituyéndose la capa vitelina sincicial (yolk
syncytial layer o YSL), la cual será en parte responsable del movimiento del
blastodermo hacia el polo vegetal (epibolia). Las células más externas del
blastodermo se vuelven epiteliales y forman la capa celular envolvente (enveloping
layer o EVL): tejido extraembrionario que cubrirá al blastodermo. Las células
32
restantes entre ambas capas se denominan blastómeras profundas (BP) y son las
que experimentarán los movimientos celulares de la gastrulación y formarán
finalmente al embrión (Kane & Warga, 1994).
33
A.
D. rerio
blástula
(domo)
50% epib.
anillo emb.
escudo emb.
75% epib.
100% epib.
“tailbud”
e
B. Austrolebias
blástula
60% epibolia
100% epib.
eje emb.
reagregación
BP
EVL
YSL
BP
BP
A
EE
Figura 5.- Esquema que compara algunos estadíos del desarrollo embrionario de D.rerio
(A) y Austrolebias (B). Nótese la similitud entre los estadíos más tempranos, blástula. Cabe
destacar la ausencia de estructuras equivalentes al anillo y escudo embrionario en
Austrolebias (60% de epibolia). Líneas de colores entre A. y B. representan: rojo: período de
blástula, azul: proceso de epibolia, verde: morfogénesis. Nótese la separación de los procesos
de epibolia y morfogénesis en Austrolebias, los cuales están solapados en D. rerio a partir del
estadío de escudo embrionario. A. Arriba: vista lateral, e. escudo embrionario, B. flecha. indica
dirección de movimiento, PB. blastómera periférica, BP. blastómera profunda, Sc. cavidad de
segmentación, YSL. capa vitelina sincicial, EVL. capa envolvente, Sl. capa sincicial, A.
agregado celular, EE. eje embrionario. A. Modificado de Kimmel et al., 1995, B. Modificado de
Arezo et al., 2005.
34
Al comienzo de la gastrulación, las blastómeras profundas que contribuirán al
endomesodermo se mueven hacia las capas inferiores por todo el margen del
blastodermo (blastoporo) formando el anillo germinal, mientras que las que
permanecen en la superficie formarán el ectodermo (Warga y Kimmel, 1990; Kane &
Adams, 2002). El anillo germinal está constituído por dos capas de blastómeras: una
superficial (epiblasto) y una profunda (hipoblasto). Cabe señalar que aunque esta
terminología es la misma usada en el desarrollo del embrión de pollo, dichas
estructuras no tienen homología con la de los peces (Eyal-Giladi, 1997; Collazo et
al., 1994). En estos grupos el hipoblasto se forma por diferentes procesos
morfogenéticos, y en el caso del pollo sus células no contribuyen a la formación de
tejidos embrionarios. Se ha sugerido que la formación del hipoblasto, y por lo tanto
del anillo germinal, ocurre por involución (Warga y Kimmel, 1990), ingreso (CarmanyRampey & Shier, 2001) o delaminación (Montero, et al., 2004) en pez cebra, ingreso
en Fundulus (Trinkaus, 1996) y delaminación en salmón (Ballard, 1966). En
Fundulus se ha visto que, previo a la migración de las células endomesodérmicas,
existe una constricción de la región apical de éstas (Trinkaus, 1984,1996) pero no se
conoce el mecanismo subyacente. Además se sabe muy poco de los cambios que
ocurren en las asociaciones célula-célula durante este proceso en teleósteos, tanto
las que ocurren en el epiblasto, como cuando las células migran formando parte del
hipoblasto. Tampoco están claras las interacciones que ocurren entre las células del
epiblasto y las del hipoblasto. Las células del blastodermo superficial parecen
ingresar autónomamente y probablemente necesiten estar especificadas como
células mesendodérmicas a fin de ser competentes para ingresar (Carmany-Rampey
& Shier, 2001). Si bien los cambios de forma celular parecen preceder siempre al
proceso de ingreso, estos no parecen dirigirlo; más bien los cambios en las
afinidades adhesivas parecen ser los responsables de la de-epitelialización e ingreso
desde la superficie epitelial. La expresión de cadherinas e integrinas permitiendo la
interacción tanto entre células como con la matriz extracelular en posiciones más
profundas, podrían ser importantes para el movimiento de las células desde la capa
epitelial, y son claramente importantes para la migración que ocurre alejándose del
punto de ingreso hacia el polo animal del embrión, así como la correcta asociación
35
con los tejidos profundos (Shook & Keller, 2003; Babb et al., 2001; Babb and Marrs,
2004; Kane et al., 2004; Montero et al., 2005).
Luego de la formación del anillo germinal las blastómeras profundas
convergen dorsalmente para formar el escudo embrionario (Fig. 5A). Esta estructura
representa el equivalente al labio dorsal del blastoporo en anfibios, donde se
encuentra un centro de señalización llamado organizador de Spemann (Spemann &
Mangold, 1924). El organizador está ubicado en el mesodermo dorsal e induce la
especificación y regionalización del eje embrionario dorsal del embrión, tanto en
peces como en anfibios (Harland & Gerhart, 1997; Schier &Talbot, 1998)
La región dorsal de la gástrula, posteriormente se angosta por medio de
intercalación medio-lateral (convergencia) y se extiende a lo largo del eje anteroposterior (extensión) por migración activa de sus células. Luego de este proceso y a
medida que la epibolia avanza, comienza la formación del eje embrionario y la
neurulación (Collazo et al., 1994; Keller, 2003). En el pez cebra cuando la epibolia
culmina se puede distinguir un primordio de cola prominente y es posible diferenciar
la notocorda de la placa neural (Kimmel et al., 1995) (Fig. 5A).
3.2.- Gastrulación “atípica": peces anuales, Austrolebias
Las características fundamentales de la gastrulación “atípica” de peces
teleósteos son dos. Primero, los procesos de epibolia y gastrulación están separados
tanto en el tiempo como en el espacio. Segundo, la gastrulación no acontece a partir
de un grupo de células congregadas en el hemisferio animal del huevo telolecito
(blástula), sino más bien, a partir de un grupo disperso de células que cubren la
totalidad del huevo y se agregan en un punto del embrión. Este tipo de gastrulación
acontece en los denominados peces anuales (Figura 5B).
El proceso de epibolia implica, al igual que en otros teleósteos, la migración
hacia el polo vegetal de las tres capas que se han generado: EVL, blastómeras
profundas y YSL. Pero en Austrolebias a diferencia de lo que ocurre en los
teleósteos “tipo” la epibolia no se da concomitantemente con la gastrulación (Figura
6). Por lo tanto, mientras la epibolia ocurre y hasta que culmina, no se forma ninguna
36
estructura embrionaria como el anillo germinal o el escudo embrionario
(característicos de los teleósteos con gastrulación tipo). Durante la epibolia y
probablemente debido al limitado número de células (aproximadamente 200 células
al inicio) las blastómeras profundas se dispersan sobre el vitelo. Cuando este
proceso culmina (100% de epilobia, 44 - 48hpf) (ver Tabla 1) el embrión se
encuentra en la fase de dispersión y toda la masa de vitelo esta cubierta por dos
capas concéntricas, la EVL y el YSL. En el espacio entre estas dos capas, las
blastómeras profundas están distribuidas aisladamente en toda la superficie del
huevo, formando una capa celular discontinua. No existe en este estadío ninguna
estructura multicelular organizada, ni células que recuerden a las células precursoras
(forerunner cells) de otros embriones. Las células profundas tienen aspecto
ameboideo y son activamente móviles. La gran gota lipídica que poseen estos
embriones en su vitelo (formada por coalescencia de otras de menor tamaño)
inicialmente se desplaza por el vitelo en función de la gravedad, pero en el estadío
de dispersión adquiere una posición periférica (Wourms, 1972a; Carter & Wourms,
1991).
En el estadío de dispersión los peces anuales pueden entrar en la primera
diapausa, que como ya se mencionó, para el caso de Austrolebias, es facultativa
(Wourms, 1964).
Posteriormente comienza el período de reagregación (definido por Wourms,
1972a) al inicio del cual lo primero que se observa es la protrusión de la gota lipídica
desde el vitelo, casi hasta la mitad de su volumen y por lo tanto se fija en una
posición determinada del embrión (Wourms, 1972a). Luego de esto se observa un
incremento paulatino en el número de células en un único punto del embrión (esto
ocurriría en el hemisferio vegetal del embrión, en relación a la gota lipídica que
siempre se dispone hacia arriba, Wourms, 1972a). Esta acumulación de células
ameboideas ocurre por migración de éstas hacia la zona de reagregación, las que
aumentan los contactos entre ellas formando un reagregado definido consistente en
una monocapa de células (Reagregación1). A medida que el desarrollo transcurre, el
área de reagregación aumenta de tamaño, por incremento en el número de células,
las que se disponen muy próximas entre sí en el centro del reagregado celular,
37
dificultando la distinción de los límites celulares (Reagregación 2). En éste estadío el
reagregado celular consiste en una monocapa de células en la periferia,
presentando multicapas en el centro (Wourms, 1972a, 1972b). Posteriormente el
reagregado celular adquiere una forma de disco lenticular, siendo mucho más
grueso en el centro que en la periferia y aumentando bastante su área a medida que
disminuye el tamaño de las células que lo componen (Reagregación 3). El siguiente
estadío se caracteriza por un aumento importante en el área y masa del reagregado
celular, donde los límites celulares son indistinguibles (Reagregado celular 4). El
último estadío de reagregación descrito, involucra un aumento en el tamaño del
reagregado celular a la vez que una distorsión en la forma, pasando de discoidal a
elipsoidal (mirando el reagregado celular desde arriba) (Reagregación 5) (Wourms,
1972a, 1972b). El eje mayor del reagregado celular 5 coincide con la dirección de
formación del eje embrionario.
Cabe destacar que entre cada uno de estos estadíos de reagregación
transcurren aproximadamente 24 horas y que desde la fecundación hasta que el
embrión llega a un estadío de reagregación 5, han pasado entre 9 y 12 días (ver
Tabla 1) (Arezo et al., 2005). Alrededor de 30 minutos después que se forma el
reagregado celular final, se puede observar la formación del eje embrionario. Lo
primero que se identifica de esta organización axial, es el alineamiento de las células
superficiales del reagregado celular, el que coincidirá posteriormente con el lugar en
el que se formará la quilla neural. Esta es la primera estructura embrionaria típica
que se observa en este organismo. Dicha estructura se extiende a lo largo del
reagregado celular y en uno de sus extremos se puede observar un cuerpo esférico
conspicuo, probablemente el equivalente a la vesícula de Kupffer. Posteriormente
comienza a observarse la formación de los somitos y el embrión adquiere
características similares a otros teleósteos (Wourms, 1972a).
En esta descripción del desarrollo de Austrolebias se utilizó la palabra
“reagregado” (Wourms, 1972a) para nombrar al agregado celular. A continuación se
utilizará la denominación agregado celular para referirse a dicha estructura (ver
Resultados).
38
Tabla 1 Comparación de tiempos post-fecundación entre peces anuales y no
anuales.
Estadío
Peces anuales
Peces no anuales
A. viarius
(25ºC)
A. myersi
(25ºC)
N.korthausae
(25ºC)
A. whitei,
nigripinnis,
constanciae
(28ºC)
Clivaje
1 día
7 hs
15 hs
9 hs
2 hs
10 hs
Formación
blástula
3 días
20 hs
24 hs
20-22 hs
5 hs
24 hs
Epibolia
7 días
44-48 hs
51 hs
44-48 hs
11 hs
40 hs
Agregación
12 días
9 días
3 días
9 días
Eje
embrionario
13 días
9.5 días
4 días
9.5 días
Somitogénesis
(0-10 pares)
16 días
11 días
6 días
11 días
D. rerio
(28ºC)
F.heteroclitus
(20ºC)
37 hs
14 hs
56 hs
Peces anuales: A. viarius, A. myersi (Wourms, 1972a), N. korthausae (Van Haarlem, 1983), A.
whitei, A. nigripinnis, A. constanciae (Carter & Wourms, 1991). Peces no anuales: D. rerio (Kimmel
et al. 1995); F. heteroclitus (Armstrong & Child, 1965). Los tiempos representan horas y días
postfecundación. Modificado de Arezo et al., 2005.
39
3.3.- Semejanzas y diferencias entre Austrolebias y otros organismos
vertebrados
Si bien los peces teleósteos presentan un huevo con gran cantidad de vitelo y
por lo tanto clivaje parcial o meroblástico, donde se genera finalmente (en varios de
ellos) una blástula desplazada hacia el polo animal, los mecanismos por los cuales
estos organismos generan un eje embrionario al culminar la gastrulación, difieren al
menos en su aspecto. En los teleósteos “tipo” el modo de movimiento de las células
endomesodérmicas para formar inicialmente un embrión bilaminar es controversial,
pero en cualquier caso éste ocurre a través de todo el borde del blastodermo
(homólogo al blastoporo de Xenopus). En Austrolebias no existe ninguna estructura
que recuerde este “blastoporo” de los peces con gastrulación tipo y la primera
estructura donde se puede reconocer más de una capa de células durante su
desarrollo, corresponde al agregado celular. Como ya se mencionó la formación del
eje embrionario ocurre a partir de este grupo de células, las que se agregan luego de
haberse dispersado durante el proceso de epibolia. La morfología discoidal de este
agregado celular recuerda más a la del blastodisco de un embrión de pollo que al
blastodermo de los teleósteos con gastrulación “tipo”. Estas similitudes plantean la
interrogante de sí, debido a la influencia de esta geometría tan particular, las
especies de Austrolebias estarán utilizando movimientos similares a los descritos en
pollo a la hora de originar las hojas embrionarias y finalmente el plan corporal básico
del embrión. A la fecha, sin embargo, no hay ningún estudio que haya abordado esta
posibilidad, y por lo tanto se desconoce si en Austrolebias se desarrollan estructuras
similares al nodo de Hensen y surco primitivo. Por otro lado, se desconoce si los
mecanismos celulares que participan en la formación de las hojas embrionarias en
Austrolebias, son del tipo ingreso, delaminación y/o involución.
En todas las especies de vertebrados estudiadas hasta la fecha se han
identificado estructuras análogas al organizador de Spemann. Este centro expresa
genes específicos como es el caso de goosecoid y chordin. El gen gsc, en particular,
es muy conservado en la evolución (se ha visto la presencia de un homólogo de este
gen en diversas especies de vertebrados
40
[Blum et al., 1992]), y su análisis de
expresión es sumamente útil para estudios comparados (De Robertis et al., 1992).
En los vertebrados, la formación de la línea media ocurre por una elongación
secuencial bajo la fuerza directriz del organizador y ésta siempre aparece del mismo
lado que el organizador (Meinhardt, 2004). En Austrolebias, tal como se mencionó
previamente, la morfogénesis se produce a partir de un agregado celular inicialmente
de pocas células, el que aumenta en número y complejidad a medida que transcurre
el tiempo y donde finalmente se forma el eje embrionario. Teniendo en consideración
los estudios previos que muestran la existencia, en todos los vertebrados de una
región organizadora que coincide finalmente con la región donde se formará el eje
embrionario, es posible que el agregado celular temprano de Austrolebias
corresponda al homólogo del organizador de Spemann de Xenopus. El estudio de la
expresión de marcadores específicos de organizador, como es el caso de gsc, en los
estadíos de agregación en Austrolebias, será de gran utilidad para verificar esta
idea.
Por todo lo anterior, el modelo Austrolebias, con su desarrollo “atípico” puede
ser utilizado para responder preguntas básicas sobre la conservación de los
mecanismos celulares morfogenéticos que operan durante la gastrulación de un
organismo donde la epibolia parece estar desacoplada de éste proceso.
Burggren y Warburton plantean que: “numerosos descubrimientos han
resultado de la focalización y persistente investigación en ciertos organismos, como
son la mosca de la fruta (Drosophila), el pez cebra (Danio rerio), el pollo (Gallus
gallus), el gusano nemátodo (Caenorhabditis elegans), el ratón (Mus musculus) o
plantas como Arabidopsis. En muchos casos, sin embargo, los organismos modelo
han emergido simplemente por las ventajas metodológicas que ofrecen, y porque
fueron las primeras especies en ser investigadas en un contexto en particular. El
estudio de nuevos organismos animales, por lo tanto, es fundamental para lograr un
entendimiento profundo de los procesos del desarrolo, ya que permite entender
cuánto de los hallazgos realizados en los organismos clásicos son generalizables y
cuántos correspondedn a caracteres derivados propios de cada linaje” (Burggren &
Warburton, 2005).
41
Hipótesis de trabajo
En Austrolebias el agregado celular corresponde a la gástrula y el patrón de
gastrulación sería similar al observado en otros embriones discoidales (como el de
pollo).
Objetivo general
Estudiar el patrón morfogenético y la expresión de genes durante la gastrulación en
peces anuales del género Austrolebias, así como describir los mecanismos celulares
morfogenéticos involucrados en la formación del endomesodermo.
Objetivos específicos
1- Caracterizar el proceso de agregación celular en Austrolebias.
2- Determinar los cambios morfológicos y de dominios de expresión de genes
marcadores del blastoporo y organizador, durante la agregación celular.
3-. Estudiar el destino de las células que forman el agregado celular.
4- Explorar los movimientos celulares morfogenéticos involucrados en el proceso de
internalización del endomesodermo.
42
Metodología
1.- Mantenimiento y reproducción de los adultos, cultivo y manejo de
embriones
El presente estudio se realizó en dos especies del género Austrolebias: A.
bellottii (Steindachner, 1881) y C. charrua (Costa et al., 2001), las cuales fueron
seleccionadas en función de la resistencia de los individuos adultos al cautiverio, su
amplia distribución geográfica y sus relaciones filogenéticas bien establecidas.
Se
establecieron
las
condiciones
ideales
para
el
mantenimiento
y
reproducción. como son el tipo y fórmula del agua a utilizar. El agua para los
acuarios se preparó según la siguiente formula: a 110 litros de agua obtenida por
osmosis reversa se agregaron 385g de Microsalt (Brustmann), 385g de Mineral Salt
(Sera) y 11 gotas de hierro líquido Ferrogan Sluid (Hobby), a partir de una dilución
stock en agua destilada: 1:4v/v. Esto genera agua con una conductividad de
aproximadamente 150µS y el pH se ajustó a 7, con bicarbonato de sodio. El ciclo de
luz/oscuridad fué de 12h/12h, la temperatura se mantuvo en 20˚C ± 2. Se utilizó
filtración biológica en los acuarios, mediante filtros de esponja y se adicionó una
gran concentración de plantas (lo cual genera lugares de refugio para los peces y
disminuye el estrés). Todos los peces, tanto alevines como adultos, recibieron
alimento vivo (nauplios de Artemia salina y lombrices). A su vez se establecieron las
dimensiones óptimas de los acuarios según la edad de los peces y los objetivos de
uso (eclosión, mantenimiento y cruzamiento). Los cruzamientos se realizaron con
peces agrupados en tríos (2 hembras y un macho) o cuartetos (3 hembras por cada
macho).
Debido a que estas especies presentan fecundación externa y además
necesitan enterrarse para poner sus huevos, es imprescindible suministrarles un
sustrato. Por lo tanto, y a fin de obtener embriones en cada acuario de cruzamiento,
se les colocó un recipiente conteniendo un sustrato vegetal (turba) durante un
período variable, dependiendo del objetivo para el cual se colectarán los embriones.
Previo a su uso los embriones extraidos de la turba se limpiaron mediante rotación
43
con un pincel sobre un papel absorbente húmedo. Cuando fue necesario obtener
individuos adultos, la eclosión de los embriones se logró mediante el semi-secado
del sustrato (conteniendo los huevos) y almacenado en una bolsa plástica en
oscuridad, por un tiempo mínimo de 3 meses. Luego de este período el sustrato fué
colocado en un acuario de eclosión con agua y se obtuvo una nueva generación de
alevines.
El cultivo de embriones se realizó en una solución isotónica ERM (Embryo
Rearing Medium: NaCl 17.1 mM, KCl 402 μM, CaCl2 2(H2O) 272 μM, MgSO4 7(H2O)
661 μM pH 6.3) a 25˚C. En estas condiciones no se han registrado eventos de
diapausa I.
Con la finalidad de obtener embriones más translúcidos y así poder
observarlos con diversas técnicas de microscopía, los embriones fueron “pelados”
previo a la observación, lo cual implica la remoción de las proyecciones filamentosas
que contiene el corion, cortándolas mediante el uso de un bisturí.
La inyección de los embriones se realizó mediante el uso de agujas
preparadas a partir de capilares de borosilicato con filamento interno (OD: 1mm, ID:
0.58mm, largo: 10cm, Harvard Apparatus Ltd.). Estos capilares fueron estirados
mediante el uso de un puller (David Kopf Instruments, Model 740) utilizando los
siguientes parámetros: Solenoid 0, Solenoid delay 0 , Heat 1 14.9 y dist. 5.10. Este
método genera agujas de punta fina y relativamente cortas, a fin de atravesar
fácilmente el corion de Austrolebias.
2.- Análisis morfológico del proceso de agregación celular
2.1. Microscopía de campo claro
Con el fin de determinar y definir los estadíos a través de los cuales ocurre el
proceso de agregación, se realizaron observaciones con microscopía DIC y se
tomaron imágenes de los estadíos más representativos de este proceso. La
adquisición de los datos se realizó mediante el uso del programa Openlab
(Improvisión, Ltd.) en un computador Macintosh conectado a un microscopio
motorizado Nikon Eclipse E1000 y a una cámara CCD enfriada Hamamatsu Orca.
44
Los embriones fueron montados dentro de una cámara construida artesanalmente.
