UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO DE HMG-CoA REDUCTASA EN LA RESPUESTA HIPOCOLESTEROLEMICA DIFERENCIAL A ESTATINAS EN PACIENTES CON CARDIOPATÍA CORONARIA Tesis entregada a la Universidad de Chile para optar al grado de DOCTOR EN FARMACOLOGIA Por VIVIANA CAROLINA NORIEGA SEPULVEDA Directores de Tesis Prof. Dr. Juan Carlos Prieto D. Prof. Dr. Sergio Lavandero G. Santiago Chile 2008 FINANCIAMIENTO Esta tesis se realizó a través de una alianza estratégica entre el Programa de Farmacología Molecular & Clínica, ICBM de la Facultad de Medicina y la Unidad de Farmacogenómica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile. El desarrollo de esta tesis se financió por los siguientes proyectos: Beca Sociedad Medica de Chile “Diferencias en la repuesta hipocolesterolémica por estatinas dependiente del polimorfismo de HMG-CoA reductasa en pacientes chilenos con Cardiopatía Coronaria” otorgada a Viviana Noriega y patrocinada por el Dr. Juan Carlos Prieto y financiada por Laboratorios Saval S.A FONDAP 15010006 al Dr. Sergio Lavandero Publicaciones Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Diferencias genéticas en la disminución del colesterol por estatinas en pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. Rev. Chil Cardiol 2007; 26: 135-143 Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Influence of the HMG-Coa Reductase (TTA)n repeat gene polymorphism on the effects of atorvastatin in coronary artery disease patients (enviada a publicación). II Presentaciones a congresos Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Ausencia de asociación entre el polimorfismo (TTA)n en el gen de la enzima HMG-CoA reductasa y la reducción de los lípidos plasmáticos con atorvastatina en pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. XLIV Congreso Chileno de Cardiología y Cirugía Cardiovascular de Chile, Viña del Mar, 2007, Chile. Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Ausencia de asociación entre el polimorfismo (TTA)n en el gen de la enzima HMG-CoA reductasa y la reducción de los lípidos plasmáticos con atorvastatina en pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. XXIX Congreso Sociedad de Farmacología de Chile; Iquique, 2007, Chile. Noriega V, Pennanen C, Jimenez G, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Diferencias genéticas en la disminución del colesterol por estatinas en pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. XLIII Congreso Chileno de Cardiología y Cirugía Cardiovascular de Chile, Viña del Mar, 2006, Chile. Noriega V, Pennanen C, Llancaqueo M, Lavandero S, Prieto JC. Diferencias genéticas en la respuesta hipocolesterolémica por estatinas en pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. XXVIII Congreso Sociedad de Farmacología de Chile; Olmue, 2006, Chile. III INDICE TEMA PÁGINA INDICE DE FIGURAS ................................................................................................ VII INDICE DE TABLAS .................................................................................................. VIII INDICE DE ANEXOS ................................................................................................... IX ABREVIATURAS .......................................................................................................... X RESUMEN .................................................................................................................. XII ABSTRACT ................................................................................................................ XIV 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1 1.1 Cardiopatia coronaria ...................................................................................... 1 1.2. Aterosclerosis .................................................................................................. 1 1.2.1. Colesterol en la aterosclerosis......................................................................... 4 1.2.2. Inflamación en la aterosclerosis ...................................................................... 5 1.2.3. Proteína C reactiva .......................................................................................... 5 1.3. Tratamiento farmacológico de la cardiopatia coronaria ................................... 7 1.3.1. Estatinas .......................................................................................................... 7 1.3.2. Mecanismos moleculares de acción de las estatinas ..................................... 7 1.3.2.1 Estatinas e isoprenilación de proteinas .......................................................... 8 1.3.2.2 Estatinas y factores nucleares ......................................................................... 9 1.3.3. Eficacia de la terapia farmacológica con estatinas en prevención secundaria de la cardiopatia coronaria .......................................................... 10 1.3.4. Estatinas en la reducción del cLDL, inflamación y estrés oxidativo .............. 11 1.4. Farmacogenómica del tratamiento con estatinas .......................................... 13 1.4.1. Polimorfismo en el gen de la HMG-CoA reductasa (HMGCR) ...................... 14 2. HIPÓTESIS.................................................................................................... 