Dicha cámara consiste en 8 trozos de huincha aisladora pegadas unas sobre otras a
un portaobjetos. Posteriormente se recortó una ventana rectangular en el centro de
estas, dejando por tanto un espacio central libre. Este espacio (cámara) se llenó del
medio de cultivo de los embriones, donde se colocó al embrión en estudio cubierto
con un cubreobjetos, de tal modo que mediante la rotación del cubreobjetos se
permitiera la orientación, en la posición correcta, del embrión. En todos los estudios
microscópicos se utilizaron estas cámaras y en particular con microscopía confocal,
debido a que el microscopio utilizado es invertido, el cubreobjetos se fijó con grasa
siliconada, la cual fija el vidrio a la cámara pero permitiendo cierto movimiento, a fin
de poder orientar al embrión.
A su vez se realizaron observaciones y toma de imágenes en tiempo
extendido (“time lapse”) de embriones desde el estadío AII hasta AIV, utilizando la
óptica de campo claro de un microscopio confocal Spinning Disk Zeiss Axiovert 200,
utilizando objetivos de 10x y 25x.
2.2. Microscopía Confocal
En el estadío de una célula se co-inyectaron embriones con ARNm codificante
de las proteínas de fusión Gap43-GFP (con destinación a membrana, GFPm) y H2BRFP (con destinación nuclear, RFPn). Se realizaron observaciones y se registraron
imágenes en un Microscopio Confocal Espectral Olympus Fluoview FV1000 y en un
Microscopio de disco giratorio Zeiss Axiovert 200. Se utilizaron láseres de 488nm y
543nm del microscopio Olympus, así como láseres de 488nm y 568nm del
microscopio Zeiss. Se utilizaron objetivos de inmersión en agua 10x, 20x, 25x y 40x.
Los cortes ópticos en el eje z para 10x fueron de 1μm - 5μm y para los objetivos 20x
y 25x fueron de 0,5μm -1,5μm. Por lo tanto, se obtuvieron aproximadamente 15
imágenes para cada tiempo con 10x y unas 30 imágenes en promedio con 25x. La
frecuencia con que fueron tomadas las imágenes dependió del experimento. Con el
microscopio Olympus se tomaron imágenes cada 30-40min (AII y AIII), cada 4-6hs (a
partir de AIII tardío a eje tardío) con un objetivo 20x en agua. Se registraron
imágenes de distintos embriones a fin de cubrir un período total de desarrollo de
45
aproximadamente 7 días. Es decir, desde el estadío AII hasta el de eje tardío.
Posteriormente con el microscópio de disco giratorio Zeiss se tomaron imágenes
cada 2-5 minutos durante 4 a 48hs, en embriones de estadíos de RI a AIII tardío. En
todos los casos las imágenes fueron primero deconvolucionadas utilizando el
programa Huygens Professional (SVI, Hilversum, NL) y posteriormente el análisis
morfológico se realizó mediante el uso del programa Volocity (Improvision, Ltd.).
Este último programa tiene diferentes herramientas las que permiten el análisis de la
disposición de las células vistas mediante cortes ortogonales en el embrión, así
como realizar modelos 3D de cada grupo de imágenes en cada tiempo. Las
animaciones se realizaron a partir de las imágenes correspondientes a un valor
específico en z, para cada tiempo (elegido para ambos canales). Estas imágenes
fueron
procesadas
y
compiladas
utilizando
el
programa
ImageJ
(http://rsb.info.nih.gov/ij).
2.3. Cortes histológicos
Se realizaron cortes transversales semifinos seriados de embriones en los
estadíos de: AIII (n=2), AIV (n=2), RV (n=2), eje temprano (n=1), eje medio (n=1), eje
tardío (n=1) y 2 somitos (n=1). Los embriones fueron procesados según un protocolo
de rutina (ver apéndice). Luego de la inclusión de las muestras en bloques de Epon
810, cada uno de éstos bloques fue orientado y tallado. Mediante el uso de un
ultramicrótomo Sorvall Modelo MT5000 y con cuchilla de vidrio, se realizaron los
cortes semifinos seriados transversales de 0,7-0,9μm de espesor. Dado que los
embriones miden aproximadamente 600μm de diámetro, se obtuvieron en promedio
unos 600 cortes por embrión. Los cortes fueron colocados sobre porta-objetos
(aproximadamente 10 cortes por cada uno), teñidos con azul de toluidina y
montados con Entellan. Posteriormente se tomaron imágenes alineadas de un corte
por cada preparado. La alineación final de los cortes se realizó con el programa
Amira.
46
3.- Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de agregación
3.1.- Clonamiento de genes de interés
Se realizó la extracción de ARN total, de diferentes grupos de embriones
tempranos y tardíos, seleccionados en 12 estadíos diferentes. Se utilizaron en
promedio 12 embriones por estadío, tanto para A. bellottii como para A. charrua. Con
este fin se utilizó el método de extracción de Trizol, de acuerdo a protocolos del
fabricante. Los embriones fueron lisados y se sometieron a extracción con
cloroformo. Se recuperó la fase acuosa y el ARN se precipitó con isopropanol y se
centrifugó. El precipitado de ARN obtenido se lavó con etanol y luego se
resuspendió en 20µl de agua libre de ARNasa. El ARN extraído fue tratado con
ADNasa y su concentración se determinó corriendo una alícuota en un gel de
agarosa (entre 50ng/µl y 350ng/µl).
La transcripción reversa se realizó usando el kit “First Strand cDNA Syntesis”
(Super Script Kit, Fermentas) según protocolo del fabricante. Se transcribieron
aproximadamente 2µg de ARN en cada caso y se utilizó la enzima Super Script III
RT (200u/µl). La transcripción se realizó a 50ºC durante 50 min. y se terminó a 85ºC
por 5 min. y en hielo por 2 min. Para eliminar el posible ARN remanente se agregó
1µl de ARNasa H a cada tubo.
Con el fin clonar los fragmentos génicos de interés se diseñaron
oligonucleótidos degenerados, mediante la comparación de la secuencias conocidas
de los genes de interés en otros organismos. El alineamiento de dichas secuencias
se realizó mediante el uso del programa ClustalW. El diseño de los oligonucleótidos
fue manual, pero se utilizó el programa Oligo 6.8 para comprobar la calidad de éstos.
Mediante la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) se amplificaron y luego se
clonaron en el vector TOPO TA (Invitrogen, California, EE.UU.) fragmentos de las
secuencias codificantes de 12 fragmentos génicos de A. charrua y de A. bellottii.
En esta tesis centraremos el estudio en los genes goosecoid (gsc) y
brachyury (bra) para el caso del análisis del patrón de expresión espacial y además
α-tubulina (α-tub), como control positivo, en experimentos donde se analizó la
47
expresión temporal de gsc y bra. Los oligonucleotidos degenerados diseñados para
clonar gsc y bra fueron:
gsc:
F1-TGCCIRCYGGIATGTTYWSIATHGA
R1- CAYTTIGCICKICKRTTYTTRAACCA
bra:
F1- TTCAARGAGCTIACCAAYGAGATGAT
R1- TTGGCGAARGGGTTGTGYTTDATYTT
Donde I representa inosina, R (A/G), W (A/T), S (G/C), Y(C/T), K (G/T) y H
(A/C/T).
Para el caso de α-tub se utilizaron los oligonucleótidos diseñados previamente
para para el mismo gen de pez cebra. Estos son:
α-tub
F1- GGCACCGGTTCTGGCTTCAC
R1- CGGAGATCACTGGGGCATAGGTA
Las condiciones utilizadas en el PCR para el clonamiento de gsc fueron:
94˚
1min
94˚
1min
51˚
2min
72˚
4min
94˚
1min
56˚
2min
72˚
4min
5X
35X
Para el caso de bra estas fueron:
94˚
1min
94˚
1min
53˚
2min
72˚
4min
94˚
1min
58,8˚ 2min
72˚
5X
35X
4min
48
En todos los casos se utilizaron 0,5µl de la enzima Taq polimerasa de Qiagen en
un volumen total de 20µl por tubo.
Los fragmentos génicos amplificados fueron separados en un gel de agarosa al
1,5% desde el cuál se cortó la banda en cada caso y se purificó usando un kit para
la extracción por elusión del ADN desde un gel (QIAquick Gel Extraction Kit,
Qiagen). Los fragmentos purificados fueron clonados en el plasmidio TOPO TA
(Invitrogen) según indicaciones del fabricante. Usando bacterias electrocompetentes
se electroporó el plasmidio ligado con el inserto y se cultivaron las células en placas
de agar con ampicilina 0,5mg/ml y X-gal/IPTG, para distinguir colonias que contienen
plasmidios recombinantes. Las colonias seleccionadas (18 colonias para cada gen)
conteniendo el inserto (blancas) se cultivaron en medio líquido LB con ampicilina
(50mg/ml), toda la noche a 37˚C. A partir de dichos cultivos se realizó la preparación
de plasmidios (“Minipreps”). Para esto se utilizó el Fast Plasmid Mini kit (Eppendorf)
y se siguieron las indicaciones del fabricante. Con el fin de seleccionar clones para
secuenciar se realizaron para cada muestra dos digestiones, una con EcoRI y otra
con HinfI durante 1h 30min. a 37˚C.
La comparación de las secuencias obtenidas se realizó mediante el uso de
BlastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), por medio del cual se confirmó el
clonamiento de dichos genes, dada su alta identidad en comparación con
secuencias de medaka, pez cebra y pollo. Para el alineamiento de secuencias se
utilizó
ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html,
http://align.genome.jp/). Para la traducción de las secuencias en los seis marcos de
lectura se utilizó BCM Search Laucher (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/sequtil/Options/sixframe.html) y para la búsqueda de dominios proteicos se utilizó
Prosite
(http://www.expasy.ch/prosite/).
Los
árboles
filogenéticos
radiales
(unrooted trees) se construyeron a partir de los resultados obtenidos con ClustalW.
Para el caso de gsc se utilizó como gen externo la secuencia aminoacídica de
Hox2.2 de D. rerio cuyo número de acceso del Genbank es CAA35171. Para la
construcción del árbol de bra, se utilizó como gen externo tbx24 de D. rerio, el cual
contiene un dominio de caja-T (T-box) y cuyo número de acceso en el Genbank es
BAB97298.
49
3.2.- Preparación de sondas
Con el fin de generar sondas antisentido, para el análisis mediante hibridación in
situ del patrón de expresión de los genes en estudio, los plamidios que resultaron
tener el fragmento génico de interés fueron amplificados y purificados mediante la
realización de Maxipreps (Plasmid Maxi Kit, Qiagen). Para esto se utilizaron células
quimiocompetentes (40µl) + 4µl de cada plasmidio diluído 1:100v/v. La mezcla se
colocó 30min. en hielo, 30seg. a 42˚C, luego 2min. en hielo y se le agregó 250ml de
medio LB incubándose por 1h a 37˚C con agitación. Posteriormente se cultivaron
100µl de cada cultivo en placas de agar conteniendo Xgal/IPTG toda la noche a
37˚C. Se seleccionó una colonia de cada cultivo, la que fue a su vez cultivada en
250ml de medio LB + 500µl de ampicilina (50mg/ml) toda la noche a 37˚C con
agitación. Luego se purificó el ADN plasmidial y se cuantificó en espectrofotómetro
por su absorbancia a 260nm. En todos los casos se linearizaron los plasmidios con
la enzima de restricción EcoRI y dependiendo de la orientación del inserto se usó la
ARN polimerasa (T7 o SP6) adecuada para sintetizar la sonda (ver Tabla 2). Se
digirieron entre 12µg y 18µg de plasmidio en cada caso. Los plasmidios linealizados
se purificaron usando el kit Quiaquick Gel Extraction (Quiagen) según indicaciones
del fabricante. Por lo tanto para la purificación se corrieron 1,5 - 2,25µg de los
plasmidios linealizados y se cortó la banda en cada caso desde un gel de agarosa
no desnaturante al 1,5%.
Para la transcripción de las sondas se siguieron las instrucciones de
manufactura de las ARN polimerasas respectivas. Se colocaron en un tubo libre de
ARNasas: 5µl de cada ADN lineal, 2µl 100mM DTT, 1,3µl mezcla de NTPs 2,5mM,
0,7µl Dig-UTP 10mM, 0,5µl RNasin, 2µl tampón de transcripción 10X, 7,5µl de agua
libre de ARNasas y 1µl de la RNA polimerasa correspondiente (T7 o SP6). Esta
mezcla se incubó durante 2h a 37˚C, luego se agregó 1µl de ADNasa I y se incubó
15min. a 37˚C. Posteriormente se purificó la sonda mediante el uso de Rneasy Mini
Kit (Quiagen) según indicaciones del fabricante. Las sondas fueron eluídas en 50µl
de agua libre de ARNasas. Para evaluar la calidad de las sondas sintetizadas, se
corrieron 2µl de cada muestra en un gel de agarosa al 1% durante 10 min., luego de
50
lo cuál se le agregó a cada sonda 150µl de tampón de hibridación para su
almacenaje a -20oC. Se realizó la transcripción de las ribosondas sentido, marcadas
con digoxigenina, (control negativo) y antisentido tanto para gsc como para bra. Para
el caso de bra además se sintetizó la ribosonda antisentido marcada con
fluoresceína .
Tabla 2 ARNs polimerasas utilizadas en la transcripción de las sondas de gsc y
bra.
Nombre sonda
ARN polimerasa
Hebra sentido
Hebra antisentido
gsc32 (C.charrua)
T7
SP6
gsc41 (C.bellottii)
T7
SP6
bra32 (C.charrua)
SP6
T7
bra44 (C.bellottii)
SP6
T7
3.3.- PCR en Tiempo Real
Se determinó la expresión del mRNA de gsc, bra y α-tub (como gen
constitutivo, control positivo) por medio de la técnica PCR en Tiempo Real. La
detección por fluorescencia mide la cantidad de ADN sintetizado en cada momento
de la reacción. La emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional
a la cantidad de ADN amplificado. Como sistema de detección de fluorescencia se
utilizó un agente intercalante de ADN de doble hebra, denominado SYBR Green I
Platinum SYBER Green qPCR SuperMix UDG (SYBR Green I, 60 U/ml Platinum Taq
DNA polymerase, 40 mM Tris-HCl pH 4.8, 100 mM KCl, 6 mM MgCl2, 400 μM dGTP,
400 μM dATP, 400 μM dCTP, 400 μM dUTP, 40 U/ml UDG) de Invitrogen.
Se diseñaron oligonuecleótidos específicos para cada gen, los cuales
amplifican productos no mayores a 150pb (requisito impuesto por la técnica). Dichos
oligonucleótidos fueron:
gsc esp.
F1 TTCTGATCTCGCCGGTCCCGC
R1 CGCGCGATTTTTGAACCAGAC
51
bra esp.
F1 CGCCATGTACTCGGTTCTGCTGGACTTCGT
R1 GGATGCGGGGCTCGTACTTGTGCAAC
α-tub esp.
F1 AGAGAGGCGGTTATGGAGGAGACAATCTGA
R1 GGTGGACAACGAGGCGATCTACGACATCTG
Cada reacción individual de PCR en tiempo real se realizó para un volumen
final de 25μl, conteniendo 15μl de Platinum SYBER Green qPCR SuperMix UDG, 1μl
de cada oligonucleótido específico (10μM), 8μl de agua y 1μl de muestra. El control
negativo consistió en sustituír la muestra por agua, por lo tanto en ese caso se
colocaron 9μl de agua.
Se realizaron varios ensayos a fin de encontrar las condiciones más
adecuadas para el programa de PCR. Las condiciones que se utilizaron finalmente
para los tres genes en paralelo fueron las siguientes: una primera etapa de
activación a 94ºC por 10 minutos, luego a 94ºC por 30 segundos (denaturación), el
alineamiento a 59ºC por 1 min., la elongación a 72ºC por 45 segundos y la
cuantificación fue a 83ºC por 7 segundos, esta primera etapa se realizó durante 45
ciclos. Luego se realizó la curva de disociación, donde se incubó a 74ºC por 7
segundos y posteriormente se realizó un gradiente de temperatura desde los 74ºC
hasta los 98ºC, con una lectura de la caída de la luminiscencia cada 0,5ºC. Se utilizó
un termociclador Stratagene Mx3000P. El análisis de los resultados del producto
amplificado se realizó a través del programa Stratagene Mx3000 Pro.
Mediante esta técnica se obtienen dos tipos de resultados. Por un lado
curvas de disociación y por otro curvas de amplificación para cada estadío y gen.
Las curvas de disociación grafican la disociación de los dímeros de producto
obtenido en función de la temperatura. Cuanto mayor es el tamaño del dímero mayor
es la tempreratura necesaria para disociarlo. Mediante esta información se pudo
saber por un lado cual era la temperatura de disociación del producto de interés en
cada caso. Por otro lado se corroboró que se obtuvo un solo producto mayoritario en
cada caso y a su vez éste era el mismo, en todos los estadíos analizados para cada
gen. Esto demuestra que el PCR funcionó como esperábamos amplificando un solo
producto específico mayoritario.
52
Los resultados de amplificación corresponden a los valores de fluorescencia
en función del número de ciclos para cada estadío. A partir de estos datos se
pueden obtener los valores Ct. El Ct corresponde al punto de intersección de la
curva de amplificación de cada producto, con la línea base de detección, que fija el
propio programa, detectando con ello el ciclo donde se inicia el aumento significativo
de la fluorescencia, siendo este inversamente proporcional a la cantidad de ADN
inicial de cada muestra. Debido a que no se contaba con una curva estándar, a partir
de la cual calcular el nivel exacto del templado en cada muestra, se realizó una
cuantificación relativa. Esto consistió en la comparación de los productos de
amplificación de gsc o bra en cada estadío analizado, en relación al control positivo,
α-tub (gen de expresión constitutiva), para ese mismo estadío. Por lo tanto se
compararon las diferencias entre los Ct. Además, y debido a que la amplificación
mediante PCR es exponencial, para el cálculo de la concentración relativa de cada
gen en cada punto, se utilizó la fórmula: 2
(Ct α-tub st1 -
Ct muestra st.1)
. Donde st1
representa un estadío en particular y “Ct α-tub st1” representa el valor Ct para α-tub
en ese estadío y “Ct muestra st1” el valor Ct del gen en estudio (gsc o bra) para el
mismo estadío. Mediante estos cálculos se obtuvo un valor relativo a α-tub para
cada gen en cada estadío, los cuales fueron graficados y comparados.
3.4.- Hibridación in situ
Se estudió la expresión de gsc y bra mediante hibridación in situ simple (una
sonda) y doble (dos sondas) utilizando el protocolo modificado de Gamse et al..
2002 (ver apéndice). Básicamente las hibridaciones con las sondas se hicieron a
70˚C toda la noche y el revelado se realizó con BM-Purple (Roche) durante
aproximadamente 14 hs para el caso de gsc y 6hs para bra. En el caso de las
hibridaciones dobles la segunda sonda se reveló con INT/BCIP (Roche), hasta
obtener la intensidad de la marca deseada. Para el caso de bra esto ocurrió a las
8hs.
Posteriormente los embriones fueron lavados 4 veces por 5 min. cada una, en
PBS e incubados en DAPI (4µg/ml) por 2 hs. Luego fueron lavados 6 veces en PBT
(PBS 1x + Tween 0,1%) por 5min cada uno. Se cortó parte del vitelo, en la región
53
contraria al embrión, utilizando pinzas, se montó y orientó cada embrión en una gota
de metilcelulosa al 1%. Las imágenes se tomaron en un microscopio DIC, Nikon
Eclipse 80i con objetivos de 10-40x, mediante una cámara digital color Nikon E4500.
A su vez se realizaron cortes en vibrátomo de embriones hibridados, tanto
para bra como para gsc. Para esto se realizaron dos lavados en PBS y luego se
estabilizaron durante 10min. en solución de embebido (gelatina/BSA/sacarosa).
Luego en placa Petri (de 40mm de diámetro) se agregó 4ml de solución de
embebido y 200µl de glutaraldehído al 25%, se mezcló sin generar burbujas y se
colocaron los embriones equidistantes. Luego de que la solución solidificara
(aproximadamente 1 min.) se recortaron bloques conteniendo un embrión por
bloque. Luego se pegó (con un pegamento instantáneo) un bloque orientado a la
platina del vibrátomo y se realizaron cortes de 20µm de espesor. Dichos cortes se
recogieron con pincel del agua destilada, se colocaron en portaobjetos y se
montaron en 100µl de Moviol (Sigma). Para preparaciones permanentes se selló el
borde con Entellan (Merck).
4.- Análisis de destino celular durante la agregación
Fotoconversión de Kaede
Con el propósito de analizar el destino temprano y tardío de las células que
forman el agregado celular, se utilizó el método de fotoconversión de Kaede. Se
realizaron inyecciones de ARNm de una proteína fluorescente del coral (Kaede) en
el embrión de una célula. Esta proteína contiene el tripéptido His-Tyr-Gly, el cual
actúa como cromóforo verde que puede ser fotoconvertido a rojo con luz UV. La luz
UV cliva la proteína de Kaede y permite la formación de nuevos enlaces dobles,
creando un nuevo cromóforo que emite en rojo (Ando et al., 2002). Se ha visto que
esta molécula es estable, permaneciendo inalterada en embriones de A. bellottii de 4
a 9 días post-fecundación. Luego de la inyección, los embriones fueron mantenidos
en la oscuridad, a fin de evitar su fotoactivación espontánea. El análisis de los
embriones inyectados se realizó fotoactivando con luz UV en un microscopio
54
compuesto, después de cerrar el diafragma móvil de campo fluorescente o por
medio de un diafragma pequeño o “pinhole". La fotoactivación se realizó según el
siguiente esquema:
1- Agregación temprana: a- fotoconvirtiendo un grupo, entre 30% y 50%, del
conjunto de células que confluyen al agregado celular temprano, tanto en RI
como en el AII, b- fotoconversión de la totalidad de las células que forman lo
dos primeros estadios (agregados I y II), (n total= 22)
2- Agregación intermedia: a- fotoconversión de la totalidad de las células del
agregadotres inicial (AIIIi, n=5), b- fotoconversión de células centrales de
agregadotres medio así como de la totalidad de las células de éste
agregado(n total=8), c- zona central de agregadotres tardío (n=5).