17 3. OBJETIVOS .................................................................................................. 17 3.1. Objetivo general............................................................................................. 17 3.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 17 4. METODOLOGÍA............................................................................................ 18 4.1. Diseño del Estudio ......................................................................................... 18 4.2. Presentación y aprobación por Comité de Etica ............................................ 18 IV 4.3. Incorporación de los pacientes con cardiopatía coronaria al estudio ............ 19 4.4. Determinación del tamaño de muestra ......................................................... 19 4.5. Pacientes ....................................................................................................... 19 4.6. Enrolamiento de pacientes ............................................................................ 20 4.7. Recolección de muestras ............................................................................. 20 4.8. Exámenes de laboratorio ............................................................................... 21 4.9. Aislamiento y cuantificación del DNA genómico ............................................ 22 4.10. Estandarización de la concentración de Magnesio en la reacción de PCR para la amplificación del gen de la HMGCR ................................................. 23 4.11. Genotipificación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa Análisis de resultados ......................................... 23 4.12. Secuenciación ............................................................................................... 24 4.13. Análisis de resultados y estadística ............................................................... 24 4.14. Materiales y equipos ...................................................................................... 25 5. RESULTADOS .............................................................................................. 26 5.1. Genotipificación del polimorfismo de tipo tandem (TTA)n en el gen de la HMGCoA reductasa .............................................................................. 26 5.2. Pacientes del estudio..................................................................................... 26 5.2.1 Características basales de los pacientes enrrolados .................................... 27 5.2.2 Frecuencia alélica de los pacientes participantes del estudio ....................... 29 5.2.3 Condiciones de los pacientes después de un año de finalizado el estudio ... 29 5.3. Lípidos plasmáticos ....................................................................................... 30 5.3.1 Niveles de lípidos plasmáticos basales y después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina, para diferentes polimorfismos (TTA)n en pacientes con cardiopatía coronaria ............................................. 30 5.3.2 Frecuencia y porcentaje de cambio desde el basal de lipidos plasmaticos, después de 8 semanas de tratamiento, para diferentes polimorfismos (TTA)n en pacientes con cardiopatía coronaria .................... 31 5.4. Proteina C reactiva ultrasensible y F-2 isoprostanos .................................... 33 5.4.1 Reduccion y porcentaje de cambio, de los niveles de proteina C reactiva ultrasensible desde el basal del colesterol total en mujeres después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina, para diferentes polimorfismos (TTA)n en pacientes con cardiopatía coronaria .................... 33 5.4.2 Distribución de PCRu .................................................................................... 34 5.5. Índice de masa corporal y peso de los pacientes del estudio ....................... 35 V 5.6. Tolerabilidad y evaluación de la seguridad en la utilización de atorvastatina, como medicamento del estudio ............................................. 35 6. DISCUSIÓN ................................................................................................... 37 7. CONCLUSIONES .......................................................................................... 41 8. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 42 9. ANEXOS........................................................................................................ 57 VI INDICE DE FIGURAS FIGURA PÁGINA Figura 1: Desarrollo de una placa aterosclerótica.................................................. 3 Figura 2: Estructura química de atorvastatina.................................... ................ ...7 Figura 3: Efectos celulares de las estatinas.................................................... .....10 Figura 4: Polimorfismo del tipo tandem (TTA)n, en el gen de la HMG-CoA reductasa. ....................................................................... ....14 Figura 5: Diseño del estudio clínico......................... ........................................ ....18 Figura 6: Estandarización de concentración de Mg2+ en la amplificación por PCR del gen de la HMGCR................................................. .... ……23 Figura 7: Organización estructural del gen HMGCR............. ............................ ...24 Figura 8: Secuenciación de un templado amplicado de DNA que contiene repetición TTA...................................................................................... .24 Figura 9: Electroforesis en gel de poliacrilamida que muestra la separación de los productos de PCR del polimorfismo (TTA)n del gen HMGCR de distintos pacientes....... ................................... ......26 Figura 10: Diagrama de flujo……………… ......................................................... ...27 Figura 11: Niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total según polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCG……………… ...................................... 31 Figura 12: Porcentaje de cambio de niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCG.................................................... ......................................... ...33 Figura 13: Valores de índice de masa corporal y peso de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCG ……...................... ... .....35 Figura 14: Valores de GOT, GPT y CK…... ………………………….............. ... .....36 Figura 15: Valores de GOT y GPT de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR. …... ………………………….............. ............................ .....36 VII INDICE DE TABLAS TABLA Tabla 1: PÁGINA Exámenes de laboratorio realizados por protocolo a todos los pacientes del estudio ........................................................................... 22 Tabla 2: Características basales de los pacientes en estudio .................................. 28 Tabla 3: Frecuencia alélica de los pacientes ............................................................ 28 Tabla 4: Condiciones de los pacientes después de un año de finalizado el estudio 29 Tabla 5: Valores basales de lípidos plasmáticos y después de 8 semanas de tratamiento ............................................................................. 30 Tabla 6: Reducción y porcentaje de cambio desde el basal de los lípidos plasmáticos ..................................................................................... 32 Tabla 7: Reducción y porcentaje de cambio de los niveles de proteína C reactiva ultrasensible y F2-isoprostanos .................................. 34 Tabla 9: Distribución de PCRu.................................................................................. 34 VIII INDICE INDICE DE ANEXOS DE ANEXOS PÁGINA Anexo 1: Extracción de DNA a partir de sangre periférica ................................... 58 Anexo 2: Consentimento Informado..................................................................... 60 Anexo 3: CRF. Recolección de datos .................................................................. 62 IX ABREVIATURAS A to Z : Aggrastat to Zocor trial AFCAPS/Tex CAPS : Air Forces/Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study Apo-E : Apolipoproteína–E CAD : Enfermedad de las arterias coronarias CARE : Colesterol And Recurent Event CC : Cardiopatía coronaria CCR2 : Receptor de proteína-1 quimioatractante de monocitos cHDL : Colesterol de lipoproteína de alta densidad cLDL : Colesterol de lipoproteína de baja densidad CML : Células musculares lisas CMLVs : Células musculares lisas vasculares CRP : Proteína C-reactiva CV : Cardiovascular eNOS : NO sintasa endotelial EIA : Enzimoimmunoensayo FPP : Farnesil-pirofosfato GGPP : Genarilgenaril pirofosfato hsCRP : Proteína C reactiva ultrasensible HMG-CoA reductasa : 3-hidroxi 3-metilglutaril-coenzima A reductasa HMGCR : Gen de la HMG-CoA reductasa HPS : Heart Protection Study IAM : Infarto agudo del miocardio IECA : Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina-I ICAM-1 : Molécula-1 de adhesión intercelular IDEAL : Incremental Decrease in End points through Aggressive Lipid Lowering IL-1 : Interleuquina 1 IL-8 : Interleuquina 8 JÚPITER : Justification for the USE of Statins in Primary Prevention: an Intervention Trial Evaluating Rosuvastatin LDLox : LDL oxidadas LIPID : Long term Intervention with Pravastatin in Isquemic Disease MCP-1 : Proteína-1 quimioatractante de monocitos MIRACL : Myocardial Ischemia Reduction with Agressive Colesterol Lowering MMPs : Metaloproteasas X NF-κB : Factor transcripcional nuclear kappa B NO : Oxido nítrico PCR : Proteina C reactiva PCR : Reacción de la polimerasa en cadena PCRu : Proteína C reactiva ultrasensible PPARα : Peroxisome proliferators-activated receptor-α PPARγ : Peroxisome proliferator-activated receptor-γ PROSPER : PROspective Study of Pravastatin in the Elderly at Risk PROVE-IT-TIMI 22 : Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infecction TherapyThrombolysis in Myocardial Infarction 22 RAM : Reacciones adversas a medicamentos REVERSAL : Reversal of Atherosclerosis with Aggressive Lipid Lowering RNS : Radicales libres derivados nitrógeno ROS : Radicales libres derivados del oxígeno SNP : Single nucleotide polymorphisms TIMPs : Inhibidores endógenos de las MMPs TNF-α : Factor de necrosis tumoral α TNT : Treating to New Targets (TTA)n : Polimorfismo de repetición (TTA)n VCAM-1 : Molécula-1 de adhesión vascular VNTR : Número variable de repeticiones en tandem 4S : Scandinavian Simvastatin Survival Study XI RESUMEN La cardiopatía coronaria (CC), es la principal causa de muerte en Chile y en países