3- Agregación tardía: fotoconversión en zona central de agregado cuatro (n=3) y
agregado cinco (n=3).
Posteriormente se realizó un seguimiento en el tiempo de las células
marcadas verdes (no fotoconvertidas) y marcadas rojas (fotoconvertidas) en cada
embrión, a fin de analizar su destino. Esto se realizó mediante Microscopía de
Fluorescencia (microscopio Nikon optishot 3490) y se tomaron imágenes
aproximadamente cada 20hs con una cámara CCD enfriada Hamamatsu Orca.
55
Resultados
Los resultados se han subdividido en tres secciones. En la primera se definen
los estadíos de agregación y se describen sus características morfológicas basado
en microscopía DIC (Differential Interference Contrast), microscopía confocal y
mediante cortes histológicos semifinos (Objetivos específicos 1 y 2). En la segunda
sección se muestran los patrones de expresión de genes marcadores del blastoporo
(brachyury) y organizador (goosecoid), tanto a nivel temporal como espacial
(Objetivo específico 2). Finalmente en la tercera se realiza un análisis dinámico de
los procesos celulares que acontecen durante la agregación celular y la formación
de múltiples capas celulares de la gástrula. Se presenta un estudio de destino
celular temprano del agregado y se analizan las características morfológicas
mediante microscopía confocal 3D de tiempo extendido (Objetivos específicos 3 y 4).
1. Análisis morfológico del proceso de agregación celular en
Austrolebias
1.1.- Descripción y definición de estadíos de agregación celular
Al culminar el proceso de epibolia (100%) el embrión de Austrolebias consta
de tres tipos celulares: un epitelio superficial que cubre el embrión, denominado
capa celular envolvente (Enveloping Layer, EVL), una capa sincicial vitelina (Yolk
Sincitial Layer, YSL) que corresponde a un sincicio de núcleos inmersos en una
única célula vitelina y las blastómeras profundas (BP), que formarán al embrión,
ubicadas entre la EVL e YSL (Carter & Wourms, 1991). En el estadío de 100% de
epibolia las blastómeras profundas están distribuidas por toda la superficie del huevo
(Carter & Wourms, 1991). Es a partir de este estadío que comienza el proceso de
agregación celular que se estudiará en la presente tesis.
56
Ensayos
preliminares
indicaban
que
la
agregación
celular
ocurriría
preferentemente en el polo vegetal del embrión. Debido a que luego del proceso de
epibolia se pierde completamente el marco de referencia en relación al eje animalvegetal, ya que las células se aprecian homogéneamente distribuídas en el huevo,
se hizo imprescindible establecer algún punto de referencia, a fin de poder analizar
donde ocurre la agregación celular. Para esto se inyectaron embriones con ARNm
de Kaede (ver Metodología y estudio de destino celular en Resultados) y se
fotoconvirtieron en el estadío de 90% de epibolia las células de la EVL (y algunas
BP) que se encontraban en el polo animal. En otros embriones se impregnó de
cristales de DiI la punta de un filamento de tungsteno, mediante el cual se penetró el
corion hasta llegar a la membrana vitelina en el polo vegetal. Esto generó una
marca, tanto del corion como de la membrana vitelina en esta región. Mediante
ambas aproximaciones se pudo apreciar que el agregado celular en todos los casos
se formó en el polo vegetal del embrión (n=15 embriones).
Estudios previos sugieren que el proceso de agregación celular involucra la
migración de células hacia un punto del embrión, donde se agrupan y
posteriormente, a medida que aumenta el número de células, se organizan para
formar el eje embrionario (Wourms, 1972a). Esta descripción inicial del desarrollo de
Austrolebias fue realizada por Wourms (Wourms, 1972a), quien denominó a este
proceso como reagregación. Esta denominación surge de considerar que las células
embrionarias en el período de blástula están agregadas en el polo animal, se
dispersan durante la epibolia y después se “reagregan” a fin de formar el eje
embrionario. Además Wourms definió para el proceso cinco estadíos, desde
reagregado I a reagregado V (Wourms, 1972a). Dicha descripción se basó en las
características morfológicas, evidenciadas a partir de un estudio con microscopía de
campo claro (Wourms, 1972a). En esta tesis denominaremos agregación celular, al
proceso definido por Wourms como reagregación. Por lo tanto los estadíos de
agregación se nombrarán como agregados (A).
Al inicio del proceso de agregación se forma una monocapa de aproximadamente
50 células agrupadas en una zona del embrión. A medida que el tiempo transcurre
se forma un embrión discoidal, de más de una capa de células. Posteriormente y
57
mientras el agregado celular aumenta de tamaño y cambia de forma, de circular a
elíptico, las células de la zona central disminuyen mucho su tamaño y se reorganizan
de tal modo que cuando este proceso culmina se puede apreciar la formación de
una estructura axial central, probablemente la notocorda. En este trabajo se estudió
el proceso de agregación en dos especies de Austrolebias: A. bellottii y A. charrua.
Se observó que A. charrua presenta un desarrollo más lento que A. bellottii. El
proceso de agregación dura en total 6 días de desarrollo en A. charrua mientras que
en A. bellottii éste ocurre en 5 días, sin embargo no se apreciaron diferencias
significativas en las características del proceso entre las especies. Por lo tanto se
utilizó indistintamente una u otra especie para la descripción del proceso de
agregación. Sin embargo cuando se haga referencia a tiempos de desarrollo, éstos
corresponderán a los tiempos descritos para A. bellottii (ver Tabla 3).
El proceso de epibolia culmina a los 4,4 días postfecundación (dpf) en A.
bellottii o 7 dpf en A. charrua a 25˚C. (S. De La Piedra, com. pers.). Posteriormente
comienza el período de agregación, al inicio del cual lo primero que se observa es
un incremento paulatino en el número de células en una zona del embrión. Esta
acumulación de células ocurre, aparentemente, por migración de éstas hacia la zona
de agregación .
Los estadíos del proceso de agregación, fueron esencialmente definidos
mediante microscopia DIC y complementados con microscopía confocal de
embriones que expresaban GFP con destinación a membrana y RFP con
destinación nuclear.
1.1.a. - Estadíos de agregación celular
Agregado uno (AI)
Este estadío consiste en una monocapa de aproximadamente 10 células que
aumentan en número a medida que el tiempo transcurre. Se define como AI un
embrión cuyo agregado consta de un número de células entre 10 y 30, con un eje
mayor de 80μm±17μm, (n=30) (AI en Fig. 6A y 6B). Estas células son bipolares y
forman lamelipodios y filopodios. Este estadío dura en promedio 20 horas a 25˚C.
58
Agregado dos (AII)
A medida que el desarrollo transcurre, existe un incremento en el número de
células en la zona del agregado. Se define al AII como una monocapa de células
donde los espacios entre las células han disminuido (respecto al AI). El agregado en
este estadío tiene una forma variable, circular o alargada y consta de un número
promedio de 80 células ± 25, (n=5). La gran mayoría (95%, n=5) de las células que
lo componen tienen un diámetro de 25,5μm ± 4μm, (n=40). Estas células tienen
forma redondeada y en general no se aprecian proyecciones de membrana
destacables (AII en Fig. 6A y 6B). Se distingue además un pequeño grupo de células
de tamaño mayor (5%, n=5), cuyo eje mayor mide en promedio 80μm±25μm, (n=10).
Estas células se mantienen en la periferia del agregado y presentan forma
trapezoidal. Este estadío dura en promedio 10 horas a 25˚C.
59
AIIIt
AI
*
AII
AIV
AIIIi
AV
ejei
AIIIm
vK
*
3 som.
Figura 6A.- Estadíos del proceso de agregación celular, formación del
eje embrionario y somitogénesis temprana.
60
AI
AIV
AII
AV
AIIIi
ejei
*
AIIIm
3 som.
vK
Figura 6B.- Esquemas que
representan los estadíos del
proceso de agregación celular,
formación del eje embrionario y
somitogénesis temprana.
AIIIt
61
Agregado tres (AIII)
El período de agregación tres dura 65hs en total. Debido a su extensión y a
que en esté período ocurren cambios morfológicos importantes en el agregado, se
subdividió en tres estadíos: agregado tres inicial (AIIIi), medio (AIIIm) y tardío (AIIIt).
Figura 6.- Estadíos del proceso de agregación celular, formación del eje embrionario y
somitogénesis temprana
A. AI (estadío agregado I), grupo de unas 10 células de morfología migratoria. La flecha indica
una célula alargada de tipo bipolar. AII (estadío agregado II), formado por una monocapa de
unas 100 células, la mayoría redondeadas (asterisco indica una de ellas) y de tamaño similar
(aprox. 20μm de diámetro). Las flechas indican dos células mayores que se ubican en la
periferia. La línea punteada indica el borde aproximado del agregado. AIIIi (estadío agregado III
inicial), se aprecia la superposición de células en diferentes regiones del agregado (la cabeza de
flecha indica células superpuestas). La línea punteada indica el borde aproximado del agregado.
AIIIm (estadío agregado III medio), se aprecia una zona central de células de menor tamaño, las
que se disponen a diferentes niveles en el eje z (zona indicada con línea punteada). En la
periferia se observa una corona de células redondeadas de mayor tamaño (flecha). AIIIt (estadío
agregado III tardío), la zona central de células de menor tamaño ha aumentado en área (zona
indicada con línea punteada). La corona de células externas se aprecia más compacta (flecha).
AIV (estadío agregado IV), se aprecia un área central formada por células de menor tamaño
(delimitada por línea punteada) y células periféricas redondeadas de mayor tamaño (flecha). AV
(estadío agregado V), de forma elíptica, se observa una acumulación de las células externas de
mayor tamaño en el extremo posterior (flecha). La zona central del agregado está delimitada por
una línea punteada. ejei (estadío eje inicial), de forma elíptica (borde indicado con línea
punteada), presenta dos pliegues paralelos en el primer tercio posterior, que corresponden a la
notocorda (señalada con cabezas de flecha). 3 som. (estadío 3 somitos), se aprecia la región
cefálica ensanchada, 3 somitos (asterisco) en la zona medial-posterior del eje y el organizador
de la cola, en el extremo posterior (flecha). Además se aprecia una estructura elíptica posterior,
posiblemente la vesícula de Kuppfer (vK). B. Se ilustran, mediante esquemas, las principales
características de los estadíos correspondientes al proceso de agregación celular, eje inicial y
somitogénesis temprana. Cada círculo/óvalo representa una célula. La zona central de los
agregados con alta densidad celular es representada con una trama cuadriculada. Las línea roja
en ejei, indica los bordes del eje embrionario en formación. En 3 som. vK: vesícula de Kupffer,
asterisco en somito, flecha indica el organizador de la cola.
62
Agregado tres inicial (AIIIi)
En este estadío existe un aumento moderado del número de células, en
relación al AII. En promedio presenta alrededor de 100 células y se pueden
reconocer las mismas dos poblaciones celulares descritas en el AII. La principal
diferencia con éste último es que el embrión deja de ser una monocapa y se
observan algunas células ocupando lugares más profundos dentro del agregado
(AIIIi en Fig. 6A y 6B). Se pueden reconocer células de morfología variada. En la
zona central del agregado predominan las células redondeadas y células de
morfología alargada de tipo filiforme se concentran en la periferia. Este estadío en
promedio dura 15 horas.
Agregado tres medio (AIIIm)
En éste estadío ha aumentado el número de células del agregado al doble del
AIIIi (aproximadamente 200 células), así como su superposición en el eje z. El eje
mayor del agregado mide aproximadamente 400μm y la zona central 150μm.
Se pueden reconocer tres poblaciones celulares de distinto tamaño:
1- las de mayor tamaño (descritas previamente) representan el 2,5% de la
población, de forma trapezoidal y de tamaño promedio de 80±25μm.
2- grupo de células de un tamaño intermedio representa el 85% del total de
células del agregado. Está formado por células redondeadas de 30±4μm
(n=20), muchas de las cuales se observan superpuestas hacia la periferia.
3- grupo de células más pequeñas, con un eje mayor de 14,6±1μm (n=15),
corresponden a células redondeadas, que se ubican en la zona central del
agregado, lugar donde se aprecia mayor superposición de células en el eje z
(AIIIm en Fig. 6A y 6B).
Este período es el más largo del proceso de AIII y dura 35 horas.
En la Fig. 7 se muestra una secuencia de microscopía confocal de los
cambios que ocurren en este estadío, se puede observar como las células más
pequeñas (grupo 3) se organizan en la zona central del agregado (Fig. 7A y B) y
forman una estructura circular central (Fig. 7C) claramente separada de la zona de
células periféricas de mayor tamaño (grupo 2).
63
A
B
AIIIm inicial
AIIIm medio
C
D
AIIIm tardío
AIIIt
E
F
AIV
AV
Figura 7.- Análisis por microscopía confocal del proceso de agregación tardío
64
Agregado tres tardío (AIIIt)
Este estadío se caracteriza porque las células de menor tamaño (grupo 3,
definido para el AIIIm) están concentradas en la zona central, formando una
estructura circular compacta fácilmente reconocible. El embrión en este estadío tiene
forma circular y mide en promedio 300μm de diámetro (n=4). La zona central
circular, ocupada por estas células de menor tamaño, abarca el 18% del área total
del agregado. El eje mayor de dichas células de menor tamaño mide 13±1μm (n=13)
(AIIIt en Fig. 6A y 6B). Las células de tamaño intermedio (grupo 2) están agrupadas
en la periferia formando una estructura similar a una corona, de aproximadamente 4
filas concéntricas de células, en torno a la estructura central. Con microscopía
confocal se pudo apreciar que en este estadío existe una mayor compactación de
células en la zona central del embrión y el área central se alarga midiendo 200μm en
su eje mayor y 150μm en su eje menor (Fig. 7D). Este estadío dura 15 horas a 25˚C.
Figura 7.- Análisis por microscopía confocal del proceso de agregación tardío
A. AIIIm temprano, se aprecian células de tamaños similares formando un agregado celular
circular, donde ya existe más de una capa de células. B. AIIIm intermedio, las células centrales
disminuyen de tamaño y se reorganizan en la zona central (flecha), a su vez las células de mayor
tamaño se desplazan hacia la periferia. C. AIIIm tardío, las células centrales han disminuído
considerablemente de tamaño y se agrupan en la zona central (indicada con línea punteada). D.
AIIIt, donde la zona central de células más pequeñas ocupa un área mayor del agregado. Se
aprecia claramente la corona de células de mayor tamaño que la rodea (flecha). E. AIV, aumenta
el área circular ocupada por células pequeñas (indicada con línea punteada) y las células de
mayor tamaño se desplazan hacia la futura región posterior del embrión (indicada por una flecha).
F. AV, el cual se extiende y cambia de forma de circular a elíptico, al igual que la zona ocupada
por células pequeñas (línea punteada). La mayoría de las células de mayor tamaño están
concentradas en la región caudal presuntiva del embrión (flecha). El grupo de imágenes tomadas
en cada tiempo fue procesado con el programa Volocity, el cual permite generar un modelo 3D del
grupo de imágenes aduiridos en z para cada estadío. El modelo 3D fue luego rotado de tal forma
que las imágenes que se muestran corresponden a una vista desde el vitelo del agregado. Desde
esta perspectiva, las células superficiales (como las de la EVL) no se aprecian.
65
Agregado cuatro (AIV)
Las dos características principales que definen éste estadío son: (a) una
disminución general del tamaño de las células que conforman el agregado: células
del grupo 2 (intermedias) y 3 (pequeñas) descritas previamente en AIIIm; y (b) un
aumento del área ocupada por la zona circular central de células más pequeñas, en
relación al área total del agregado. En este estadio el agregado tiene una forma
circular con un diámetro aproximado de 450μm y las células que forman la corona
concéntrica a la zona central tiene un diámetro promedio de 18±2μm, (n=20) y
comienzan a concentrarse en un extremo del embrión. Los bordes de las células
menores centrales no son apreciables con microscopía DIC (AIV en Fig. 6A y 6B) y
con microscopía confocal se determinó que miden en promedio 9,8±2μm (n=18). El
área que ocupa la zona central en este estadío, es en promedio de un 55% del área
total del agregado (Fig. 7E). Este estadío dura 15 horas a 25˚C.
Agregado cinco (AV)
La característica más sobresaliente que define éste estadío es el cambio de
forma del agregado. Mientras la forma del AIV es aproximadamente circular, el AV
pasa a tener una forma elíptica (AV en Fig. 6A y 6B). El eje mayor del embrión mide
aproximadamente 460μm y el eje menor 300μm. Las células externas (grupo 2) que
rodean la zona central miden en promedio 12±2μm (n=20) (Fig. 7F). Otra
particularidad de éste estadío es que la mayoría de las células externas, se
concentran en un extremo del agregado Este estadío dura 22 horas a 25˚C.
El AV representa el último estadío del proceso de agregación, luego de lo cual
se puede apreciar la formación del eje embrionario. El estadío de eje fue subdividido
en tres: eje inicial (ejei), eje medio (ejem) y eje tardío (ejet).
66
1.1.b.- Estadíos de eje embrionario y somitogénesis inicial
Eje inicial (ejei)
Treinta minutos después de que el AV está formado, se observa la aparición
de una estructura axial. Esta estructura aparece inicialmente como dos pliegues
paralelos en la zona central del agregado, separados a una distancia aproximada de
20μm (cabezas de flecha en ejei de Fig. 6A). El embrión en éste estadío es una
elipse con un largo promedio de 500μm y un ancho de 250μm, (n=3) (ejei en Fig. 6A
y 6B). Este estadío dura 5 horas.
Eje medio (ejem)
La característica principal por la cual se definió este estadío es por el aumento
longitudinal en el tamaño de ésta estructura axial, posiblemente la notocorda, que se
hace evidente en la zona central, la cual se alarga hacia los extremos del embrión y
mide aproximadamente 160μm, de un extremo al otro. A su vez se observa el
ensanchamiento de ésta estructura en la zona anterior y posterior. Este estadío dura
aproximadamente 11 horas.
Eje tardío (ejet)
En este estadío la característica principal es que los extremos de la estructura
axial se hacen evidentes, por lo tanto se puede apreciar un eje completo, donde se
distingue claramente la zona cefálica (65μm de ancho) de la caudal (40μm). En
todos los estadíos de eje se aprecian las células de mayor tamaño en la periferia y
concentradas en la zona caudal. Este estadío dura aproximadamente 7 horas a
25˚C.
Embrión de 3 somitos (3som)
A medida que el desarrollo avanza, se segmenta el mesodermo paraxial y se
pueden distinguir los somitos a los costados del eje. Los primeros somitos que se
forman se ubican en el primer tercio posterior del embrión. En éste estadío el eje
67
embrionario mide 400μm de largo. Se distingue una estructura elíptica posterior,
posiblemente la vesícula de Kupffer (vK, en 3 som. de Fig. 6A y 6B).
68
Tabla 3. Estadíos, tiempos y características del proceso de agregación
Estadíos
100%
Días postfecundación (dpf)
Características:
en A. charrua
generales agregado, poblaciones celulares, tamaños
6
Blastómeras profundas dispersas sobre vitelo, forma
variada: filiforme, triangular, bipolar.
epibolia
Grupo laxo de 20 células, migrando hacia un punto, forma
AI
6,8
alargada tipo bipolar, con filopodios y lamelipodios,
80±17μm.
Monocapa de 80 células±25, agregado de forma variada,
AII
7,25
95% células redondeadas de 25,5±4μm, 2,5% de células
alargadas de eje mayor de 80±25μm.
AIIIi
7,9
Agregado celular de alrededor de 100 células, de formas y
tamaños similares a las del AII. Primeras células que se
profundizan en eje z en diversas zonas del R.
Más de una capa células en zona central, aproximadamente
200 células, 3 grupos poblacionales: 1- representan el 2,5%
AIIIm
9,1
miden 80±25μm, multinucleadas, 2- 85% de la población
miden 30±4μm, 3- 12,5% de la población, miden 14,6±1μm
y se ubican en zona central.
Forma circular de 300μm de diámetro y multilaminar en
AIIIt
10
zona central, aumento y compactación células centrales
(grupo 3) que miden 13±1μm, corona de células de grupo 2,
área central ocupa 18% del R.
Forma
AIV
10,6
relativamente
circular
450μm
de
diámetro,
disminución general tamaño células, periféricas 18μm±2μm
(grupo 2) comienza su migración a un extremo, centrales
9,8μm±2μm (grupo 3), área central ocupa 55% del R.
AV
11,5
Forma elíptica de eje mayor 460μm y eje menor 300μm,
células
periféricas
de
12μm±2μm
concentradas
en
posterior.
ejei
11,7
Aparición
estructura
axial
central,
pliegues
paralelos
separados 20μm, posiblemente inicio de notocorda.
ejem
12,2
Crecieminto de estructura axial hacia extremos midiendo
aproximadamente 160μm entre sus extremos.
ejet
12,5
Se aprecia eje completo, con zona celálica y caudal
ensanchadas.
69
1.2.- Estudio morfológico a través de cortes histológicos
Mediante cortes histológicos semifinos seriados se analizó la morfología
histológica de distintos estadíos de agregación, desde AIIIm hasta el estadío de 3
somitos (Fig. 8). De cada secuencia de cortes se seleccionó el/los cortes más
informativos.
En el estadio de AIIIm se realizaron cortes transversales del agregado y se
seleccionó un corte de la zona central (Fig. 8A). En el corte, el agregado presenta
una forma lenticular, teniendo más de una capa de células en la zona central, las
cuales se van reduciendo hacia la periferia, hasta llegar a formar una monocapa. En
la zona central no se aprecia ninguna organización particular de las células. En un
extremo del corte (hacia la derecha en Fig. 8A) se distingue una estructura
homogénea, que se tiñe rosada con azul de toloudina, la cual ocupa el espacio entre
el agregado y el vitelo. Dicha estructura podría corresponder a matríz extracelular.
En la zona central más ancha el embrión mide 47μm de ancho.