desarrollados. La etiología más frecuente es la ateroesclerosis, reconociéndose ésta como una enfermedad dinámica y progresiva en la que se combina la disfunción endotelial, inflamación y la acumulación de lípidos y elementos fibrosos en las arterias en forma de placas. Los inhibidores de la 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA), estatinas son uno de los medicamentos más efectivos en el tratamiento de la hipercolesterolemia. Estos han sido ampliamente utilizados en la clínica, para reducción el colesterol total y LDL (cLDL). Además el tratamiento con estatinas también ha mostrado reducir los niveles plasmáticos de la proteína C reactiva (PCR) de una manera independiente de la reducción del colesterol, de igual manera estos fármacos han mostrado poseen propiedades antioxidantes. Aunque los beneficios del tratamiento con estatinas han sido establecidos tanto en la prevención primaria como secundaria de la CC, diferencias farmacológicas interindividuales se observan con este tratamiento, las que se atribuyen a diferencias genéticas. Estudios relacionados con la variaciones genéticas en el gen de la HMGCoA reductasa (HMGCR), el blanco directo del tratamiento con estatinas y su influencia con los cambios en los niveles de los lípidos plasmáticos han sido limitados. Estudios previos han indicado que el polimorfismo (TTA)n de número variable de repeticiones en tandem (VNTR) en el gen HMGCR se asocia a patologías como la CC y la hipercolesterolemia. Se ha descrito el polimorfismo de repetición (TTA)n en el gen de la HMGCR y la absorción de colesterol en respuesta al consumo de esteres de estanol. El objetivo del presente estudio consistió en evaluar la influencia del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en la magnitud de la reducción del cLDL por atorvastatina en pacientes chilenos con CC. El objetivo secundario fue determinar los cambios en los niveles plasmáticos de colesterol total, PCR ultrasensible (PCRu) y F2-isoprostanos después del tratamiento con atorvastatina y su relación con la presencia del polimorfismo (TTA)n en pacientes con CC. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Clínico de la Universidad de Chile y todos los pacientes dieron su consentimiento para la participación en el estudio. Sesenta y cuatro pacientes con CC documentada, completaron este estudio, ellos recibieron 40 mg/día de atorvastatina por 8 semanas. Los niveles lípidos plasmáticos; colesterol total, colesterol HDL (cHDL) y triglicéridos se determinaron XII utilizando métodos enzimáticos, el cLDL se calculó utilizando la formula de Friedewald. Los niveles de PCRu se determinaron con una reacción antígeno-anticuerpo utilizando la técnica de látex y los niveles de F2-isoprostanos se midieron utilizando inmunoensayo. La genotipificación de los pacientes participantes del estudio se realizó mediante la técnica de reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Los principales resultados de este estudio fueron: • La distribución del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en 64 pacientes fue: genotipo >10/>10 en 22 pacientes (34%), genotipo >10/10 en 14 pacientes (22%) y genotipo 10/10 en 28 pacientes (44%) • Atorvastatina redujo significativamente los niveles plasmáticos de cLDL en todos los pacientes (p< 0,0001), después de 8 semanas de tratamiento. Esta reducción fue independiente del tipo de alelo (TTA)n en el gen de la HMGCR. • Los niveles de la PCRu disminuyeron en los pacientes tratados con atorvastatina, sólo los alelos (TTA)n >10/>10 y 10/10 en el gen HMGCR (p<0,05). • Los niveles plasmáticos de F2-isoprostanos y colesterol total disminuyeron significativamente después del tratamiento con atorvastatina, para todos los alelos (p< 0,001). A partir de estos resultados se concluye que no hubo asociación entre el polimorfismo (TTA)n presente en el gen de la enzima HMG-CoA reductasa y la magnitud de la reducción de los niveles plasmáticos de cLDL, colesterol total, PCRu y F2-isoprostanos en una muestra de pacientes chilenos con CC crónica estable tratados por 8 semanas con atorvastatina. XIII ABSTRACT Coronary Artery Disease (CAD) is the main cause of death in Chile and in developed countries. The most frequent ethiology is the atherosclerosis. Atherosclerosis is recognized as a dynamic and progressive disease, in which ethiology participate a combination of endothelial dysfunction and inflammation and is characterized by the accumulation of lipid and fibrous elements in the large arteries, as plaques fibrous. One of the drugs that has shown to be more effective on the treatment of hipercholesterolaemia, are the inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase, statins have been clinically used for lowering total and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDL-C). Statins therapy also lowers C-reactive protein (CRP) levels in a LDL cholesterol-independent manner. Statins also have antioxidant properties. Although the beneficial effects of statins treatment in the primary and secondary prevention of CAD have been established, interindividual pharmacological differences observed with this treatment have been attributed to genetic differences. Studies about genetic variations in HMG-CoA reductase gene (HMGCR), the direct target of statin therapy, and the relation with the changes in lipid levels with statin therapy are limited. Previous studies have indicated that variable number of tandem repeats (VNTR) polymorphism (TTA)n of the HMGCR gene was associated with pathologies such as CAD and hypercholesterolemia. Moreover, it has been reported an almost significant difference between the (TTA)n repeat polymorphism in the HMGCR gene and cholesterol absorption in response to plant stanol consumption. The aim of the present study was to evaluate the role of HMG-CoA reductase gene (HMGCR) (TTA)n repeat polymorphism in relation to the LDL-C lowering efficacy of atorvastatin in Chilean patients with CAD. A secondary objective was to determine the change in levels of total cholesterol, high-sensitivity CRP (hsCRP) and free F2isoprostanes after atorvastatin treatment and its relation with the presence of HMGCR (TTA)n polymorphism in patients with CAD. This study was approved by the Ethics Committee of the Clinical Hospital of the University of Chile, and all patients gave their informed consent. Sixty-four patients with documented CAD completed the trial receiving 40 mg of atorvastatin daily for 8 weeks. Lipid levels as, total cholesterol, high-density lipoprotein XIV cholesterol (HDL-C) and serum triglyceride levels were determined using enzymatic methods. LDL-C was calculated using the Friedewald´s formula. The hsCRP levels were determined by latex method assay and free F2-isoprostanes were performed using enzyme immunoassay (EIA). Genotyping was done by the polymerase chain reaction. The results of this study were: • The genotype distribution of the HMGCR (TTA)n polymorphism was: Allele >10/>10 in 22 of 64 patients (34%) Allele >10/10 in 14 of 64 patients (22%) Allele 10/10 in 28 of 64 patients (44%). • Atorvastatin significantly reduced LDL-C levels in all patients (p<0.0001), regardless the type of HMGCR (TTA)n polymorphism. • Reduction on hsCRP were observed in atorvastatin-treated patients with HMGCR (TTA)n alleles >10/>10 and 10/10 (p<0.05). • Free F2-isoprostanes and total cholesterol were also reduced significantly after treatment for all alleles (p<0.001). In summary we found in a sample of patients with chronic stable CAD, no associations were found in the atorvastatin-induced reduction of LDL-C, total cholesterol, hsCRP and free F2- isoprostanes with the HMGCR (TTA)n polymorphism. XV 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Cardiopatía coronaria La cardiopatía coronaria (CC), es la principal causa de muerte en Chile y en países desarrollados (1), incrementándose rápidamente su prevalencia en los países en vías de desarrollo. Producto de la cardiopatía coronaria desde 1990 ha muerto mas gente en todo el mundo que de cualquier otra enfermedad (2). Se denomina cardiopatía coronaria a las alteraciones cardíacas secundarias a trastornos de la circulación coronaria. La etiología mas frecuente es la aterosclerosis (3) y sus manifestaciones clínicas mas importantes son: la angina y el infarto agudo del miocardio (IAM). Las intervenciones clínicas de mayor beneficio en la cardiopatía coronaria son las farmacológicas y las de revascularización (cirugía de bypass coronario y angioplastía). Varios de los factores de riesgo para el desarrollo de la cardiopatía coronaria están determinados genéticamente, por ejemplo colesterol total y la lipoproteína de baja densidad (LDL). Otros rasgos que también son influenciados genéticamente y que aumentan el riesgo de desarrollar cardiopatía coronaria son la hipertensión arterial, diabetes tipo II y el síndrome metabólico. 1.2. Aterosclerosis La aterosclerosis se reconoce como una enfermedad dinámica y progresiva en cuya etiología participan una combinación de disfunción endotelial e inflamación (4). Esta se caracteriza por la acumulación de lípidos y elementos fibrosos en grandes arterias en forma de placas (ateromas). La asociación entre los lípidos y la ateroesclerosis dominó los pensamientos hasta los años 1970, basada en importantes asociaciones clínicas y experimentales entre la hipercolesterolemia y el ateroma (5,6). Luego, el desalentador problema clínico de la reestenosis, posterior a una angioplastía coronaria, consideró el problema de la proliferación, reforzando el interés en el control del crecimiento celular. Una fusión de estos conceptos llevo al pensamiento de que el ateroma tenía un centro de lípidos envuelto por una cápsula de células musculares lisas proliferativas. En la actualidad la noción de que la inflamación y la respuesta inmune contribuyen a la aterogénesis y juegan un papel importante, ha generado un interés creciente (7). La aterosclerosis comprende varios procesos: disfunción endotelial, inflamación, proliferación celular vascular y alteraciones de la matriz extracelular. La disfunción endotelial 1 es la primera alteración de la pared vascular, caracterizada por la disminución en la producción del óxido nítrico (NO) o de su disponibilidad. El NO es un importante vasodilatador que también disminuye la oxidación del colesterol LDL (cLDL) y la proliferación de células musculares lisas (8). Entre los factores responsables de esta disfunción, se encuentra los elevados niveles de cLDL y LDL oxidadas (LDLox), radicales libres derivados del oxígeno (ROS) y/o del nitrógeno (RNS). Cabe mencionar