El agregado en AIV tiene también una forma lenticular, aunque la periferia no
es una monocapa, sino que se observan al menos tres capas de células. Se aprecia
como ha aumentado la compactación entre células, debido a que la distancia entre
sus núcleos ha dismunuído. En la zona central se observa que las células se
organizan formando una estructura circular (indicada por puntas de flecha en la Fig.
8B) la cual parece afinarse, a medida que se aproxima a la superficie (EVL). Esta
estructura mide aproximadamente 70μm en su diámetro mayor. A su vez el
agregado mide en su zona central aproximadamente 60μm de ancho.
En la figura 8C se muestra un corte a través del eje mayor de un AV. En la
zona central de éste los nucleos de las células parecen disponerse en círculos
concéntricos dando al conjunto el aspecto de una estructura circular (cabezas de
flecha en Fig. 8C). En la zona central el agregado mide aproximadamente 70μm.
El embrión en eje tardío presenta estructuras claramente diferenciadas. En la
figura 8 se muestran dos cortes histológicos, uno en la zona anterior del embrión
(Fig. 8D) y el otro en la región posterior (Fig. 8E). En la región anterior se aprecia la
quilla neural (asterisco en Fig. 8D) y bajo ella la notocorda (indicada con una flecha
70
en Fig. 8D). A los costados de la quilla neural se puede apreciar el mesodermo
paraxial, aún no segmentado. En el corte a nivel posterior (Fig. 8E) se aprecia
claramente una estructura circular central, la cual podría corresponder al organizador
de la cola o “tailbud”, descrito en otros teleósteos (ver discusión y cabezas de flecha
en 8E).
En las figura 8 se muestran además cortes a tres niveles de un embrión en el
estadío de 3 somitos. Estos cortes se realizaron en la región cefálica (Fig. 8F), en la
zona medial (Fig. 8G) y en la región caudal (Fig. 8H). En la zona cefálica se aprecia
la quilla neural de forma triangular en el centro de la cual se aprecia un espacio que
probablemente corresponda al inicio de la formación del lumen (indicado por una
cabeza de flecha en 8F). El corte medial se realizó a nivel del segundo somito. Se
puede apreciar la notocorda como un grupo pequeño de células (indicada por flecha)
debajo de la quilla neural y a los costados el mesodermo paraxial segmentado,
formando los somitos (asterisco en Fig. 8G). El corte caudal muestra un
engrosamiento importante de esa zona, con un aumento en el número de capas de
células. Se distingue una estructura circular que abarca la casi totalidad del ancho
del embrión, que es de aproximadamente 90μm. La estructura circular identificada a
éste nivel mide 80μm de diámetro (borde indicado con una línea discontinua en Fig.
8H).
71
Nivel de los cortes
A
A
AIIIm
B
B
AIV
C
C
AV
D
ejet
F
3 som.
D
E
*
H
G
F
E
H
*
Figura 8.- Estudio histológico del proceso de agregación celular y formación del eje
embrionario
A la izquierda se muestran imágenes de cortes histológicos transversales teñidos con azul
de toluidina de agregados celulares, embriones en estadío de eje y somitogénesis temprana.
A la derecha representación esquemática de cada estadío así como de la orientación de los
cortes en cada caso (indicado con línea discontinua roja). A. Corte transversal de AIIIm. Se
aprecia un agregado de forma lenticular, con células centrales a diferentes niveles en el eje
z y una sola capa de células periféricas. A la derecha del corte se aprecia una estructura
que se tiñe homogéneamente de rosado con azul de toluidina, la que podría corresponder a
matriz extracelular (flecha). B. Corte transversal de AIV. Se observa alrededor de dos capas
de células periféricas y cinco centrales. Se distingue estructura circular central, la cual se
afina hacia la superficie, indicada con línea punteada y cabezas de flecha. C. Corte
longitudinal de AV. Se observa un aumento en el número de capas celulares centrales y una
disminución en el tamaño de las células. D. Corte transversal anterior de un embrión en eje
tardío (nivel del corte indicado en esquema adyacente). Se aprecia la quilla neural
(asterisco) y por debajo la notocorda (flecha). A los costados se observa el mesodermo
paraxial. E. Corte transversal de región posterior de embrión en eje tardío (nivel del corte
indicado en esquema adyacente). Se indica estructura circular compacta (cabezas de
flecha) al centro del reagregado, posiblemente el organizador de la cola. F. Corte transversal
anterior de embrión de 3 somitos. Se observa la quilla neural triangular con lumen al centro
(flecha). G. Corte transversal medio de embrión de 3 somitos. Con asterisco se indica un
somito y con la flecha la notocorda. H. Corte transversal posterior de embrión de 3 somitos.
Se aprecia estructura circular que abarca casi72
todo el ancho del embrión, posiblemente el
organizador de la cola.
2. Uso de marcadores genéticos en el estudio del proceso de
agregación
Mediante el análisis de la expresión de marcadores genéticos de la
gastrulación se buscó entender en que momento y en que forma ocurrían procesos
tales como: diferenciación de las células mesodérmicas, formación del blastoporo,
establecimiento del organizador o la inducción del neuroectodermo. Por lo tanto, se
buscó establecer cuando y donde ocurren algunos de los procesos morfogenéticos
de la gastrulación en Austrolebias. Con éste fin se realizó el clonamiento de
fragmentos génicos codificantes de éste género, los que fueron posteriormente
analizados a nivel temporal mediante PCR en tiempo real y a nivel espacio-temporal
mediante hibridación in situ. Para la selección de los genes a estudiar se utilizaron
varios criterios. Debido a que el clonamiento se realizó mediante la generación de
oligonucleótidos degenerados, los genes de interés debían ser conservados en la
evolución, a fin de tener más posibilidades de éxito. En segundo lugar debian ser
genes cuyas funciones fueran conocidas durante la gastrulación de otros
organismos. En particular el interés se centró en localizar el blastoporo y el
organizador en Austrolebias, por lo que se clonaron los genes ortólogos de
brachyury y goosecoid, respectivamente. Además se intentó el clonamiento de
algunos marcadores de tejidos que se forman más tardíamente, como es el caso del
neuroectodermo, a fin de poder realizar, a futuro, un estudio más completo del
desarrollo de Austrolebias.
2.1.- Clonamiento de fragmentos génicos de Austrolebias
Mediante la técnica de RT-PCR y utilizando oligonucleótidos degenerados se
clonaron 12 fragmentos génicos a partir del ADNc preparado de varios estadíos
embrionarios de Austrolebias (ver Metodología). Para esto, se compararon las
secuencias codificantes de diversos genes de otros vertebrados (peces, aves y
73
mamíferos) a través de su alineamiento con ClustalW y se diseñaron oligoncleótidos
degenerados correspondientes a las regiones aminoacídicas más conservadas. Se
diseñaron los partidores tal que los productos a amplificar fueran mayores a 400pb, a
fin de poder generar posteriormente sondas específicas y así analizar su patrón de
expresión. Los fragmentos génicos clonados y su tamaño son los siguientes:
goosecoid (gsc, 600pb), brachyury (bra, 480pb), wnt 11 (420pb), wnt8b (420pb),
pax6 (840pb), opl1 (620pb), otx2 (551pb), sonic hedgehog (shh, 512pb), bmp4
(713pb), sox2 (593pb), β-actina (550pb), α-tubulina (α-tub, 403pb). Las secuencias
obtenidas fueron comparadas con las bases de datos mediante el programa BLAST
(Altschul et al.., 2005) y se corroboró en cada caso que se trata de un posible
ortólogo del gen en cuestión.
A los efectos de contestar las preguntas planteadas en el presente trabajo, los
genes que resultaron más informativos de estudiar en una primera etapa, fueron dos:
goosecoid (marcador del organizador y placa precordal) y brachyury (marcador del
blastoporo, mesodermo axial y “tailbud”). Por lo tanto centramos nuestro análisis en
dichos genes.
2.2.- Análisis de secuencias de goosecoid y brachyury
Para el clonamiento de estos genes primero se realizó una búsqueda en
GenBank, donde se tuvo acceso a secuencias codificantes conocidas de otros
vertebrados, tanto para gsc como para bra. Posteriormente estas secuencias fueron
alineadas
usando
ClustalW
y
comparadas
mediante
el
uso
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Las secuencias comparadas para el caso de gsc fueron:
Especie
Número Acceso GeneBank
Xenopus tropicalis
scaffold_185:1840522:1843227:1
Gallus gallus
X70471
Danio rerio
NM131017
Takifugu rubripes
scaffold_266:1:381343:1
Orizias latipes
TC39765
74
de
Blast
Mus musculus
NM010351
Para el caso de bra se compararon secuencias de:
Gallus gallus
NM204940
Orizias latipes
AB001871
Danio rerio
NM131162
Mus musculus
NM009309
Xenopus tropicalis
BC067315
Dado que estos genes son muy conservados en la evolución fue posible
seleccionar en ambos casos las regiones de mayor identidad aminoacídica, a partir
de las cuales se diseñaron los pares de oligonucleótidos degenerados, como ya se
mencionó anteriormente, para el clonamiento de fragmentos génicos que superaran
los 400pb. Luego del diseño de los oligonucleótidos se utilizó el programa Oligo 6.8
para corroborar la calidad de éstos, respecto a la posible formación de bucles,
dímeros, etc. Mediante RT-PCR se amplificaron los fragmentos de ambos genes a
partir de ARN preparado tanto de A. bellottii como de A. charrua, los que luego se
clonaron y secuenciaron (Fig. 9 y 10). Se confirmó el clonamiento de dichos genes
mediante la comparación de secuencias con BlastN. A continuación se indican los
porcentajes de indentidad encontrados en cada caso (Tabla 4).
75
Tabla 4. Porcentajes de identidad de gsc (A) y bra (B) en comparación con
otros vertebrados y entre si.
A- % identidad
Mm gsc
Xl gsc
Dr gsc
Gg gsc
Hs gsc
Ab gsc
64
69
76
67
65
Ac gsc
62
65
71
65
62
85
B- % identidad
Mm bra
Xl bra
Dr bra
Gg bra
Ol bra
Ab gsc
Ab bra
94
93
91
93
89
Ac bra
96
94
92
95
91
Ab gsc
97
Mm: Mus musculus, Xl: Xenopus laevis, Dr: Danio rerio, Gg: Gallus gallus, Hs: Homo
sapiens, Ab: Austrolebias bellottii, Ac: Austrolebias charrua, Ol: Orizias latipes.
La comparación de las secuencias de Austrolebias con las correspondientes
secuencias ortólogas de otros organismos, permitió identificar por un lado los
dominios encontrados en las secuencias clonadas y por otro generar árboles
filogenéticos, los cuales permiten agrupar a los distintos genes según su similitud de
secuencias (Figs. 11 y 12).
Para el caso de gsc la secuencia clonada contiene parte (57 aminoácidos) del
homeodominio 2, conocido en otros organismos. A partir de esta comparación de las
secuencias aminoacídicas de los fragmentos de gsc de Austrolebias con las de otros
organismos, se construyó un árbol filogenético radial (unrooted tree), en el cual se
puede apreciar como las especies de Austrolebias son agrupadas con las de los
demás peces analizados: T. rubripes y D. rerio. Por otro lado en un grupo aparte
quedaron los demás organismos comparados: X. tropicalis, G. gallus y M. musculus
(Fig. 11).
La secuencia de bra de C. charrua contiene el dominio de caja-T (T-box) 3,
formado por 169 aa. Mediante el árbol filogenético radial construído para bra se
pudo observar la misma agrupación de los peces por un lado y los demás
organismos por otro, visto para el caso de gsc. En este caso se compararon las
76
secuencias de los peces O. latipes y D. rerio, así como las de X. tropicalis, G. gallus
y M. musculus (Fig. 12).
Dadas las altas identidades de secuencia encontradas entre los genes
amplificados de Austrolebias con los genes gsc y bra de otros vertebrados,
consideramos que las secuencias identificadas corresponden a los genes ortólogos
de gsc y bra de ambas especies de Austrolebias y los hemos nombrado Abgsc,
Abbra, Acgsc y Acbra. Estos son los primeros genes codificantes aislados de este
género y nos permiten caracterizar los patrones de expresión temporal y espacial de
ellos, durante la embriogénesis.
77
A
>gscAch
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
B
TGCCGGCTGGGATGTTTAGGATCGACAGCATCCTTTCTGGACCGGTTCTGT
P A G M F R I D S I L S G P V L S
CCGGACGGCCGAACTGCAAGGAGCCGCTGCTGCTGCACCGAACCGGGCCGC
G R P N C K E P L L L H R T G P L
TGGTTCTGCCCGGACTCACGGACTCCATGTACGCGGACTACAGCGCACTGT
V L P G L T D S M Y A D Y S A L S
CCCCCCCGGGGGTCCACTCCGTGGGCGGAACCAGGTTCGGGTACGCGGGCT
P P G V H S V G G T R F G Y A G C
GTTACTACGGGCAGCTGCAGGTCCAGGGGCCCGGAGCGGGGCCCCCGTGCT
Y Y G Q L Q V Q G P G A G P P C C
GCGGGGCGGTACCGGGTCTGAGCCCGCAACAGTGCCCCTGCTTCCCCGCAG
G A V P G L S P Q Q C P C F P A G
GCTACGACAGTCCGGGCTCGGTTCTGATCTCGCCGGTCCCGCACCACATGA
Y D S P G S V L I S P V P H H M M
TGTCCTACATGAACGTGGGCAGCCTCTCGCGCACGGAGCTGCAGCTGCTCA
S Y M N V G S L S R T E L Q L L N
ACCAGCTGCACTGCAGGAGGAAGAGGAGGCACCGCACCATCTTCACCGACG
Q L H C R R K R R H R T I F T D E
AGCAGCTCGAGGCTCTGGAGGGCCTCTTCCAGGAGACCAAGTACCCGGATG
Q L E A L E G L F Q E T K Y P D V
TTGGCACGAGGGAGCAGCTGGCCCGGAAGGTCCACCTGAGGGAGGAGAAGG
G T R E Q L A R K V H L R E E K V
TCGAGGTCTGGTTCAAAAATCGCGCGCCAAATG
E V W F K N R A P N
>gscAb
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
DNA:
+3:
TGCCGGCCGGGATGTTCTGGATCGACAGCATCTTGTCCGGACGGCCGAGCT
P A G M F W I D S I L S G R P S C
GCAAGGAGCCGCTGCTGCTGCACCGCGGGGGCCCGCTGCTGCTGTCCGGTC
K E P L L L H R G G P L L L S G L
TCGCAGACTCGGTCTACGGGGACTACGGCGGACTGTACCCGGCCGCGCGCG
A D S V Y G D Y G G L Y P A A R G
GGCCGTCCCCGCCGGGGGTTCACTCCGTGAGCGGCACGCGGATCGGATATA
P S P P G V H S V S G T R I G Y N
ACGGCTACTACTACGGACAGCTGCAGGTTCAGGGCGCCGGGGGGGCGCCAC
G Y Y Y G Q L Q V Q G A G G A P P
CATGCTGCGGGGCCGTGGGAGGCCTGAGCCCGCAGCAGTGCCCCTGCATCC
C C G A V G G L S P Q Q C P C I P
CCGCAGGCTACGACAGCCCGGGCTCGGTGCTCATCTCCCCCGTGCCGCACC
A G Y D S P G S V L I S P V P H H
ACATGATGTCCTACGTGAACGTGGGCAGCCTGTCGCGCACGGAGCTGCAGC
M M S Y V N V G S L S R T E L Q L
TTCTGAACCAGCTGCACTGCCGCAGAAAGCGGAGGCATCGCACCATCTTTA
L N Q L H C R R K R R H R T I F T
CCGACGAGCAGCTCGAGGCTCTGGAGGGGCTCTTTCAGGAGACCAAGTACC
D E Q L E A L E G L F Q E T K Y P
CGGACGTTGGCACGCGGGAGCAGCTCGCGCGGAAGGTCCATTTGAGGGAGG
D V G T R E Q L A R K V H L R E E
AAAAGGTGGAGGTGTGGTTCAAGAATCGCCGCGCCAAATG
K V E V W F K N R R A K
Figura 9.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas
de goosecoid (gsc) A. Secuencias de gsc de A. charrua.
Secuencia aminoacídica en el marco de lectura +3. B.
Secuencias de gsc de A. bellottii. Secuencia
aminoacídica en el marco de lectura +3.
78
A
>braAch
DNA:
-2:
DNA:
-2:
DNA:
-2:
DNA:
-2:
DNA:
-2:
DNA:
-2:
DNA:
-2:
DNA:
-2:
DNA:
-2:
DNA:
-2:
B
TTTCAAGGAGCTGACCAACGAGATGATCGTCACCAAGAACGGCAGGCGCAT
F K E L T N E M I V T K N G R R M
GTTTCCGGTTCTGAAAGTGAACGTGTCCGGACTGGACCCGAACGCCATGTA
F P V L K V N V S G L D P N A M Y
CTCGGTTCTGCTGGACTTCGTGTCGGCGGACAACCACAGGTGGAAGTATGT
S V L L D F V S A D N H R W K Y V
GAACGGGGAGTGGGTGCCCGGAGGCAAACCCGAACCCCAGACCCCCAGCTG
N G E W V P G G K P E P Q T P S C
CGTGTACATCCACCCGGACTCCCCGAACTTCGGGGCCCACTGGATGAAGGC
V Y I H P D S P N F G A H W M K A
CCCGGTCTCCTTCAGTAAAGTCAAGCTGACGAACAAGCTCAACGGCGGAGG
P V S F S K V K L T N K L N G G G
TCAGATCATGTTAAATTCGTTGCACAAGTACGAGCCCCGCATCCACATCGT
Q I M L N S L H K Y E P R I H I V
GCGCGTTGGAGGCCCGCGGAGGATGATCACCAGCCACTCGTTTCCGGAGAC
R V G G P R R M I T S H S F P E T
GCAGTTTATCGCAGTTACAGCTTATCAAAACGAAGAGATTACGGCTCTGAA
Q F I A V T A Y Q N E E I T A L K
GATAAAACACAACCCCTTCGCCAA
I K H N P F A
>braAb
DNA:
-1:
DNA:
-1:
DNA:
-1:
DNA:
-1:
DNA:
-1:
DNA:
-1:
DNA:
-1:
DNA:
-1:
DNA:
-1:
DNA:
-1:
TTCAAGGAGCTGACCAATGAGATGATCGTCACCAAAAACGGCAGGCGCATG
F K E L T N E M I V T K N G R R M
TTTCCGGTTCTGAAAGTGAACGTGTCCGGACTGGACCCGAACGCCATGTAC
F P V L K V N V S G L D P N A M Y
TCGGTTCTGCTGGACTTTGTGTCGGCGGACAACCACAGGTGGAAGTATGTG
S V L L D F V S A D N H R W K Y V
GACGGGGAGTGGGTGCCCGGGGGCAAACCCGAACCCCAGACCCCCAGCTGC
D G E W V P G G K P E P Q T P S C
GTTTACATCCACCCGGACTCCCCGAACTTCGGGGCCCACTGGATGAAGGCC
V Y I H P D S P N F G A H W M K A
CCGGTCTCCTTCAGTAAAGTCAAGCTGACGAACAAGCTCAACGGCGGAGGG
P V S F S K V K L T N K L N G G G
CAGATCATGTTAAACTCGTTGCACAAGTACGAGCCCCGCATTCACATCGTG
Q I M L N S L H K Y E P R I H I V
CGGGTCGGAGGCCCGCGGAGGATGATCACCAGCCACTCGTTTCCAGAGACG
R V G G P R R M I T S H S F P E T
CAGTTTATCGCTGTTACAGCTTATCAAAACGAAGAGATTACGGCCCTGAAA
Q F I A V T A Y Q N E E I T A L K
ATCAAGCACACCCCTTCGCCAA
I K H T P S P
Fig 10.- Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de
brachyury (bra) A. Secuencias de bra de A. charrua.
Secuencia aminoacídica en el marco de lectura -2. B.
Secuencias de bra de A. bellottii. Secuencia aminoacídica
en el marco de lectura -1.
79
A
Gg
Mm
Xt
Dr
Ol
Ab
Ach
Tr
MPASMFSIDNILA-----ARPRCKDSVLLPP---SAPVVFPSLHGDSLYGA----ASDYG
MPASMFSIDNILA-----ARPRCKDAVLPVAPSAAAPVVFPALHGDSLYGAGGGTSSDYG
MPSGMFSIDNILA-----ARPRCKESVLLPQ---NGPMVFSSLG-ESLYGP-----ADYS
MPAGMFSIDSILA-----GRPSCKDSVLLHR---NAPVVFSNLT-ESLYTA----AGDFN
------------------------------------------------------------PAGMFWIDSILS-----GRPSCKEPLLLHR---GGPLLLS-GLADSVYG-------DYG
-PAGMFRIDSILSGPVLSGRPNCKEPLLLHR---TGPLVLP-GLTDSMYA-------DYS
MPSGMFSIDSILS-----GRPSCKEPLLLHR---SGPAVLPAGLSESLYT-------DYS
48
55
46
47
Gg
Mm
Xt
Dr
Ol
Ab
Ach
Tr
GFYSRAVAPG-SALP-AVGRSRLGYNNYYYGQLHVATSPVGPSCCGAVPPLGAQQCSCVP
AFYPRPVAPGGAGLPAAVGSSRLGYNSYFYGQLHVQAAPVGPACCGAVPPLGAQQCSCVP
GFYNRAVAPT-STLQ-AVTGSRLGFNNYYYGQLHVQT-PMGPSCCGAVQSLGTQQCSCVP
GLYSHTGPPA-PNLQ-SVNG-RIGYNNYYYGQLHVQG-PTGPACCGAIPTLGSQQCPCIP
---------------------------------------------G----LSPQQCPCIP
GLYPAARGPSPPGVHSVSG-TRIGYNGYYYGQLQVQGAGGAPPCCGAVGGLSPQQCPCIP
AL-------SPPGVHSVGG-TRFGYAGCYYGQLQVQGPGAGPPCCGAVPGLSPQQCPCFP
GLYSATCGPSPTGIQPVSGGTRIGYNGYYYGQLHVQASGGGAPCCVSVPSLSPQQCPCIP
*..***.*.*
106
115
103
103
11
102
100
105
Gg
Mm
Xt
Dr
Ol
Ab
Ach
Tr
-PAGYEGAGSVLMSPVPHQMLPYMNVGTLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL
TPPGYEGPGSVLVSPVPHQMLPYMNVGTLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL
PATAYDGAGSVLMPPVPHQMLPYMNVGTLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL
--TGYDSAGSVLISPVPHQMMSYMNVGTLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL
--AGYDSPGSVLISPVPHHMMSYVNVGSLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL
--AGYDSPGSVLISPVPHHMMSYVNVGSLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL
--AGYDSPGSVLISPVPHHMMSYMNVGSLSRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL
--AGYDSAGSVLLSPVPHQMMSYMNMGSLTRTELQLLNQLHCRRKRRHRTIFTDEQLEAL
..*:..****:.****:*:.*:*:*:*:******************************
165
175
163
161
69
160
158
163
Gg
Mm
Xt
Dr
Ol
Ab
Ach
Tr
ENLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESENAQKWNKA
ENLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESENAEKWNKT
ENLFQETKYPDVGTREQLARRVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESENTQKWNKS
ENLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESENSQKWNKS
EGLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEEPENPQKWNQR
EGLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAK--------------------EGLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRAPN--------------------EGLFQETKYPDVGTREQLARKVHLREEKVEVWFKNRRAKWRRQKRSSSEESEKSQKWN-*.******************:*************** .:
225
235
223
221
129
199
197
221
43
48
45
B
Figura 11.- Comparación de secuencias
aminoacídicas
de
goosecoid
de
Austrolebias con sus ortólogos de otros
organismos vertebrados
A.