que la concentración de LDLox en la placa aterosclerótica es proporcional a la concentración plasmática de la LDL nativa (9). Cuando existe hipercolesterolemia, la LDL se retiene en la pared arterial, por una fuerte adhesión a los proteoglicanos presentes en la íntima (10). La LDL unida a estos proteoglicanos se oxida más fácilmente (11), modulando la aterogenicidad de las LDLs. Las alteraciones de la permeabilidad del endotelio y el aumento de la expresión de MCP-1. VCAM-1, ICAM-1 y selectinas inician una respuesta inflamatoria en la pared arterial. Las acciones específicas de cada una de estas proteínas se describen a continuación: • MCP-1 (proteína-1 quimioatractante de monocitos) (12) y de su receptor CCR2 en monocitos (13), La MCP-1 estimula la migración de monocitos dentro de la pared arterial y promueve la respuesta inflamatoria mediada por el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) e IL-1 (14), • VCAM-1 (molécula-1 de adhesión vascular) molécula altamente expresada en la superficie endotelial, clave para la adhesión de monocitos y linfocitos T a la pared arterial (15), • ICAM-1 (molécula-1 de adhesión intercelular) y • P y E selectinas, que reclutan monocitos a la superficie vascular. La importancia funcional de cada una estas moléculas se demostró en ratones knockout (16-18). Todos estos procesos llevan progresivamente a la atracción y migración de leucocitos al subendotelio, en particular monocitos, que después de adherirse e infiltrar al endotelio se transforman en macrófagos, que fagocitan a las LDLox, por las que tienen mayor afinidad que las LDL nativas (19). La LDLox es captada por los receptores SR-A (scavenger-A) y CD36 (20) presentes en la superficie de los monocitos, cuando estos se encuentran circulantes, expresan escasamente estos dos receptores, pero cuando cruzan la pared arterial, ocurren cambios fenotípicos y su expresión aumenta significativamente. Finalmente los macrófagos después de captar a las LDLox, se transforman en células espumosas que forman parte de la placa de ateroma en la pared vascular. En esta etapa, la lesión se caracteriza por contener células espumosas en el subendotelio, algunos 2 linfocitos T, depósitos en la matriz extracelular, migración de células musculares lisas (CML) desde la capa media a la íntima e activación y adhesión de plaquetas y leucocitos a la superficie endotelial (21). Cuando la inflamación prevalece, las células musculares lisas vasculares (CMLVs) sintetizan nuevo colágeno para la reparación y mantención de la capa fibrosa, pero la degradación de la matriz de colágeno aumenta por sobrexpresión y actividad de las MMPs (metaloproteasas), enzimas especializadas en la degradación de componentes de la matriz extracelular del subendotelio (22). Estudios in vitro muestran que mediadores inflamatorios como IL-1β y TNF-α aumentan la expresión de las MMPs en fagocitos mononucleares y células endoteliales (3). Es entonces como la capa fibrosa se debilita y se hace susceptible a la ruptura cuando es expuesta a continuas tensiones, conduciendo a hemorragia intraplaca, formación de trombos y finalmente oclusión de la arteria. Así es importante la participación de las MMPs y los TIMPs (inhibidores endógenos de las MMPs) en las enfermedades cardiovasculares ya que son responsables de los procesos de remodelado ventricular y vascular e inestabilidad de la placa aterosclerótica (23). La figura 1 muestra los procesos y mediadores involucrados en la generación de una placa aterosclerótica (24). Proceso Disfunción Activación endotelial endotelial Células apoptoticas Plaquetas Inflamación Proteólisis Apoptosis Trombosis de la matriz Colágeno Células musculares lisas Célula endotelial Células y moléculas de adhesión Fibrina LDL-C Macrófagos Cristales colesterol Figura 1. Desarrollo de una placa aterosclerótica. Las LDLs penetran en el endotelio disfuncional y la oxidación de las LDLs a LDLs oxidadas, las cuales son fagocitadas por los macrófagos, transformándose en células espumosas. La acumulación y proliferación de las células musculares lisas llevan al crecimiento de la placa. La infiltración de células inflamatorias, la apoptosis de las células musculares lisas y la degradación de la matriz, genera una placa vulnerable, con una capa fibrosa y una base necrótica rica en lípidos. La ruptura de la placa puede causar trombosis, lo cual puede ser suficiente para causar la oclusión del vaso (24). 3 1.2.1. Colesterol en la aterosclerosis El siglo XX fue la etapa del colesterol y de las lipoproteínas que culminó en una serie de estudios clínicos con gran número de pacientes que mostraron de manera definitiva que la reducción de la hipercolesterolemia reduce la mortalidad y morbilidad asociado a patologías cardiovasculares (25). Investigaciones han mostrado que la hipercolesterolemia juega un rol clave en el desarrollo de la CC y otras manifestaciones de aterosclerosis. La cardiopatía coronaria prematura -tan temprano como a los 5 años de edad- en pacientes con hipercolesterolemia familiar, que tienen una mutación del gen que codifica para el receptor de la LDL (LDLR)(26), indica que los altos niveles plasmáticos de colesterol, especialmente cLDL, se retiene e infiltran el endotelio cuando se asocian a un fenómeno inflamatorio, se reconoce entonces a la aterosclerosis como una enfermedad inflamatoria (25). Una de las respuestas más tempranas inducidas por la hipercolesterolemia es un incremento en la expresión VCAM-1, (15), MCP-1 (12) y su receptor en los monocitos (13) e IL-8 (27). Pero las LDLs y más específicamente las LDLox, tiene efectos pro-inflamatorios que son mediados por el factor transcripcional NF-κB (28), aumentando la expresión de IL-1 y IL-8 (29). Se ha demostrado que las LDLox inhiben a la eNOS (30,31) y producen una down-regulation de esta enzima en células endoteliales de arterias coronarias (32), induciendo también la unión de monocitos a estas células (33), mediado por un aumento en la expresión de MPC-1 (34) y de VCAM-1 (35). Las LDLox aumentan la síntesis de colágeno en CMLVs (36) y el calcio intracelular (37), además de inducir la expresión de MMP-1 (38). Los niveles circulantes de LDLox se pueden sumar al riesgo global, basado en la edad, el sexo, el colesterol total y bajos niveles de cHDL (lipoproteína de alta densidad), diabetes mellitus, hipertensión arterial y el hábito de fumar y se ha utilizado como marcador de riesgo cardiovascular (39,40). En el estudio AIR (41), los niveles circulantes de LDLox se asociaron con aterosclerosis subclínica (determinada con ultrasonido) y marcadores de inflamación (proteína C-reactiva, IL-6 y TNF-α). De la teoría de la oxidación nacieron varios estudios clínicos con vitaminas, los que definitivamente no han mostrado su beneficio en la prevención cardiovascular (42). También dentro de las lipoproteínas destaca la HDL, cuyos niveles plasmáticos se han correlacionado inversamente con el riesgo a desarrollar cardiopatía coronaria (43,44). 4 1.2.2. Inflamación en la aterosclerosis La cascada inflamatoria se inicia por el reclutamiento y diferenciación de macrófagos en la pared arterial. Citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β o TNF-α, mediados por NFκB inducen la activación de VCAM-1 (45). La activación del NFκB promueve el reclutamiento y activación de más células inflamatorias para el desarrollo de la lesión ya que varios genes que codifican para citoquinas pro-inflamatorias y otros mediadores de inflamación son regulados simultáneamente por este factor (46-48). Los macrófagos después de fagocitar a las LDLox liberan a la circulación citoquinas, ROS, MMPs y factor tisular, una potente proteína pro-coagulante (3). Citoquinas, incluyendo a IL-1, TNF-α y IL-6 son altamente expresadas en las lesiones ateroscleróticas avanzadas (49). La IL-6 se considera, entre varias citoquinas pro-inflamatorias, como el principal mediador de la producción hepática de la proteína C reactiva (PCR) (8), siendo este último un importante marcador de inflamación. Los niveles elevados en la sangre tanto de citoquinas pro-inflamatorias como de PCR se consideran actualmente factores de riesgo cardiovascular (7). 1.2.3. Proteína C reactiva La proteína C reactiva es un pentámero, compuesto de cinco sub-unidades de 23 kDa. Los niveles plasmáticos de la PCR se incrementan rápidamente en respuesta a un estimulo no específico, por ejemplo: trauma, inflamación, tumores e infecciones y disminuye rápidamente después de la estabilización del paciente. En contraste con otros marcadores, la PCR tiene una vida media larga (> 96h), una alta estabilidad (50), carece de variaciones diurnas o estaciónales y no depende del genero (51,52). Ha sido rigurosamente estandarizada y se puede medir en sangre, con una alta sensibilidad. Más de veinte estudios prospectivos han mostrado que la PCR ultrasensible (PCRu) a pesar de su respuesta inespecífica, es biomarcador de inflamación y un predictor independiente de futuros eventos cardiovasculares (53). Concentraciones elevadas de PCRu predicen riesgo cardiovascular en varios subgrupos de pacientes: hombres y mujeres sin enfermedad cardiovascular (54), con angina estable o síndrome agudo coronario (55), pacientes con angina inestable (56), después de un IAM (57) e incidencia de reestenosis post- angioplastía (58). La evaluación de diferentes 5 marcadores de inflamación revela que la PCRu posee el mayor valor predictivo de eventos cardiovasculares respecto a otros biomarcadores como moléculas de adhesión, citoquinas (TNF-α e IL-6) y homocisteína. (54,59). Recientes observaciones del estudio de Framingham (60) indican que los niveles de PCRu actúan como potenciales predictores del riesgo cardiovascular global (61). La American Heart Association recomienda la aplicación de la PCRu para la determinación del riesgo cardiovascular (CV) (62). Basados en datos epidemiológicos se ha propuesto categorizar a los pacientes de acuerdo a los niveles basales de la PCRu; niveles que indican un bajo riesgo PCRu < 1 mg/L, riesgo intermedio PCRu entre 1 y 3 mg/L y el grupo de alto riesgo PCRu >3 mg/L (59). En la biología endotelial, la PCR también tiene un papel crítico en la patogenia de la aterosclerosis, favoreciendo un fenotipo pro-inflamatorio y pro-aterosclerótico. La PCR produce una potente “down-regulation” de la trascripción de la NOsintasa endotelial (eNOS), desestabilizando su mRNA in vitro, (63), estimula la apoptosis de células endoteliales, bloquea la angiogénesis por inhibición de la producción del NO (63) e inhibe la sobrevida y diferenciación de células progenitoras endoteliales