Comparación
de
secuencias
aminoacídicas de gsc entre A. charrua (Ach)
y A. bellottii (Ab) con Gallus gallus (Gg), Mus
musculus (Mm), Xenopus tropicalis (Xt),
Danio rerio (Dr) y Orizias latipes (Ol). El
recuadro indica el homeodominio. Los
aminoácidos fueron coloreados según sus
características fisicoquímicas. B. Arbol
filogenético radial (unrooted tree) donde se
puede observar que todos los peces se
agrupan juntos entre sí y separados del
resto de los organismos comparados.
Hox2.2: gen de D. rerio que contiene
también un homeodominio y que se utilizó
como gen externo para la comparación. Se
eliminó medaka (Ol) para la construcción del
árbol debido a que el tamaño de la
secuencia comparada no era suficiente.
80
A
B
Mm
Gg
Xt
Ach
Ab
Ol
Dr
----------MSSPGTESAGKSLQYRVDHLLSAVESELQAGSEKGD---PTERELRVGLE
----------MGSP--EDAGKAPAYRVDHLLSAVESELQAGSEKGD---PTERELRVALE
----------MSTGTAESCGKNLPCRMDHLLTAVENELQVGSEKGD---PTERELKVNLE
PRLYTLCFRLVCCVELADNNFTQETAMTMITPSYLGDTIEYSSYASSLVPSSDPLVTAAS
----------------------------------------------------------------------------MSASNPDQRLEHLLSAVESEFQKGSEKGD---ASERDIKLTLE
-----------------MSASSPDQRLDHLLSAVESEFQKGSEKGD---ASERDIKLSLE
47
45
47
60
Mm
Gg
Xt
Ach
Ab
Ol
Dr
ESELWLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSFLLDFVTADNHRWKYVNG
DGELXLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVSVSGLDPNAMYSFLLDFVAADGHRWKYVNG
DTDLWIRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKISVTGLDPNAMYSFLMDFVTADNNRWKYVNG
VLEFAL-FKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSVLLDFVSADNHRWKYVNG
-------FKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSVLLDFVSADNHRWKYVDG
DADLWNKFKELTNEMIVTKTGRRMFPVLRASVSGLDPNAMYSVLLDFVAADNNRWKYVNG
DAELWTKFKELTNEMIVTKTGRRMFPVLRASVTGLDPNAMYSVLLDFVAADNNRWKYVNG
************.********: .*:*********.*:***:**.:*****:*
107
105
107
119
53
100
100
Mm
Gg
Xt
Ach
Ab
Ol
Dr
EWVPGGKPEPQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYE
EWVPGGKPEPQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYE
EWVPGGKPEPQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKMNGEGQIMLNSLHKYE
EWVPGGKPEPQTPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYE
EWVPGGKPEPQTPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTNKLNGGGQIMLNSLHKYE
EWVPGGKPEPQSPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLSNKLNGGGQIMLNSLHKYE
EWVPGGKPEPQSPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLSNKLNGGGQIMLNSLHKYE
***********:*****************************:**:** ************
167
165
167
179
113
160
160
Mm
Gg
Xt
Ach
Ab
Ol
Dr
PRIHIVRVGGPQRMITSHCFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKYNPFAKAFLDAKERNDHK
PRIHIVRVGGPQRMITSHSFPETQFTAVTAYQNEEITALKIKYNPFAKAFLDAKERNDHK
PRIHIVRVGGPQKMITSHSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHNPFAKAFLDAKERSDHK
PRIHIVRVGGPRRMITSHSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHNPFAK-------RANSA
PRIHIVRVGGPRRMITSHSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHTPSP------------PRIHIVKVGGIQKMISSQSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHNPFAKAFLDAKERSDHK
PRIHIVKVGGIQKMISSQSFPETQFIAVTAYQNEEITALKIKHNPFAKAFLDAKERSDHK
******:*** ::**:*:.****** ****************:.* .
227
225
227
232
160
220
220
40
40
Figura 12.- Comparación de secuencias
aminoacídicas
de
brachyury
de
Austrolebias con sus ortólogos de otros
organismos vertebrados
AComparación
de
secuencias
aminoacídicas de bra entre A. charrua (Ach)
y A. bellottii (Ab) con Mus musculus (Mm),
Gallus gallus (Gg), Xenopus tropicalis (Xt),
Orizias latipes (Ol) y Danio rerio (Dr). El
recuadro indica la caja T (T-box). Los
aminoácidos fueron coloreados según sus
características fisicoquímicas. B- Arbol
filogenético radial (unrooted tree) donde se
puede observar que todos los peces se
agrupan juntos entre sí y separados del
resto de los organismos comparados.
Tbx24Dr: gen de D. rerio que contiene
también un dominio de caja-T (T-box) y que
se utilizó como gen externo para la
comparación. Se eliminó la secuencia de A.
bellottii para la construcción del árbol,
debido a que el tamaño de la secuencia
comparada no era suficiente.
81
2.3.- Expresión temporal de gsc y bra mediante PCR en Tiempo Real
A partir de los ADNc obtenidos por retrotranscripción del ARN total de cada
estadío, 12 en total (desde el clivaje a embrión de 20 somitos) se analizó la
expresión temporal de gsc y bra mediante PCR en tiempo real. Se decidió usar esta
técnica ya que no fue posible una reproducibilidad confiable en los resultados
mediante PCR convencional. Para estos ensayos se diseñaron oligonucleótidos
específicos para cada gen, que permitieran la amplificación de un fragmento no
mayor a 150pb, dado que se ha demostrado que este requisito aumenta la eficiencia
de la técnica. Luego de conocer las condiciones adecuadas para estos genes se
realizó un ensayo por duplicado donde se analizaron en el mismo experimento los
12 estadíos tanto para gsc, bra y α-tub (como control positivo). El control negativo
correspondió a un tubo conteniendo todos los componentes excepto la muestra de
templado (ADNc), la que se sustituyó por agua destilada.
Los resultados muestran que no existe expresión de ARNm, de ninguno de
los 2 genes en estudio, durante el estadío de clivaje (2-8 células). La expresión en
ambos casos comienza a partir del estadío 50-90% de epibolia y se mantiene hasta
el estadío de somitogénesis (Fig. 13A y B). Por lo tanto con estos resultados
corroboramos que tanto gsc como bra estan presentes durante el período de
agregación
coincidentemente con lo que se observa por hibridación in situ (ver
abajo).
82
A
1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 cnt (-)
1
2
3
4
5
6
7
500
gsc
α-tub
8
9 10 11 12
500
bra
α-tub
B
1- 2-8cel.
2- 30-40%
3- 50-90%
4- 100%
5- AI
6- AII
7- AIII
8- AIV
9- AV
10- eje
11- 3som.
12- 20som.
0.8
gsc
0.7
bra
0.6
0.5
0.4
1- 30-40%
2- 50-90%
3- 100%
4- AI
5- AII
6- AIII
7- AIV
8- AV
9- eje
10- 3som.
11- 20som.
0.3
0.2
0.1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Figura 13.- Estudio de la expresión temporal de goosecoid y brachyury
A. Productos de amplificación por PCR de gsc y bra con su respectivo
control positivo de α-tub desde clivaje (2-8 células) hasta el estadío de 20
somitos. Tanto en gsc como en bra se detecta producto de amplificación a
partir de 30-40% de epibolia (carril 2) hasta el estadío de 20 somitos (12).
Cnt (-) representa el control negativo. A la izquierda de cada gel se señalan
los tamaños del estándar de peso molecular en pares de bases (pb). B. Se
graficaron los valores de cada gen en relación al valor de α-tub en cada
estadío. Para el cálculo de la concentración relativa de cada gen en cada
punto, se utilizó la fórmula: 2 (Ct α-tub st1 - Ct muestra st.1). Donde st1 representa un
estadío en particular y “Ct α-tub st1” representa el valor Ct para α-tub en
ese estadío y “Ct muestra st1” el valor Ct del gen en estudio (gsc o bra)
para el mismo estadío. Mediante estos cálculos se obtuvo un valor relativo a
α-tub, para cada gen en cada estadío. Se eliminó el estadío 2-8cel., ya que
se consideró con valor 0.
83
2.4.- Estudio del patrón de expresión de goosecoid y brachyury
A partir de los fragmentos génicos de gsc y bra clonados, se generaron
ribosondas específicas que permitieron realizar un análisis del patrón de expresión
mediante hibridación in situ, de uno (simple) o de ambos (doble) genes, en
Austrolebias.
Los resultados de las hibridaciones simples revelan que bra comienza su
expresión antes que gsc. La expresión de bra comienza en un grupo de células
centrales del AIIIm (Fig. 14A). Dicha marca se aprecia como una agrupación celular
de forma circular, que rodea un zona de menor concentración celular en la región
central de la marca (Fig. 14A'). Posteriormente, a partir de AIIIt se aprecia la
expresión de ambos genes, bra y gsc (Fig 14B y G). El patrón de expresión de bra
corresponde a una marca circular más compacta. En este estadío se observan
prolongaciones de la tinción, que sugieren el rompimiento de la simetría radial (no es
posible aún distinguir el eje antero-posterior del embrión) (Fig 14B’). En el caso de
gsc, la expresión comienza en un grupo muy pequeño de células en la zona central
del AIIIt (Fig. 14G). A medida que el desarrollo avanza aumenta el tamaño del
dominio de expresión de bra y en el estadío AIV la marca se dispone según un
círculo central al agregado (Fig. 14C y C’).
La expresión de gsc durante el AIV también aumenta de tamaño y cambia de
forma a una marca alargada elíptica (Fig. 14H). Durante AV la marca de bra se hace
elíptica, afinándose hacia un extremo (Fig. 14D). En el extremo contrario se aprecia
una región circular libre de marca (Fig. 14D’, flecha). A partir de éste estadío, AV, se
distingue el futuro eje antero-posterior del embrión. Las células que expresan gsc
durante el AV se disponen formando una estructura axial, la cual se ensancha hacia
el extremo anterior (Fig. 14I), la placa precordal presuntiva. En el estadío de eje
inicial la expresión de bra se concentra en el extremo posterior, marcando un
dominio celular circular, el cual correspondería al organizador de la cola o “tailbud”. A
partir de ese dominio surgue una estructura axial que se marca inténsamente, la
notocorda posterior, que está comenzando a formarse (Fig. 14E y E’). La marca de
84
gsc en el estadío de ejei se mantiene ancha hacia anterior y afinada hacia posterior
(Fig. 14J).
85
goosecoid
brachyury
DAPI
A
A’
B
B’
G
M
C
C’
H
N
D
D’
I
O
E
E’
J
P
F
F’
K
Q
L
AIIIm
AIIIt
AIV
AV
ejei
*
ejet
Figura 14.- Hibridación in situ simple de goosecoid y brachyury
86
En el último estadío analizado, eje tardío, bra se concentra en la región caudal del
embrión (Fig. 14F) marcando claramente parte de la notocorda posterior y el
organizador de la cola (Fig. 14F’). El patrón de expresión de gsc en ejet corresponde
a un grupo pequeño de células formando un círculo concentrado en el extremo
anterior del eje (Fig. 14K). En la secuencia de la figura 15 de L a Q se puede
apreciar como cambia la forma del embrión (cuyos núcleos celulares están
marcados con DAPI) a medida que el desarrollo transcurre.
Figura 14.- Hibridación in situ simple de goosecoid y brachyury
A-F patrón de expresión de bra, A’-F’ detalle con mayor aumento del patrón de expresión de
bra, analizado en secuencia A-F, G-K patrón de expresión de gsc, L-Q cambios morfológicos
del agregado a través del tiempo, marcado con DAPI. A. Inicio de la expresión bra en el AIIIm,
se aprecia un grupo de células marcadas al centro del agregado. Con línea punteada se indica
el borde aproximado del agregado. A’. Detalle a mayor aumento de expresión de bra al inicio
de su expresión, AIIIm. Un grupo poco compacto de células rodea la región central sin marca.
B. Aumento en número de células que expresan bra en el estadío de AIIIt. B’. AIIIm, bra se
expresa en un grupo más compacto de células a partir de las cuales se aprecian dos
prolongaciones que rompen la simetría radial del agregado (flecha indica una prolongación). C.
bra se expresa en un círculo compacto de células al centro del AIV. D. En AV, las células que
expresan bra se organizan según una estructura elíptica, afinada hacia el extremo anterior. C’.
Expresión de bra en AIV según un círculo central de un número mayor de células. Se aprecian
regiones circulares no marcadas. E. En ejei se observa que bra se expresa marcando una
estructura axial, la notocorda posterior presuntiva (flecha), y un círculo desplazado hacia
posterior, el organizador de la cola. E’. Expresión de bra en ejet, marca región circular posterior,
el organizador de la cola y estructura axial, notocorda posterior presuntiva (flecha). F. ejet, la
marca de bra está más desplazada hacia posterior. D’. Agregado en RV, bra se expresa
formando una elípse, en la región central posterior de la cual se aprecia una zona circular
menos marcada (flecha). F’. Expresión de bra en ejet, se aprecia claramente la marca en un
segmento de la notocorda posterior (flecha) y en el organizador de la cola (asterisco). G. Inicio
de la expresión gsc en el AIIIt, se aprecia un grupo poco compacto de células marcadas al
centro del agregado (flecha). H. La expresión de gsc en AIV, tiene forma circular más compacta
(flecha). I. En AV gsc marca una estructura axial, la placa precordal (cabeza de flecha),
desplazada hacia anterior. J. Expresión de gsc en ejei como estructura axial ensanchada hacia
anterior, la placa precordal. K. En ejet gsc se concentra en la región más anterior del agregado
con una marca circular. L. AIIIm marcado con DAPI se aprecia acumulación de células poco
compacta en un punto del agregado. M. AIIIt, aumento en compactación de células en zona
central del reagregado. N. AIV, agregado circular y con un aumento importante en la
concentración de células. O. AV cambio de forma del agregado a elíptico P. ejei, embrión
elíptico con región posterior ensanchada. Q. ejet, embrión alargado donde se aprecia eje
embrionario coomo estructura axial afinada que ocupa dos tercios del embrión. A partir de AV,
donde el eje antero-posterior es identificable, los embriones fueron orientados con su extremo
anterior hacia la izquierda. Barras corresponden a 150μm.
87
Se realizó un estudio detallado de la expresión de bra en AV. Para esto se
realizaron cortes, transversales y longitudinales, de embriones en AV hibridados
para bra (Fig. 15A,C yD). Como se mencionó previamente durante AV bra se
expresa según una elipse desplazada hacia la región posterior del embrión, la cual
se afina hacia el polo anterior (Fig. 15A). En la zona central de dicha marca se
distingue una región circular de menor concentración de marca (indicada con línea
discontinua en Fig. 15A). Al analizar los embriones en AV hibridados para bra
mediante cortes, se observó que en un corte transversal la marca de bra se presenta
como dos engrosamientos simétricos a ambos lados de una región central menos
marcada (engrosamientos delineados con lineas discontinuas en Fig 15C). Al centro
de dicha zona de menor marca se observa, a su vez, una estructura circular al corte,
formada por células que se disponen concéntricas a un punto, la cual podría
correspoder a la notocorda en formación (asterisco en Fig. 15C). Los cortes
longitudinales revelan que las células que expresan bra forman una estructura
engrosada hacia un extremo de la marca (flecha en Fig 15D). El resto de las células
marcadas se disponen alineadas y paralelas a la superficie del embrión,
disminuyendo su expresión a medida que se alejan de la zona del engrosamiento.
Se observó también que bra se expresa intensamente en las células más
superficiales del embrión.
88
A
A
P
B
C
D
1
B
1
C
C
*
D
Figura 15.- Análisis del patrón de expresión de brachyury durante el estadío AV
A. Patrón de expresión de bra en AV, se aprecia como las células que expresan bra se
concentran formando una estructura elíptica al centro de la cual existen células con menor
marca (línea blanca discontinua indica borde de zona menos marcada). El óvalo punteado
indica los bordes aproximados del agregado, la flecha A-P indica la dirección del eje
antero-posterior. B. Agregado en AV hibridado para bra, cuyos nucleos celulares están
marcados con DAPI. En la región donde se expresa bra la marca de DAPI no se aprecia.
Se observa una región central a la marca de bra donde se aprecian núcleos marcados con
DAPI, por lo tanto pertenecientes a células que no expresan bra (línea discontinua marca
borde de dicha región). C. Corte transversal de embrión en RV hibridado para bra (a
través de línea discontinua roja en A). Se observa una región central donde se concentran
las células que no expresan bra (flecha negra), y dos zonas simétricas a sus lados, donde
se concentran las células mesodérmicas que expresan bra (el borde de dichas estructuras
se muestra con línea blanca discontinua). El asterisco está debajo de una estructura
circular marcada con bra, que probablemente corresponda a la notocorda en formación. D.
Corte longuitudinal, a través de la línea discontinua blanca en A. Se observa un
engrosamiento formado por células que expresan bra (flecha) hacia un extremo. Hacia el
extremo contrario la marca se afina.
89
Cuando se estudió la expresión de ambos marcadores a la vez, mediante hibridación
in situ doble, se verificó que la expresión de bra comienza previo a la de gsc, en
AIIIm (Fig. 16A). Las células que expresan bra forman una estructura circular al
centro del agregado. Posteriormente comienza la expresión de gsc, en un grupo
pequeño de células de una región marginal a la marca de bra en el AIIIt (Fig. 16B,
flecha), indicando que existe un pequeño grupo de células que expresa ambos
marcadores simultáneamente. Posteriormente, y a medida que el desarrollo avanza,
ambas marcas se segregan, manteniendose una región central donde se solapan
(Fig. 16C). En un embrión al inicio del proceso de agregación IV (AIVi) las células
que expresan bra forman una estructura circular compacta y algo alargada, a partir
de la cual se aprecia una estructura menor y redondeada de células que expresan
gsc (Fig. 16C). Al final de éste estadío, AIV tardío, ambas marcas se han separado
aún más, aunque manteniendo cierta superposición al centro del embrión (Fig. 16D).
gsc se expresa en células que forman una estructura axial ancha, con un eje mayor
de 50μm y un eje menor de 35μm. Las células que expresan bra se organizan
formando un círculo de aproximadamente 100μm de diámetro, con una región de
menor marca en la zona central posterior (Fig. 16D). Al inicio del proceso de
agregación V (AV inicial) se aprecia como las células que expresan gsc se han
extendido a lo largo del eje antero-posterior, formando una estructura alargada de
100μm en su eje mayor, la cual se ensancha hacia la región anterior (Fig. 16E). La
marca de bra se mantiene como un círculo en contacto con las células que expresan
gsc. Al final del proceso de AV (AV tardío) las células que expresan bra se extienden
y disponen formando una elípse cuyo extremo anterior se afina. Como se observó
previamente, en las hibridaciones simples, se aprecia que en la región central
posterior de dicha marca, existen células que no expresan bra (Fig. 16F, flecha
blanca). El eje mayor de dicha elipse mide aproximadamente 190μm. En este
estadío la marca de gsc ha disminuido en extensión y en la región anterior se
concentra la mayor parte de las células que expresan gsc (Fig. 16F). Posteriormente,
cuando ya se formó el eje embrionario (eje medio), se aprecia como ambas marcas
se distancian disminuyendo su extensión, con patrones de expresión opuestos,
concentrándose gsc en la región cefálica y bra en la región caudal (Fig. 16G). El
90
patrón de expresión de gsc recuerda a una flecha, patrón descrito en otros
organismos para la placa precordal. En el último estadío analizado, embrión en eje
tardío, las marcas de ambos genes están completamente segregadas a los extremos
del embrión y se aprecia como bra marca parte de la notocorda posterior (Fig. 16H).
Las células que expresan gsc marcan una franja transversal al eje en la región
cefálica, donde se están formando las vesículas ópticas (Fig. 16H, flecha).
91
A
B
C
D
E
F
G
H
ppc
vo
ntc
Figura 16.- Hibridación in situ doble de goosecoid (azul) y brachyury (rojo)
92
3. Estudio de mecanismos celulares morfogenéticos involucrados
en el proceso de agregación
3.1.- Análisis de destino celular durante la agregación
Con el objeto de determinar el destino de las células que forman el agregado
de
Austrolebias,
se
analizaron
embriones
microinyectados
con
Kaede
y
fotoconvertidos en diferentes estadíos del desarrollo.
Se realizaron ensayos de fotoconversión en embriones en AI, fotoactivando
tanto la totalidad de las células agregadas, como regiones del agregado que
abarcaban aproximadamente la mitad del agregado. En todos los ensayos
realizados (n=12) se observó que las células fotoactivadas (marcadas con
fluorescencia roja) se desplazaban hacia la periferia del agregado, formando
inicialmente una corona que
rodeaba una estructura central de células más
compactadas del agregado, no fotoactivadas (marcadas con fluorescencia verde)
(AIV) (Fig. 17).
Figura 16.- Hibridación in situ doble de goosecoid y brachyury
A. Inicio de la expresión de bra en AIIIm, formando un círculo en la zona central del agregado.
B. Inicio de la expresión de gsc en región marginal a la marca de bra. Existe solapamiento de un
grupo de células que expresa ambos marcadores. gsc marca extremo anterior presuntivo
(flecha). Línea punteada indica borde aproximado de agregado. C. AIV inicial, las marcas de gsc
y bra se segregan hacia extremos opuestos, pero manteniendo región central de superposición.
D. En AIV tardío las células que expresan gsc se organizan según una estructura axial la cual se
conecta en la zona central con las células que expresan bra. Estas últimas se disponen
formando un círculo, cuya zona central posterior presenta menor marca (flecha). E. AV inicial, la
marca de gsc se ha extendido en el eje antero-posterior, formando una estructura axial de unos
100μm (flecha). bra con una expresión circular está presente en un extremo de dicha marca. F.
AV tardío, la marca de gsc se acorta presentando su extremo anterior ensanchado. bra presenta
una marca en forma elíptica con su extremo anterior (el que hace contacto con gsc) afinado. Se
aprecia una zona de menor marca dentro de la región de expresión de bra (flecha). G. ejei,
donde se aprecia la segregación de ambas marcas, gsc hacia anterior marcando la placa
precordal (ppc) y bra con una forma elíptica (con el extremo anterior más fino) hacia posterior.
H. Segregación completa de ambas marcas hacia los extremos. gsc se concentra en extremo
anterior marcando una franja transversal al eje, donde se aprecian las vesículas ópticas en
formación (vo). bra se concentra en extremo posterior marcando la notocorda posterior (ntc) y el
organizador de la cola (asterisco). Los embriones fueron orientados con su extremo anterior
hacia la izquierda.
93
Posteriormente, se observó que el grosor de la corona celular disminuía a
medida que el área ocupada por las células centrales aumentaba. Finalmente, las
células de la corona se redistribuían formando al inicio una estructura en forma de
herradura y posteriormente concentrándose en un polo del agregado en AV (Fig 17A
a C). Una vez que se aprecia la formación del eje y se puede distinguir la región
cefálica de la caudal, es evidente que la región de acumulación de las células
correspondía al futuro extremo posterior del embrión. Por lo tanto en base a estos
experimentos, podemos concluir que ninguna de las células del AI forman parte del
embrión propiamente tal y que además mantienen un tamaño considerablemente
mayor al de células embrionarias (Fig. 17D a F). En la mayoría de los casos cuando
el embrión presenta alrededor de 15 somitos, se observan que el AI da origen a
células que se localizan en forma simétrica a ambos lados del eje embrionario, pero
en una posición profunda, hacia el vitelo.
Fotoconversiones en embriones en AII tanto en la región central como en la
totalidad del agregado, originó los mismos resultados descritos para el AI, (n=10).
94
A
B
C
*
AII
D
F
E
Figura 17.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación temprano
A-F. Proceso de agregación celular, donde se observa un grupo de células fotoconvertidas
(rojas) y el resto del agregado formado por células no activadas (verdes). A. AII, cuyas
células centrales fueron fotoconvertidas (zona de fotoconversión indicada con línea
discontinua). B. AIIIt las células fotoconvertidas migran hacia la periferia. C. AV, las células
activadas se concentran en la periferia del agregado, acumulándose en un extremo. La zona
central del agregado está formada por células no activadas (asterisco). D. Región posterior
de embrión en ejem. Se observan las células concentradas en la periferia de dicha región. El
eje embrionario está formado exclusivamente por células no activadas (flecha). E-F.
Embriones somíticos (3 y 10 somitos, respectivamente), la totalidad de las células activadas
se concentran en la periferia de la región posterior del embrión, no formando parte de este
(flecha en F indica una células roja externa al embrión).
95
Ensayos de fotoactivación en embriones en AIIIi, (Fig. 18A-E) en los cuales se
intentó abarcar a todas las células que formaban el agregado (n=5), evidenció que si
bien gran parte de las células fotoactivadas tienen destino extraembrionario y se
concentran en la región posterior del embrión, algunas de ellas también forman parte
del embrión, ubicándose en la notocorda (Fig. 18G) o formando parte de los somitos
(Fig. 18H). Fotoconversiones de embriones en AIIIm, tanto en la región central de
éstos como abarcando a la mayoría (90%) de las células del agregado, dio
resultados similares a los descritos para AIIIi (Fig. 19A-C, n=8). Sin embargo, se
comprobó que existía un aumento muy importante en el número de células que
tenian destino a
tejidos embrionarios (Fig. 19D-I). Muchas de éstas células se
observaron formando parte de un tejido poco compacto de tipo mesenquimático, que
se ubicó a ambos costados del tubo neural, desde la región cefálica a la caudal (Fig.
19G-I)
Pruebas de fotoconversión tardías, en la zona central de AIV y AV (n=3 en
cada caso) mostraron que si bien algunas células permanecen con destino
extraembrionario, la gran mayoría, si no todas formarán parte de tejidos
embrionarios (ver Tabla 5).
En resumen a partir de estas observaciones podemos decir que:
1- Las primeras células que se agregan
(AI y AII) son de destino
extraembrionario.
2- A partir de AIIIi comienza la agregación de células embrionarias.
3- Es posible identificar la futura región caudal del embrión a partir de AIV,
debido a la concentración de células extraembrionarias de mayor tamaño en
un polo del agregado.
Estos resultados fueron muy útiles para los experimentos posteriores, ya que
permitieron entender que debíamos focalizar el estudio del proceso de formación del
embrión, propiamente tal, a partir del AIIIi.
96
A
B
C
D
E
F
G
H
I
AIIIi
Figura 18.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación medio
A. La totalidad de las células del AIIIi fueron fotoconvertidas (células rojas). B. AIIIm, se
observa como las células activadas se disgregan mezclándose con otras no activadas. C. AIV
tardío, donde se aprecia como la mayoría de las células activadas están concentradas en la
región posterior (flecha). La mayoría de las células que forman el agregado no están
activadas. D. AV, células activadas concentradas en región posterior. E. Embrión en ejet. La
mayoría de las células activadas se encuentran en periferia posterior de embrión, aunque
algunas se aprecian mezcladas en región de células no activadas embrionarias (flecha) F.
Embrión de 15 somitos. Un grupo de las células activadas se concentra en la zona medial
profunda del embrión, debajo de los somitos, formando dos estructuras simétricas a ambos
lados del tubo neural. G. Inserto de embrión de 15 somitos (F) donde se aprecian células
activadas formando parte de la notocorda (cabezas de flecha). H. Inserto de embrión de 15
somitos (F) donde se aprecia somito formado por células activadas. I. Inserto de embrión de
15 somitos (F) por debajo de somitos donde se aprecian estructuras bilaterales a los lados de
tubo neural, formadas principalmente por células activadas. Barras G-I 100μm.
97
A
B
C
D
E
F
G
H
I
AIIIm
Figura 19.- Estudio de destino celular durante el proceso de agregación
celular tardío
A. Fotoconversión de células correspondientes a la mitad de las células agregadas
en AIIIm. B. Durante AIIIt, algunas de las células activadas se concentran en la
periferia y otras se mantienen cercanas a la zona central del agregado (flecha). C.
AV, la mayoría de las células activadas se aprecian concentradas en el extremo
posterior (agregado delimitado con línea discontinua). D a F Embriones somíticos: 3
somitos (D), 10 somitos (E) y 15 somitos (F). Se aprecia que existen células
activadas tanto en la periferia, como formando parte del embrión. G a I Insertos
correspondientes a la secuencia D a F respectivamente, donde se aprecia como un
número importante de células activadas forman parte principalmente de un tejido
embrionario, el que se ubica a los costados del tubo neural (flecha en H). Los
rectángulos de línea discontinua en D a F señalan la zona donde se tomaron las
imágenes correspondientes a G a I.
98
Tabla 5. Ensayos realizados para el estudio del destino celular
Estadío
Zona fotoconversión
Destino
n
AI
centro y todo
extraembrionario
12
AII
centro y todo
extraembrionario
10
AIIIi
todo
Extraembr. y embr.
5
AIIIm
centro y todo
Extraembr. y embr.
8
AIIIt
centro
Extraembr. y embr.
5
AIV
centro
Extraembr. y embr.
3
AV
centro
Embrionario
3
3.2.- Estudio dinámico, por microscopía en tiempo extendido, del proceso de
agregación temprano
A partir de las imágenes en tiempo extendido tomadas tanto con campo claro
como con microscopía confocal, se realizó un análisis de la dinámica del proceso de
agregación, desde AI a AIV. Además se identificaron distintos tipos celulares por su
morfología y comportamiento migratorio. Inicialmente el agregado celular de
Austrolebias está formado por células de aspecto mesenquimático, las que migran
activamente produciendo filopodios y lamelipodios. Se aprecia que la mayoría de
dichas extensiones de membrana se dirigen hacia la superficie, aparentemente
contactando con la superficie interna de la EVL. Una vez que un grupo de células
coincide en el punto inicial de agregación, disminuye la formación de proyecciones
de membrana. En este momento (AII) el movimiento celular dentro del agregado, se
hace apenas perceptible. Sin embargo fuera de éste las células mantienen un
movimiento activo. El análisis de la dinámica de migración celular permitió extender
la descripción de los tres grupos celulares hecha previamente para el AIIIm y definir
tres poblaciones nuevas, las cuales se mantienen externas al agregado celular (Fig.
20).
99
3.2.1a.- Poblaciones celulares del agregado
Los criterios para definir las poblaciones celulares se basaron en: morfología
celular, tamaño, ubicación en relación al agregado, comportamiento migratorio (tipo
de proyecciones de membrana, dirección y velocidad de desplazamiento). Ya que
las tres primeras fueron definidas previamente (y se mantuvo su numeración), para
ellas se mencionará únicamente la información relacionada con comportamiento
migratorio.
Población celular 1.- Células multinucleadas grandes
Grupo que representa aproximadamente el 2-5% de células del agregado,
distinguibles tempranamente en la zona de agregación y que posteriormente se
ubican en la periferia del agregado. Si bien presentan proyecciones de membrana de
tipo filopodios, su desplazamiento es casi nulo. Se mantienen ancladas en diversos
puntos externos al agregado (Fig. 20B). Otra particularidad de estas células es que
son multinucleadas. Durante el proceso de AIIIm se observó que la división de una
de éstas células originó 6 células mononucleadas.
Población celular 2.- Células extraembrionarias
Población de células redondeadas que representa aproximadamente el 70%
del total de células del AIIIi (Fig. 20C). Estas células no emiten prolongaciones
evidentes y se desplazan intercalándose unas con las otras, a través de un
movimiento oscilatorio. Esto genera que constantemente las células cambien de
posición en relación a sus células vecinas. A medida que el desarrollo avanza éstas
células se concentran en la periferia del agregado y posteriormente (AIV-AV) en la
región caudal del embrión. Esta población celular formará el tejido extraembrionario
descrito previamente, identificado mediante los experimentos de destino celular.
100
A
C
D
B
E
F
B
E
E’
.
C
F
F’
.
D
.
.
G’
G
.
.
Figura 20.- Análisis de poblaciones celulares del agregado en el estadío AIIIm
101
Población celular 3.- Células embrionarias
Población que corresponde a las células de menor tamaño, las cuales se
ubican en la zona central del agregado a medida que el desarrollo avanza. Esta es la
población celular embrionaria (Fig. 20D). La descripción de su desplazamiento e
internalización dentro del agregado se realizará más adelante (ver sección 3.2.2.).
3.2.1b.- Poblaciones celulares externas al agregado
Población celular 4.- Células periféricas con lamelipodios
Población celular mayoritaria dentro del grupo de las células externas al
agregado. Presentan características de células migratorias mesenquimáticas,
generalmente formando un gran lamelipodio en la dirección de avance de la célula
(Fig. 20E). Miden en promedio 60±7μm (n=20). Se encuentran en la periferia del
agregado y muchas de ellas permanecen asociadas a la zona externa del agregado.
Migran a una velocidad promedio de 0,7±0,3μm/min con movimientos en círculo y un
desplazamiento neto reducido (Fig. 20H). Una proporción importante de dichas
células parecen migran preferentemente en los bordes de las células que forman la
EVL, tejido suprayacente.
Figura 20.- Análisis de poblaciones celulares del agregado en el estadío AIIIm
A. Vista superior de AIIIm, donde se distinguen cinco de las seis poblaciones celulares descritas.
Se indican con rectángulos de línea discontinua los lugares de los insertos B a F. B. Célula
perteneciente a la población 1 (borde indicado con línea discontinua), de gran tamaño,
multinucleada, la que se mantiene en la periferia del agregado. C. Células pertenecientes a la
población 2 (una célula delimitada con línea discontinua). Son las primeras células que se
agregan y en este estadío se aprecian epitelializadas. D. Célula perteneciente a la población 3
(indicada con flecha y borde con línea discontinua), las de menor tamaño intercaladas entre
células de la población 2. Corresponden a las células embrionarias. E. Célula perteneciente a la
población 4. Células periféricas, pero cercanas, al agregado, que forman grandes lamelipodios. F.
Célula de la población 5, externa al agregado, que forma proyecciones de membraba de tipo
blebs. G. Célula de la población 6 (indicada con flecha y borde con línea discontinua). Célula que
pasa esporádicamente por la zona de agregación a gran velocidad, formando filopodios y
lamelipodios en diferentes direcciones. E’, F’ y G’. Representación esquemática de caminos
hechos por dos células pertenecientes a las poblaciones 4 (E), 5 (F) y 6 (G), respectivamente.
Con un punto azul se indica el lugar desde donde parte el movimiento y con cabeza de flecha la
dirección del desplazamiento.
102
Población celular 5.- Células formadoras de blebs
Grupo celular reducido en número pero que se aprecia con una distribución
aleatoria (dentro y fuera) por toda la suerficie del huevo. Formado por células
redondeadas cuya característica principal es que forman numerosas proyecciones
de membrana de tipo bleb con un desplazamiento no direccional, en círculos (Fig.
20F, F’). La velocidad promedio de desplazamiento es de 0,7±0,4μm/min (n=5).
Población celular 6.- Células migratorias rápidas
Población de células externas al agregado formada por células de movimiento
rápido que se ubican por toda la superficie del huevo y que esporádicamente pasan
por la zona de agregación, a una velocidad promedio de 4,9±2μm/min (n=5).
Presentan formas diversas (alargadas de tipo bipolar, triangulares, filiformes, etc.) y
forman lamelipodios en diferentes direcciones, generando un desplazamiento
direccional que puede cambiar de sentido muy rápidamente (Fig. 20G, G’). Al pasar
por el agregado diminuyen su velocidad, pero una vez que lo atraviesan aceleran
nuevamente su desplazamiento.
3.2.2.- Epitelialización y migración centrípeta de células embrionarias durante
la agregación
Al inicio del proceso de agregación (AI) el embrión está formado únicamente
por células de tipo mesenquimático, de formas diversas, muchas de ellas alargadas
de tipo bipolar (Fig. 21A y B). Estas células migran activamente emitiendo filopodios
en todas direcciones, mediante los cuales se contactan tanto entre ellas como con la
EVL. A medida que tiempo transcurre el número de células en la zona de agregación
aumenta pero todavía presentan morfología de células mesenquimáticas, y se
mantienen distanciadas unas de otras (AI tardío, Fig. 21B).
103
A
B
AI inicial
AI tardío
C
D
*
AII inicial
AII tardío
E
F
AIIIi
AIIIm
H
G
I
*
Figura 21.- Proceso de epitelialización durante la agregación celular temprana
104
Durante AII si bien existe una población importante de células migratorias y de
aspecto mesenquimatoso, las células al centro del agregado se aproximan, dejan de
emitir proyecciones de membrana, generando un grupo celular más compacto de
aspecto epitelial con células de morfología poliédrica (AII inicial, asterisco Fig. 21C).
Estas células pertenecen a la población 2, descrita previamente, las cuales formarán
un tejido extraembrionario caudal, tardíamente en el desarrollo. A medida que el
proceso de agregación avanza, los contactos celulares aumentan, y se forma una
monocapa celular compacta (AII tardío, Fig. 21D y corte óptico transversal). En la
periferia de esta población celular, se aprecia un número reducido de células
grandes y alargadas cuyo desplazamiento es casi nulo (población 1). El proceso de
transición entre una monocapa y el agregado celular multicapa, está representado
por el AIIIi. A partir de éste momento se aprecia como las células que forman el
agregado se agrupan en diversos puntos formando estructuras supracelulares
epitelializadas (AIIIi, Fig. 21E). Si bien las regiones libres de células han disminuído
considerablemente, aún se aprecian algunos pequeños espacios entre estas
agrupaciones celulares epiteliales. En AIIIi se pueden distinguir la aparición de
células en zonas más profundas del agregado (ver corte óptico transversal de AIIIi
en Fig. 21E).
Figura 21.- Proceso de epitelialización durante la agregación celular temprana
A. AI temprano, formado por pocas células de aspecto mesenquimático, que forman filopodios,
lamelipodios y lobopodios (flecha). B. AI tardío, aumento en el número de células
mesenquimáticas, las que se contactan emitiendo una red de filopodios (cabezas de flecha). C
a F. Vista superior y cortes asociados (transversales en el eje z), durante el proceso de
agregación temprano (RII a RIIIm). C. AII inicial, se aprecian células migratorias
mesenquimáticas (flecha) migrando hacia el agregado celular. Existe zona de células
agregadas previamente (asterisco), las cuales se mantienen como una monocapa (ver corte
transversal asociado). D. AII tardío, se observa como las células aumentan sus contactos
(región delimitada con línea punteada), aún existen células migratorias que se incorporan al
agregado (flecha), el cual se mantiene como una monocapa (ver corte) E. AIIIi, las células
agregadas se reorganizan comenzando la internalización de células individuales (ver flecha en
corte asociado) F. AIIIm, de aspecto epitelial, con células en estrecho contacto que se
internalizan. Se aprecia la formación de estructuras organizadas supracelulares, con aspecto
de rosetas (borde de una roseta delíneado con línea discontinua). G. Inserto de F (al nivel
indicado con rectángulo). Se muestra una roseta, la cual se define como una célula central
redondeada (asterisco) rodeada en general por seis o más células, cuyas membranes laterales
están en estrecho contacto. H. Representación según un modelo 3D de la roseta mostrada en
G. I. Representación según un modelo 3D de una vista inferior de la roseta mostrada en G. Se
aprecian las proyecciones de membrana de tipo lobopodio, que emiten éstas células (flechas)
en diferentes direcciones. Barras C a F, 80μm y G 30μm.
105
Desde el inicio del proceso de AIIIm se observan en la zona central del
agregado la formación de estructuras supracelulares organizadas en forma de
rosetas (Fig. 21F) formadas por una célula central rodeada de al menos seis células,
cuyas membranas laterales se aprecian en estrecha aposición (Fig. 21G, H y I).
Estas
agrupaciones
celulares
son
las
primeras
estructuras
supracelulares
distinguibles durante el proceso de agregación temprano (desde el inicio de AIIIm) y
serían un indicio del proceso de epitelialización que sufre el embrión en éste
período. Mediante la segmentación y reconstrucción en 3D de dichas estructuras en
roseta, se pudo apreciar que en general las células que las componen forman
proyecciones de membrana de tipo lobopodios, tanto hacia la superficie como hacia
zonas profundas, mediante los que se contactan con las células vecinas (Fig. 21H,I).
En el AIIIm temprano y a medida que el desarrollo avanza, se puede apreciar
como células de menor tamaño, las células embrionarias pertenecientes a la
población celular 3, comienzan a intercalarse entre los agregados de células
extraembrionarias de aspecto epitelial (Fig. 22A y D). Las células embrionarias
posteriormente migran en forma centrípeta, concentrándose en la zona central del
agregado (AIIIm intermedio). Concomitantemente las células extraembrionarias, que
originalmente se encontraban formando diversas agrupaciones supracelulares de
aspecto epitelial en la zona central del agregado, se desplazan hacia la periferia,
inicialmente quedando como grupos separados de células, en distintas zonas de la
periferia del agregado (Fig. 22B y E). A medida que las células embrionarias se
concentran en el centro del agregado, las células extraembrionarias se reorganizan
en la periferia formando un tejido coherente, con aspecto de corona (Fig. 22C y F).
106
A
A’
*
AIIIm
B
B’
C
C’
Figura 22.- Migración centrípeta de células embrionarias en el agregado de
estadío AIIIm
107
3.2.3.- Análisis del proceso de internalización celular en AIIIm
Debido a que el período de agregación involucra aproximadamente 5 días de
desarrollo, para el análisis del proceso de internalización del endomesodermo fue
necesario centrar el estudio en un período acotado del desarrollo. Mediante los
experimentos de destino celular se pudo entender que:
1- Los AI y AII corresponden a una monocapa celular de tejido extraembrionario.
2- La formación del embrión multilaminar ocurre a partir del AIIIi.
Por lo tanto, el análisis de los eventos de internalización de células
embrionarias, se centró en el proceso de AIII. Como se mencionó previamente, el
período de AIII dura aproximadamente 65hs y para su descripción fue necesaria su
subdivisión en AIIIi, AIIIm y AIIIt. El análisis celular del proceso de internalización se
concentró en el período intermedio del AIIIm, este estadío dura 35hs. Se estudió el
proceso de internalización celular en la región central del AIIIm intermedio, mediante
microscopía confocal en 3 dimensiones, cubriendo un período de 3 horas. Para
analizar el desplazamiento de células individuales en el eje z, a través del tiempo se
utilizó una herramienta (Slice) en el programa Volocity, la cual permite realizar cortes
ópticos del embrión.
Figura 22.- Migración centrípeta de células embrionarias en el agregado de estadío AIIIm
A. Agregado al inicio de AIIIm. Se aprecian células grandes y poliédricas (extraembrionarias,
población 2) desplazadas hacia la periferia (flechas). Las células embrionarias (asterisco) de
menor tamaño se aprecian abarcando todos los espacios entre las células extraembrionarias,
distribuidas por toda la superficie del agregado. A’. Núcleos (canal rojo) correspondientes a
células de A. Los núcleos de las células extraembrionarias son más grandes y brillantes que los
núcleos de las células embrionarias. Las células embrionarias muestran una distribución amplia
en el agregado. B. AIIIm intermedio. Las células embrionarias se concentran hacia la zona
central del agregado mientras las células extraembrionarias se mantienen en la periferia. B’.
Núcleos (canal rojo) correspondientes a células de B. Se aprecia movimiento centrípeto de
núcleos embrionarios (flechas), mientras que núcleos extraembrionarios se mantienen en la
periferia. Disminución en el área central del agregado ocupada por nucleos embrionarios. C.
AIIIm tardío. Células embrionarias concentradas en zona central y rodeadas por una corona de
células extraembrionarias (corona indicada por llave). C’. Núcleos (canal rojo) correspondientes
a células de C. Concentración de núcleos en zona cetral con disminución en el área transversal
ocupada por estos. De A’ a C’, línea discontinua marca borde aproximado de área ocupada por
células embrionarias. Barra 100μm.
108
El AIIIm intermedio consta de varias capas de células. Como se describió
previamente, las células embrionarias son pequeñas (aproximadamente 15μm) y se
concentran en la región central del agregado. Rodeando ésta zona central existe un
tejido extraembrionario de células de mayor tamaño (aproximadamente 30μm). El
análisis dinámico de éste estadío, se focalizó en la zona central del agregado, a fin
de estudiar el movimiento de las células individuales.
En general el tejido es de aspecto epitelial con células poliédricas que no
muestran proyecciones de membrana evidentes, y cuyas membranas se encuentran
en estrecha aposición (Fig. 23A). El tamaño entre las células es heterogeneo
observándose dos poblaciones principales: células muy grandes (población 1,
asterisco en Fig. 23A), y células de tamaños comprendidos entre 14-25μm. Debido a
que en este estadío las células extraembrionarias deberían estar desplazándose a la
periferia, se presume que la mayoría de las células centrales son embrionarias. De
todos modos para el seguimiento de células individuales se intentó evitar las células
de mayor tamaño, centrando el estudio en las más pequeñas (células marcadas de
azul de Fig. 23A).
En el plano superficial (x-y), se pudo apreciar que existen células cuya
superficie disminuye paulatinamente a medida que la célula se profundiza, hasta que
desaparece. A medida que esto ocurre las células vecinas ocupan el espacio dejado
por la célula que se internaliza. A su vez se aprecia la aparición de células nuevas
en el plano, por emergencia desde posiciones más profundas del agregado (células
1 y 2 en Fig. 23B a E). Este evento se aprecia inicialmente como la aparición de
células circulares de pequeño diámetro, cuyo volumen va aumentando a medida que
desplazan a las células vecinas, hasta que finalmente se integran al tejido. En el
transcurso de la animación analizada (3 horas) se observaron 35 eventos de
internalización y emergencia de células, en total.
109
Internalización
A
B-E
2
F EVL
F-J
1
G
*
H
Intercalación
B
D
C
2
2
1
2
E
2
1
I
1
J
1
Figura 23.- Proceso de intercalación (B-E) e internalización (F-J) en estadío de AIIIm
A. Vista superior de AIIIm según un corte óptico en el plano x-y. En amarillo y con borde
delimitado con línea discontinua, se indica una célula en proceso de intercalación (seguimiento en
B-E). En azul y con borde delimitado con línea discontinua, se observan células pequeñas que se
están internalizando. La línea discontinua más gruesa indica lugar donde se realizó el corte óptico
en el eje z (F-J). Asterisco indica el núcleo de célula grande multinucleada (población 1). B-E.
Seguimiento en el plano x-y de célula en proceso de intercalación (en amarillo). 1 y 2 indican
células que están emergiendo desde planos más profundos, además son puntos de referencia
para ver desplazamiento de célula que se intercala. F-J. Vista según un corte transversal en el eje
z (indicado en A como línea discontinua), donde se realizó un seguimiento de células en proceso
de intercalación (amarilla) y de internalización (azul). Se aprecia como célula azul cambia de
forma, disminuyendo su contacto con la superficie (EVL, indicada con línea discontinua roja) hasta
que finalmente (J) se desprende de esta. La célula amarilla está en proceso de intercalación con
células vecinas. La célula se desplaza en el plano x-y, entre dos células vecinas, hasta que
desaparece del plano de corte (línea discontinua en I). Las barras en B y F representan 20μm.
110
Otro proceso que fue posible observar fue el desplazamiento de células a lo
largo del plano x-y y la intercalación entre células vecinas a una velocidad
aproximada de 0,6μm/min (Fig 23B a E).
Debido a que muchas de las células que se internalizan simultáneamente se
intercalan en el plano x-y, su seguimiento en el eje z no fue fácil, ya que a medida
que se intercalan desaparecen del plano de estudio (ver célula amarilla Fig. 23F a I).
Por ello del total de eventos de internalización detectados por el análisis en el plano
x-y (20 eventos), solo fue posible realizar el seguimiento en el eje z de seis. Para el
seguimiento de células individuales en el eje z, se intentó mantener en todo
momento el nucleo de la célula en foco.
Inicialmente, las células están en contacto con la superficie interna de la EVL.
Por lo tanto en el corte óptico se aprecia una zona de la membrana celular paralela y
en contacto con la superficie de la EVL (célula azul en Fig. 23F). A su vez las células
vecinas se aprecian en estrecho contacto unas con otras. A medida que el tiempo
transcurre se observa una deformación general de la célula que está en proceso de
internalización, la cual disminuye su superficie de contacto con la EVL. Por lo tanto
dicha célula, adquiere el aspecto de “célula en botella”, afinando su extremo superior
(hacia la EVL) y ensanchando el extremo contrario, en la dirección del movimiento.
Aproximadamente 15 minutos después, la célula se desprende de la superficie,
perdiendo contacto con la EVL y delaminándose como una célula individual hacia
una región más profunda del agregado (célula azul Fig. 23F a J). La continuidad el
epitelio no se pierde, ya que el lugar de la célula que se internaliza es
simultáneamente ocupado por células vecinas.
111
Discusión
La existencia de mecanismos de desarrollo divergentes en los peces anuales
del género Austrolebias, induce a buscar explicaciones causales en las presiones
selectivas a que ha estado sujeto este grupo animal durante su historia evolutiva.
Esto es particularmente evidente para la estrategia de diapausas, una adaptación de
clara utilidad en el ambiente natural de las especies de éste género. Sin embargo, el
desarrollo de Austrolebias no sólo esta sujeto a diapausas sino que existe una
manifiesta variación en la secuencia de eventos morfogenéticos que llevan a la
formación del eje embrionario, comparado con otros teleósteos. El análisis
descriptivo de los mecanismos de desarrollo en un rango diverso de especies de
peces teleósteos, ha mostrado una fuerte conservación en aspectos fundamentales
como la simultaneidad de la epibolia con la formación de un escudo embrionario,
producto de movimientos de involución y convergencia (Kimmel et al., 1989). Esta
conservación en especies pertenecientes a diversos órdenes ha llevado a establecer
estas características como "ancestrales" en los teleósteos. En Austrolebias, así
como en otros peces anuales, existe un desacoplamiento entre la epibolia y la
formación del eje embrionario, generándose una estrategia aparentemente disímil
para la obtención de un embrión somítico. Por lo tanto, la conclusión más obvia es
que Austrolebias posee características de desarrollo embrionario derivadas, y
probablemente recientes. Nuestra hipótesis inicial, que planteaba que el patrón de
gastrulación de Austrolebias se asemejaría a aquel presente en aves, resultó ser
incorrecta. Austrolebias parece gastrular como otros peces teleósteos, aunque
presenta diferencias mecanísticas y temporales en las etapas tempranas de la
gastrulación. Esto último podría ser producto de presiones selectivas, que actúarían
sobre la embriogénesis misma, más que sobre las características morfológicas,
fisiológicas o conductuales del individuo adulto.
112
1.- El blastoporo en Austrolebias: ¿sin surco y con anillo?
En esta tesis hemos centrado el estudio de la gastrulación en peces del
género Austrolebias, donde el embrión temprano se forma a partir de un grupo de
células agrupadas sobre una gran masa de vitelo, las cuales migran y se organizan
para formar las hojas y eje embrionario. Durante este trabajo el interés estuvo
centrado en entender si estos peces, cuyo patrón de desarrollo embrionario es
marcadamente diferente al de otros peces utilizan mecanismos morfogenéticos y
estrategias celulares propios del grupo filogenérico al que pertenecen a la hora de
internalizar el endomesodermo, formar el blastoporo y organizar su eje embrionario.
Se intentó contestar dos preguntas principales. Primero, ¿por dónde y cómo se
internalizan las primeras células endomesodérmicas en Austrolebias? En este
contexto, se estudio si el embrión de Austrolebias que por su morfología se parece a
un embrión temprano de pollo (de tipo discoidal) forma un blastoporo en forma de
línea/surco, o si más bien forma un anillo como consecuencia de su pertenencia
filogenética al grupo de los peces teleósteos. Segundo, se preguntó si existe y
donde se localiza el organizador de Spemann en Austrolebias.
Estas interrogantes fueron abordadas desde diversas aproximaciones. Para
responder la primera interrogante, se evaluó a través de cortes histológicos seriados
de los diversos estadíos de la gástrula, si morfológicamente era posible identificar
estructuras similares a un surco primitivo. Los resultados, demostraron la
inexistencia de un surco, al menos como aquel observado en el embrión de pollo.
Para responder a la segunda de las interrogantes, se examinó el perfil
temporal y espacial de expresión de dos genes característicos de poblaciones
celulares que se internalizan en la gástrula de los vertebrados. brachyury (bra) es un
gen marcador del mesodermo presuntivo, el cual se internaliza a través del
blastoporo. Analizar el patrón de expresión de este gen, tiene la doble virtud de
permitir evidenciar por un lado las células panmesodérmicas tempranas y por otro
revelar la morfología del blastoporo en el organismo en estudio. goosecoid (gsc) es
un marcador del organizador, que se expresa en las primeras células dorsales
axiales que se internalizan.
113
Mediante el estudio del patrón de expresión de bra y gsc durante el proceso
de agregación y formación del eje embrionario, se pudo constatar que:
1- bra inicia su expresión antes que gsc y lo hace en el estadío de AIIIm.
2- El patrón de expresión temprano de bra corresponde a una región circular al
centro del agregado.
3- La expresión de gsc se inicia en un grupo pequeño de células, en una zona
marginal a la marca de bra y con una región de solapamiento, marcando el
extremo anterior presuntivo del embrión.
4- En estadíos de AIV tardío y AV se observa una zona central de células que no
expresan bra, evidenciando posiblemente un patrón de expresión en anillo.
5- En estadíos tardíos ambos genes se expresan en dominios opuestos y
complementarios, marcando estructuras características comunes a otros
vertebrados: notocorda posterior (bra) y placa precordal (gsc).
Estos resultados sugieren que una vez comenzado el proceso de gastrulación
en Austrolebias, se forma un blastoporo por donde ocurre la internalización del
endomesodermo y en el cuál las células panmesodérmicas expresan bra. A su vez la
expresión subsecuente de gsc señala la formación del organizador, cuyas células se
solapan inicialmente con las células mesodérmicas que expresan bra. Además, la
expresión inicial de gsc evidencia por primera vez el eje antero-posterior (A-P), ya
que se expresa en la futura región anterior del embrión. En estadíos más tardíos la
existencia de células centrales a la marca de bra que no expresan dicho gen,
sugiere que existiría una estructura en forma de anillo por donde ocurriría la
internalización de las células endomesodérmicas, región que sería homóloga al
blastoporo del embrión típico de peces teleósteos. Posteriormente las células,
presumiblemente internalizadas y que expresan gsc, se desplazan hacia la región
contraria (anterior) a aquellas que expresan bra (posterior). Dada la función
ampliamente conservada de estos dos genes en la evolución (Schulte-Merker, et al.,
1994, Gont et al., 1993, Herrmann, 1990), podemos concluir que ellos marcarán los
114
precursores de estructuras características como la placa precordal (gsc) y la
notocorda posterior (bra).
El análisis de estos resultados pone de manifiesto ciertas diferencias con lo
descrito para otros teleósteos. Debido a que tardíamente se aprecia un blastoporo
que se asemeja a un anillo, la observación inicial de la expresión de bra formando un
círculo, podría deberse a las características propias del agregado. El estadío AIIIm
corresponde a un agregado celular compacto, donde las celulas centrales están
formando múltiples capas a distintos niveles del eje z. Es posible que las células
mesodérmicas que expresan bra se estén internalizando por el márgen de un anillo,
de manera análoga a lo que ocurre en pez cebra en las etapas intermedias de la
epibolia (Warga & Kimmel, 1990). Una posibilidad de que el las etapas tempranas no
se aprecie la formación de un anillo podría ser debido a lo reducido del espacio en el
cual este proceso tiene lugar en Austrolebias. Esto explicaría el porque es posible
apreciar la región central libre de expresión de bra, sólo una vez que el agregado
crece y se expande (estadío AV). Por lo tanto, es posible que la internalización del
endomesodermo en Austrolebias ocurra a través de un anillo, de manera análoga a
cómo ocurre en pez cebra, por ejemplo. A futuro, la realización de cortes traversales
de embriones tempranos hibridados para bra, posiblemente dará luces respecto a
este punto.
Estas observaciones nos llevan a concluir que la diferencia entre la
gastrulación de Austrolebias y la de otros peces teleósteos no sería el modo de
internalizar el endomesodermo (en relación a la morfología del blastoporo), sino más
bien el hecho de que este proceso esté desacoplado con el proceso de la epibolia.
El embrión de pez cebra durante el proceso de epibolia presenta una alta densidad
de células, y a medida que este proceso transcurre, el blastodermo se aprecia como
una capa celular compacta migrando hacia el polo vegetal (Warga & Kimmel, 1990).
Cuando comienza la internalización del endomesodermo por todo el borde del
blastodermo, el blastoporo consiste en un anillo en torno a una gran masa de vitelo.
El huevo de Austrolebias mide aproximadamente 1mm de diámetro (pez cebra
aproximadamente 0,7mm), sin embargo tiene alrededor de 10 veces menor cantidad
de celulas que el pez cebra, al inicio de la epibolia (Wourms, 1972b). Por lo tanto el
115
embrión de Austrolebias cubrirá una superficie similar con un número muy reducido
de células. Si además consideramos que la epibolia está desacoplada con la
gastrulación, es evidente que al final de la epibolia el embrión consistirá en células
dispersas por todo el huevo. Por lo tanto para que la gastrulación pueda tener lugar,
será necesaria la agrupación y organización de dichas células. Una vez que el
agregado se formá probablemente la internalización del endomesodermo ocurra a
través de un anillo pero ahora (sin el vitelo en medio) el aspecto del embrión es muy
diferente. Este proceso único de agregación celular, previo al inicio de la
gastrulación, genera una arquitectura celular nueva, la cual obligaría a una
adaptación de los procesos inductivos a dicha morfología (a través del YSL, tejido
extraembrionario, etc.).
Este desacoplamiento también podría estar influenciando la velocidad a la
cuál ocurre el proceso de internalización y migración de las células embrionarias. En
pez cebra el acoplamiento de la gastrulación con la epibolia, favorecería el proceso
de gastrulación, y la extensión del eje embrionario a lo largo del eje A-P o animalvegetal. De esta forma la falta de dicho acoplamiento podría explicar en parte, la
lentitud del proceso de gastrulación y extensión del eje embrionario en Austrolebias.
2.- Tejido extraembrionario posterior: ¿posible función instructiva de la
formación del embrión?
El agregado celular corresponde a un grupo de células que se congrega en
una región del embrión de peces del género Austrolebias a partir del cual, y luego de
un proceso de aproximadamente cinco días, se forma el eje embrionario. mediante
estudios preliminares se pudo identificar que el agregado se forma posiblemente en
el hemisferio vegetal del huevo, posteriormente a la culminación del proceso de
epibolia.
El agregado celular temprano (estadíos AI y AII) está formado por un grupo de
células ajenas al embrión propiamente tal (extraembrionarias). Estas células son las
primeras que se agregan y van siendo desplazadas del centro del agregado por las
células embrionarias a medida que avanza el desarrollo. Eventualmente, las células
116
iniciales del agregado se desplazan hacia la periferia y posteriormente se localizan
en la región caudal del embrión.
En el embrión de pollo es conocida la formación temprana de varios tejidos de
destino extraembrionario. Por ejemplo, se ha descrito que el hipoblasto primario
juega un papel central como antagonista de la formación de ejes múltiples; ya que su
remoción induce la formación de líneas primitivas ectópicas (Bertocchini & Stern,
2002). El hipoblasto es uno de los tejidos que se forma más tempranamente en el
embrión de pollo y expresa Cerberus el cual inhibe a Nodal, expresado por el
epiblasto. La línea primitiva solo se puede formar una vez que el hipoblasto ha sido
desplazado por otro tejido extraembrionario, el endoblasto, el cual no expresa
Cerberus. Por lo tanto este mecanismo controla tanto el momento, como la posición
en que se forma la línea primitiva (Bertocchini & Stern, 2002). Además se ha visto
que el hipoblasto expresa gsc una vez que está formado y durante todo el transcurso
de su desplazamiento hacia anterior (Bachvarova et al., 1998).
La influencia más temprana en la inducción de la línea primitiva esta dada por
la zona marginal posterior (PMZ) este corresponde a un tejido extraembrionario, que
se concentra en la región posterior del embrión de pollo (Bachvarova et al., 1998).
En esta zona se ha visto que la actividad de Vg1 y Wnt se solapan, induciendo la
expresión de Nodal en el área vecina del epiblasto. Nodal únicamente puede actuar
(presumiblemente induciendo la formación del endomesodermo) una vez que el
hipoblasto a sido desplazado por el endoblasto (Skromne & Stern, 2001). Se
propone que la PMZ podría actuar como un análogo al centro de Nieuwkoop de
anfibios, induciendo un eje completo, incluído el organizador, pero sin realizar una
contribución celular directa (Bachvarova et al., 1998).
En el caso del pez cebra los determinantes dorsales están localizados en la
zona vegetal de la capa sincicial del vitelo (YSL). En la formación correcta del eje
embrionario, el YSL tiene dos funciones fundamentales: (1) la translocación de los
determinantes dorsales, que originalmente están en la zona vegetal, a las
blastómeras dorsales, generando una actividad dorsalizante tanto del YSL dorsal,
como del margen dorsal del blastodermo que está por encima (Jesuthasan &
Strahle, 1997) y (2) la generación de la señal requerida para la inducción de genes
117
que se expresan en el margen lateral y ventral del blastodermo (Schneider, et al.,
1996). Aún no se conocen los determinantes dorsales localizados en el polo vegetal,
ni los factores liberados por el YSL. Sin embargo se sabe que su función estaría
mediada, al menos en parte, por señales de β-catenina y Nodal (Schier, 2004). El
patrón dorso-ventral dentro de la gástrula depende del establecimiento de centros
señalizadores mutuamente antagónicos que involucran la liberación de moléculas
como Chordin y Noggin, las cuales se expresan dorsalmente en el organizador, y
moléculas de BMP (de la superfamilia TGF-β) las cuales se expresan en la región
ventral (Schneider, et al., 1996). Esto lleva a la formación de un gradiente dorsoventral de BMP el cual establece el patrón dorso-ventral del mesodermo y
neuroectodermo (Köpper & Heisenberg, 2005).
En Austrolebias las primeras células en agregarse formarán entonces un
tejido extraembrionario de destino desconocido. La existencia de este tejido
extraembrionario, podría estar jugando un rol inductivo e instructivo, en relación al
momento y lugar en el cual debe ocurrir la formación del embrión. En el pez cebra, el
tejido extraembrionario temprano involucrado en el establecimiento de patrones es el
YSL (Jesuthasan & Strahle, 1997). Este sincicio es el encargado de transmitir
señales (luego de la acumulación de β-catenina en la región dorsal – centro de
Nieuwkoop) que permiten el estableciemiento del eje dorso-ventral del embrión. El
hecho de que la agregación celular en Austrolebias ocurra en un punto determinado
en el polo vegetal del huevo, probablemente esté también determinado
tempranamente por factores presentes en el YSL. Las células tempranas del
agregado podrían en ese contexto, servir de nexo, permitindo que las señales
inductoras del YSL sean transmitidas o propagadas a las futuras células
embrionarias.
Es posible que, en Austrolebias, el establecimiento de los ejes anteroposterior y dorso-ventral requieran de la combinatoria de señales tempranas,
provenientes tanto del YSL, para el establecimiento del sitio de agregación y de las
células extraembrionarias que se agregan tempranamente. Si el mecanismo por el
cual actúa el tejido extraembrionario en Austrolebias fuera similar al que se conoce
en pollo, existen al menos dos posibles funciones:
118
(1) inhibir la formación del embrión tempranamente, para lo cual sería necesario
su desplazamiento hacia la periferia primero, y finalmente hacia la región
posterior, para que el embrión se forme,
(2) dar identidad a la región posterior del embrión, a partir de la cual, el embrión
crecerá en dirección posterior-anterior (ver más abajo).
En el caso 1, el tejido extraembrionario estaría actúando de modo similar al
hipoblasto primario en pollo. Por lo tanto su función sería la de controlar tanto el
momento como la posición en la formación del embrión, ya que inhibiría la formación
de éste y por lo tanto sería necesario su desplazamiento para que este proceso se
revirtiera.
Sin
embargo
existen
dos
diferencias
principales
con
el
tejido
extraembrionario en Austrolebias: (1) el hipoblasto se concentra en la región anterior
del embrión y (2) expresa gsc durante todo el proceso.
En el caso 2, el tejido extraembrionario estaría cumpliendo una función similar
a la PMZ (zona marginal posterior). Este tejido está tempranamente concentrado en
la región posterior del embrión de pollo y actúa como un análogo al centro de
Nieuwkoop de anfibios, induciendo un eje completo, incluído el organizador, pero sin
realizar una contribución celular directa. En apoyo a esta última posibilidad, podemos
considerar una observación fortuita que se realizó a partir de los experimentos de
destino celular con Kaede.
En estos experimentos la fotoactivación de las blastómeras profundas (BP)
además fué acompañada de la fotoactivación de las celulas de la capa celular
envolvente (EVL), localizadas sobre el agregado. Estas células resultaron ser un
buen punto de referencia dentro del embrión, ya que durante la agregación no existe
un desplazamiento real de ellas sino más bien un cambio de morfología. Una
observación recurrente fue que las células de la EVL fotoactivadas siempre
coincidían con la región caudal de embriones tardíos. Ya que es poco probable que
el embrión logre desplazar a estas enormes células a medida que crece su región
caudal, la explicación más plausible de este fenómeno, es que el agregado crece
únicamente en dirección cefálica, manteniéndose la región caudal fija durante todo el
proceso.
119
En el pez cebra los procesos de epibolia y gastrulación están acoplados. Por
lo tanto, a medida que se forma el eje embrionario se aprecia un desplazamiento de
todo el embrión hacia el polo vegetal. Sin embargo al analizar el proceso de
gastrulación propiamente tal, las células endomesodérmicas se internalizan y
migran, primero convergiendo hacia dorsal, y luego hacia el polo animal,
organizando los distintos tejidos que formarán el eje embrionario. Por lo tanto
también en pez cebra el proceso de formación del eje, luego de la internalización del
endomesodermo, es en dirección caudal-cefálica (o vegetal-animal), con la
diferencia de que el proceso de epibolia genera un desplazamiento neto de todo el
embrión hacia el polo vegetal.
Por lo tanto si el tejido extraembrionario en Austrolebias cumple la función de
indicar o delimitar la región presuntiva posterior del embrión, es posible que a partir
de esa zona se forme el embrión en dirección caudal-cefálica. A diferencia del pez
cebra en Austrolebias este proceso ocurriría independientemente al de epibolia, no
apreciándose un desplazamiento del embrión hacia el polo vegetal.
El estudio de cortes semifinos reveló la presencia de una estructura esferoidal
en el extremo posterior del embrión, la cual expresa bra en estadíos de eje. Esto es
semejante a lo observado en pez cebra en el mismo estadío, y podría corresponder
al organizador de la cola o “tailbud” en la cual continúan internalizándose células
tardíamente, vinculado al desarrollo de estructura caudales del embrión de pez cebra
(Kanki & Ho, 1997).
Otra observación a partir de los experimentos de Kaede, fue que el grupo de
células extraembrionarias del agregado temprano, se deplazan hacia regiones
mediales del embrión somítico, concentrándose como dos estructuras bilaterales al
eje embrionario. Al analizar que ocurre con las células de la EVL que fueron
fotoactivadas en forma concomitante, se observó que ellas continúan sobre el tejido
extraembrionario, pero ahora en la región medial del embrión. Esto sugiere que en
estadíos tardíos el embrión comenzaría a extenderse en la dirección cefálica-caudal,
al igual que en pez cebra, a expensas del organizador de la cola.
En el contexto de lo discutido anteriormente, sería muy útil contar con un
análisis temprano (final de epibolia, estadíos AI y AII) de la expresión de genes
120
conocidos como marcadores del PMZ de pollo y que cumplen funciones homólogas
al centro de Nieuwkoop. Por ejemplo se podría analizar la expresión de wnts (wnt8c
o wnt11) o también analizar si β-catenina se concentra tempranamente en alguna
región del huevo, marcando lo que será la futura región dorsal del embrión. Además
y con la finalidad de entender la función que cumple este tejido, sería interesante
transplantar células del tejido extraembrionario en la zona contraria a la formación
del agregado temprano. Mediante esta aproximación sería posible analizar si este
tejido es capaz de inducir la formación de un eje secundario en Austrolebias. A su
vez la remoción total de estas células, aportaría información en el mismo sentido.
121
3.- ¿Cómo se forma un embrión a partir de un grupo de células?
Si bien dentro de los objetivos de esta tesis no estaba incluido el análisis
celular del proceso de iniciación de la agregación, los datos obtenidos a partir de las
observaciones en tiempo extendido, permiten hacer algunos aportes al respecto. La
información preliminar con la que se contaba al inicio de este trabajo daba cuenta de
que el embrión de Austrolebias deriva de un conjunto de células agrupadas en una
región del huevo. A partir de esta observación, surge un número de interrogantes: (a)
la zona de agregación celular ¿corresponde a un lugar definido dentro del huevo o
es aleatoria?, (b) ¿cómo se comunican entre sí las células migratorias aisladas a fin
de establecer un tejido?, (c) ¿todas las células dispersas formarán parte del
embrión?, (d) ¿existe algun tipo de internalización celular previo al proceso de
agregación (durante la epibolia, como ocurre en otros peces)?. Se discuten a
continuación algunas ideas en relación a estas preguntas, ya que los experimentos
específicos para contestarlas, son tareas pendientes para el futuro.
Durante el proceso de agregación celular el embrión de Austrolebias pasa de
estar formado por células mesenquimáticas dispersas por toda la superficie del
huevo, a formar un tejido epitelializado, a partir del cual comenzará la internalización
del endomesodermo. Al inicio de este proceso el embrión consta de poblaciones
celulares diversas, las cuales presentan una amplia gama de comportamientos
celulares, desde células migratorias rápidas a células grandes estáticas y
multinucleadas. A partir de dichas poblaciones se formará un embrión con un plan
corporal común a los demás peces teleósteos.
Uno de los primeros tópicos a analizar es, como a partir de células dispersas y
alejadas se forma un tejido epitelial. Las observaciones realizadas muestran que
inicialmente solo un reducido grupo de células migran en la dirección de la zona de
agregación, la cual aparentemente coincide con el hemisferio vegetal. Estas son
células de aspecto mesenquimático, las cuales a medida que migran, emiten una red
de filopodios, mediante los que se contactan entre sí y con la superficie interna de la
EVL. Por lo tanto dichas células serían las primeras en alcanzar la zona de
agregación en el polo vegetal. Posteriormente y a medida que su número aumenta,
122
estas células dejan de emitir filopodios, adquieren aspecto epitelial de tipo poliédrico
y se asocian formando estructuras supracelulares, agrupadas en forma de roseta.
Existen varios ejemplos de migración de células de tipo mesenquimático que,
luego de hacer contacto, establecen un tejido epitelializado. Se ha descrito una
maquinaria de adhesión celular basada en filopodios (protrusiones de actina), tanto
en el cierre ventral al final del proceso de epibolia en C. elegans (Williams-Masson et
al., 1997) como en el cierre dorsal de Drosophila (Jacinto, et al., 2000) o en la
reparación de un tejido (wound healing, Vasioukhin, et al., 2000). En este último
caso se ha visto que la inhibición de la protrusión de filopodios, mediante
dominantes negativos de Cdc42, altera la fusión epitelial (Vasioukhin, et al., 2000).
Los filopodios también estarían involucrados en el reconocimiento de células
apropiadas para interaccionar, por lo tanto serían análogos a los “filopodios
sensoriales” de los conos de crecimieno axonal, los cuales son capaces de buscar
las células blanco correctas en el sistema nervioso en desarrollo (Jacinto, et al.,
2001).
Debido a la diversidad de poblaciones celulares observadas en Austrolebias,
es probable que exista algún mecanismo que permita el reconocimiento entre células
homólogas. A partir de los experimentos de destino celular, pudimos comprobar que
estas primeras células que se agregan formarán un tejido que denominamos
extraembrionario, dado que no forma parte del embrión, al menos en el período
analizado, durante el período de la agregación celular y hasta la somitogénesis
temprana. Sin embargo el término “extraembrionario” podría no ser estrictamente
correcto, debido a que no se analizó el destino de este tejido hasta el final de la
embriogénesis.
Luego del contacto inicial entre las células del agregado, comienza un
proceso de epitelialización del tejido, lo que implica una transición del tipo
mesenquima-epitelial en las células que conforman el agregado. Esto convella un
aumento en los contactos y probablemente también en las uniones célula-célula.
Progresivamente se observa la formación de estructuras supra-celulares en diversas
partes del agregado, las que luego convergen formando un tejido monoestratificado
de tipo epitelial, donde se aprecia la formación de estructuras tipo roseta.
123
La organización multicelular puede ser vista como la suma de eventos
celulares individuales o como un fenómeno único del tejido todo. Las células
individuales comunmente coordinan su comportamiento dentro de una estructura
multicelular cohesiva. Podría considerarse que las unidades funcionales de los
tejidos son en realidad grupos de células, donde cada célula censa su posición con
respecto al grupo y adopta un comportamiento de acuerdo a dicha posición
(Blankenship, et al., 2006). Estudios recientes han mostrado la formación de
estructuras de tipo roseta en diferentes procesos morfogenéticos. Dos ejemplos de
esto son la extensión de la banda germinal de Drosophila (Blankenship, et al., 2006)
y la migración del primordio en la línea lateral de pez cebra (Lecaudey et al., 2008).
El mecanismo por el cual se forma una roseta, es un tema que está en
discusión. Uno de los modelos propuestos es el que corresponde a las rosetas que
se forman en el primordio de la línea lateral del pez cebra. Existiría un sistema del
tipo inhibición lateral mediado por Fgf, que induce la epitelialización radial de las
células que rodean a una central, generando una polaridad apico-basal y formando
uniones estrechas (“tight”) entre dichas células. Debido a que la célula central sería
refractaria a la inhibición lateral, mantendría su estado de tipo mesenquimático. Esto
resultaría en un anillo de células epiteliales en torno a una célula central aplanada
(Lecaudey et al., 2008). Otra posibilidad es que el tejido realice constricción apical
coordinada de un grupo de sus células en el momento en que se pierde su
integridad, algo similar a lo que ocurre en los procesos de cierre de una herida
(Lecaudey et al., 2008, Jacinto et al., 2001).
Independientemente de cual sea su mecanismo de formación, sería
interesante entender que papel juegan las rosetas en el tejido en formación.
Se propone para el pez cebra que las rosetas en el primordio de la línea
lateral en migración, convertirían un gran número de células migratorias de tipo
mesenquimático en dos o tres paquetes celulares que pudieran ser controlados
como unidades individuales, reduciendo así la complejidad del sistema (Lecaudey et
al., 2008). Esta hipótesis parece plausible también para el caso de las primeras
celulas que se agregan en Austrolebias, ya que la organización en rosetas del tejido,
podría permitir la simplificación en la generación de un tejido epitelial a futuro. Las
124
unidades funcionales (rosetas) podrían organizarse primero independientemente
unas de otras, para luego contactárse paulatinamente, generando un tejido de tipo
epitelial. Este primer tejido en el caso de Austrolebias tendría un destino
extraembrionario (al menos durante el período analizado) y una función
posiblemente instructiva.
La formación del embrión propiamente tal es posterior a estos eventos, ya que
sus células comienzan a observarse en las inmediaciones del agregado, una vez
que el tejido extraembrionario esta formando. Mediante los experimentos de destino
celular fue posible concluir que la formación del embrión comienza a partir del
estadío AIIIi. Debido a limitaciones técnicas no fue posible hacer un seguimiento de
células individuales, a fin de entender si las células embrionarias se agregan
tardíamente o si por el contrario derivan de algunas de las células agregadas
inicialmente. Lo que se pudo constatar, eso sí, es que una vez identificadas las
células embrionarias por su menor tamaño, estas inicialmente se intercalan con las
células extraembrionarias, excepto en aquellos lugares donde estas últimas estan
formando agregados epitelializados. Posteriormente existe un desplazamiento
coordinado y acumulación de las células embrionarias hacia el centro del agregado.
Este movimiento es acompañado por un desplazamiento hacia la periferia del tejido
extraembrionario.
A través del análisis por microscopía en tiempo extendido realizado durante
un subperíodo del estadio AIIIm, se pudo apreciar que células centrales al agregado
se
internalizaban
como
células
individuales
experimentando
un
cambio
estereotipado de su forma al desprenderse de la superficie para ocupar posiciones
más profundas dentro del agregado. Este modo de internalizacion recuerda al
mecanismo de ingreso
(“ingression”) de células individuales que ocurre en el
mesenquima primario de erizo, donde las primeras células que se internalizan lo
hacen en la región vegetal de la blástula, sufriendo una transición epiteliomesenquima (Katow & Solursh, 1981). También en Fundulus el ingreso de células
individuales es un mecanismo descrito durante la gastrulación temprana (Trinkaus,
1996). Más aún, el concepto de la involución de células a través del margen del
anillo germinal en pez cebra correspondería al ingreso coordinado de células
125
individuales. Así mismo se ha descrito la delaminación de células individuales,
precursoras del endomesodermo, a través del margen del blastodermo en la región
dorsal/axial del embrión de Danio (Montero et al., 2005). Si bien es probable que la
internalización del endomesodermo en Austrolebias involucre un mecanismo de
migración de células individuales, sería útil en el futuro poder unificar la
nomenclatura y describir estos procesos mediante abordajes que impliquen tanto el
análisis detallado de polaridad celular como de marcadores de diferenciación, a fin
de poder comparar procesos entre los diversos organismos con datos más precisos.
Al inicio de esta tesis se postuló que las primeras células que se agregan en
Austrolebias corresponderían a las células embrionarias que formarían parte del
organizador. Por lo tanto el análisis detallado del desarrollo se centró en el período
inicial de agregación (AI – AIII). Sin embargo, a partir de los resultados obtenidos, se
ha llegado a la conclusión que el embrión comienza a formarse recién a partir del
AIIIi. Por lo tanto para analizar el proceso de internalización del endomesodermo y la
formación de estructuras derivadas, será necesario a futuro centrar el estudio a partir
de estadíos más tardíos (AIIIm).
4.- Resumen de los resultados obtenidos
En esta tesis, se describe por primera vez el desarrollo temprano de un pez
anual usando una combinación de técnicas de expresión génica, marcación celular,
microscopía y análisis de imágenes en tiempo extendido. Se estableció que en este
organismo el proceso de gastrulación ocurre de manera diferente comparado con
otros teleósteos, pero que es posible reconocer un paralelo en las estrategias
morfogenéticas utilizadas para la formación del embrión temprano.
Los hallazgos específicos de esta tesis son:
1- La gastrulación en Austrolebias ocurre durante el proceso de agregación
celular.
126
2- Las etapas iniciales de agregación (estadíos AI y AII) corresponden a la
formación de un tejido extraembrionario, el cual posteriormente se concentra
en el futuro extremo posterior del embrión.
3- La internalización del endomesodermo se inicia en el estadío AIIIm y podría
ocurrir a través de la formación de un blastoporo en forma de anillo.
4- En Austrolebias se forma un organizador en el estadío AIIIt.
5- El proceso de formación de las hojas embrionarias a nivel molecular parece
estar conservado.
Existiría un proceso de internalización temprano a través de células individuales
que se desprenden de la superficie con morfología similar a “células en
botella”.
127
Conclusión
Austrolebias posee una embriogénesis relacionada con la del resto de los
teleósteos. Este hecho permite especular que las diferencias observadas en la
organización de las células durante la formación del eje embrionario obedecerían al
menos a dos factores principales: (i) el desfase temporal entre los movimientos
morfogenéticos de la epibolia y gastrulación; y (ii) la baja densidad celular del
embrión temprano. El resultado final sería la adquisición de una morfología
embrionaria particular previo al inicio de la gastrulación, el agregado celular.
La información obtenida de este estudio permite especular acerca de como la
adaptación de un organismo a su hábitat puede generar cambios importantes en el
desarrollo embrionario, sin afectar fundamentalmente la morfología adulta. Esto
sugiere que, el desarrollo embrionario presenta etapas permisivas al cambio y que
pueden estar sujetas a presión selectiva.
Se propone entonces, que los teleósteos dispondrían de algunas etapas o
procesos "obligatorios", como son el clivaje meroblástico, la epibolia, la
internalización para formar las hojas embrionarias, la formación de un anillo
endomesodérmico y la formación de un organizador. Otras características del
desarrollo, sin embargo, serían modificables, como por ejemplo, el número de
células que sufren epibolia, el acoplamiento de la internalización con la epibolia, y la
migración celular en forma coordinada como hoja epitelial. Entendemos entonces,
que estaríamos frente a un ejemplo en que las adaptación de la especie a una
condición de vida particular, generó una modificación en la velocidad y continuidad
del desarrollo (diapausas) que se acompañó con un cambio de estrategia para la
formación del eje embrionario. No es posible saber si una necesariamente conlleva a
la otra o si pueden surgir independientemente. Responder esta pregunta requerirá
mayor indagación experimental y comparada entre especies.
128
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135
Apéndice
Protocolo de doble hibridación in situ (modificado de: Gamse et al., 2002).
Día 1.- A partir de embriones fijados toda la noche en paraformaldehído 4% y
guardados a -20˚C en metanol (MetOH), en tubos de 2ml,
1- Rehidratación 5min. (cada uno)
75% MetOH/25%PBT
50% MetOH/50%PBT
25% MetOH/75%PBT
2- 4X 5min. PBT
3- Prehibridación 2-3hs a 70˚C en tampón de hibridación (Hyb+, Formamida
50%, 5X SCC, 0,1% Tween 20, 5mg/ml ARN Tórula (Sigma), 50µg/ml
Heparina).
4- Hibridación con una o ambas sondas juntas (Dig. y Fluo.) diluídas en tampón
de hibridación. Se diluyeron 6µl sonda Dig. (gsc) + 9µl sonda Fluo. (bra) en
300µl de tampón de hibridación por embrión, se incubó a 70˚C toda la noche.
Día 2.5- Lavados a 70˚C (precalentar las soluciones)
2X 30min. Hyb (-) (Formamida 50%, 5X SCC, 0,1% Tween 20)
1X 15min. 75% Hyb(-)/25% 2XSSC
1X 15min. 50% Hyb(-)/50% 2XSSC
1X 15min. 25% Hyb(-)/75% 2XSSC
1X 15min. 2XSSC
3X 30min. 0,2XSSC
6- Lavados a temperatura ambiente
1X 5min. 75% 0,2XSSC/25% PBT
1X 5min. 50% 0,2XSSC/50% PBT
1X 5min. 25% 0,2XSSC/75% PBT
1X 5min. PBT
7- Bloqueo en BR (Blocking Reagent, Roche) al 2% en MAB 1X al menos 1h.
136
8- Incubar en Anticuerpo anti-DIG-AP (Roche) diluído 1:2000 en BR 2%/MAB 1X
toda la noche a 4˚C.
Día 3.9- Lavados a temperatura ambiente
1. Enjuague en PBT
2. 8X 15min. PBT
3. 3X 5min. BCL
10- Pasar los embriones a placa de 24 pocillos y agregar 500µl BM-Purple
(Roche) en oscuridad. Incubar hasta que el color de la marca esperada sea
suficiente. Para gsc aproximadamente 14hs. Para parar la reacción
reemplazar BMP por BCL (para 100ml 1X, 5ml TrisHCl pH 9,5 1M, 2ml NaCl
5M, 5ml MgCl2 1M, 1ml Tween 20 10%).
Día 4.11- Lavados 2X 20min en 1X MABT pH 7,5 (NaCl 150mM, Acido Maleico
100mM, Tween 0,1%)
12- 1X MABT + 10mM EDTA 10min. a 70˚C (precalentar solución)
13- Rehidratar: 10min MetOH 100%
10min. 75% MetOH/25% MABT
10min. 50% MetOH/50% MABT
10min. 25% MetOH /75% MABT
14- Lavado 4X 10min. en MABT
15- Bloqueo 1 - 4hs en BR (Blocking Reagent, Roche) al 2% en MAB 1X.
16- Incubar en anticuerpo anti-Fluo-AP (Roche) diluído 1:2000 en BR 2% / MAB
1X toda la noche a 4˚C.
Día 5.17- Lavados:
enjuague en MABT
6X 15min. MABT
3X 5min. BCL
18- Revelado en placa de pocillos con 500µl por pocillo BCL + INT/BCIP (Roche)
7,5µl/ml, hasta obtener marca deseada. Para bra aproximadamente 8hs.
Detener reacción con BCL. Postfijación en PFA 4% toda la noche.
137
Protocolo de inclusión en Epon 812
1- Fijación durante 3hs en solución de Karnovsky 50%
2- Descorionado manual, inclusión en bloque de agarosa al 2% y corte con
vibratomo en polo vegetal (método utilizado para orientar los embriones al
momento de realizar los cortes semifinos)
3- 4 lavados de 10 minutos cada uno en buffer cacodilato 0,1M
4- Postfijación en OsO4 1% durante 1h 30min., a tempertura ambiente y
oscuridad
5- Lavado de 10 minutos en buffer cacodilato 0,1M
6- Deshidratación:
Etanol 30%
5min.
50%
5min.
70%
5min.
80%
8min.
90%
8min.
95%
8min.
100% x3
10min. (cada uno)
7- Pre-inclusión: Oxido de propileno x 2 10min. (cada uno)
Oxido de propileno – Epon 812 (1:1v/v) 12hs al vacío
8- Inclusión:
Epon 812 puro x2 durante 5h al vacío
Hacer bloques, orientar y catalizar por 24hs a 60°C
138