desde la médula ósea (64). Se ha descrito también que la PCR estimula la liberación de endotelina-1 e IL-6 desde células endoteliales (65) y disminuye la producción del vasodilatador prostaciclina (66). La PCR sobrerregula a NF-kβ (67) y estimula la expresión de VCAM-1, ICAM-1, E-selectina e IL-8 (14), promoviendo la adhesión de monocitos a las células endoteliales (14). La PCR también induce a MCP-1 y juega un rol en la desestabilización de la placa de ateroma, estimulando a la MMP-1 (68). Además bloquea la fibrinolisis y promueve la síntesis y expresión del inhibidor del plasminógeno (69). Tradicionalmente se conocía que la PCR sólo se producía en el hígado. Sin embargo, recientes estudios han identificado que varios tipos celulares pueden sintetizarla, entre los que se incluyen a macrófagos del pulmón y cerebro (70,71), el epitelio renal (72) y adipocitos (73). Además su mRNA (74) y proteína se ha detectado en placas ateroscleróticas pero no en la íntima normal (75), localizándose predominantemente en CML y macrófagos. Todo esta argumentan a favor de que existe síntesis de novo en la pared arterial y lleva a la idea de que la PCR presente en la circulación sistémica no sólo proviene del hígado (76,77). 6 1.3. Tratamiento farmacológico de la cardiopatía coronaria Ensayos randomizados han confirmado los beneficios de 4 grupos de fármacos, administrados de manera profiláctica, en la prevención secundaria (78): a) antiagregantes plaquetarios, (79-81); b) β-Bloqueadores (82,83); c) inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina- I (IECA) (84-88) y d) estatinas (89-92). 1.3.1. Estatinas Las estatinas son inhibidores competitivos y reversibles de la hidroximetilglutaril coenzima-A reductasa (HMG-CoA, Figura 2), enzima limitante en la biosíntesis endógena de colesterol. Las estatinas inhiben a esta enzima, compitiendo con el sustrato endógeno por el sitio activo de la enzima (93). En la actualidad son fármacos de elección en el tratamiento de la dislipidemia, logrando reducir considerablemente los niveles de los lípidos plasmáticos, con especial importancia el LDL. Además de la disminución de lípidos sanguíneos, a las estatinas se les atribuyen efectos extralipídicos, de importancia en la patología coronaria (94, 95). Figura 2. Estructura química de atorvastatina. 1.3.2. Mecanismos moleculares de acción de las estatinas Dado el efecto positivo de las estatinas en las células vasculares, la dilucidación de los mecanismos básicos moleculares ha despertado gran interés en la comunidad científica. 7 Variados estudios han llevado al establecimiento de múltiples mecanismos que se han extendido desde interacciones con moléculas en células de superficie a alteraciones en la señalización de proteínas y modulación de la expresión/función de factores nucleares. 1.3.2.1. Estatinas e isoprenilación de proteínas La síntesis de colesterol se lleva a cabo en múltiples pasos (Figura 3). Los isoprenoides (fernesil-pirofosfato y geranilgenaril-pirofosfato) son importantes intermediarios de la biosíntesis endógena de colesterol, pero además son esenciales para la unión a las membranas y la actividad biológica de distintas proteínas G pequeñas como Rho, Rac, Rab, Rap y Ral (96). La translocación de Ras a la membrana es necesaria para su actividad biológica y es dependiente de la fernesilación. Similarmente la translocación de Rho y Rac a la membrana se requiere para su actividad, pero a diferencia de Ras esta experimenta geranilgeranilación (Figura 3). Aunque sus funciones pueden en algún grado estar superpuestas, Ras se asociada a proliferación celular, Rac con la generación de especies reactivas de oxigeno (ROS) y Rho con la activación de vías pro-inflamatorias (96, 97). Las estatinas, como inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, bloquean la biosíntesis de isoprenoides como fernesil- pirofosfato (FPP) y genarilgenaril pirofosfato (GGPP) (Figura 3) y como consecuencia, a las proteínas G pequeñas. La depleción de GGPP y/o FPP puede explicar muchos de los efectos anti-inflamatorios de las estatinas en la células vasculares (95). Por ejemplo la inhibición de la geranilgeranilación de Rho por estatinas, puede reducir la adhesión de leucocitos y la actividad fibrinolítica (98-100). También las estatinas pueden incrementar la expresión de eNOS en células endoteliales, un efecto dependiente de la inhibición de la geranilgeranilación de Rho (101,102). El efecto de las estatinas en la “up-regulation” de la expresión de la eNOS se debe a la prolongación de la vida media de su mRNA (101). Las estatinas por inhibición de la isoprenilación de Rac pueden llevar a una reducción del ensamble de la NADPH oxidasa y consecuentemente de la generación de ROS (103-105). Por otra parte, el metiléster de la L-nitro-arginina (LNAME), inhibidor selectivo de la eNOS, inhibe el aumento de las concentraciones de NO inducido por las estatinas, tanto in vivo como in vitro, confirmando que ellas actúan por acción en la síntesis de NO dependiente de eNOS. Importantemente aunque las ROS puedan inactivar al NO, las propiedades antioxidantes de las estatinas pueden a través del incremento de la eNOS contribuir a mejorar la función endotelial (95). 8 Se ha demostrado que las estatinas activan la vía de la PI3K/PKB que regula distintas funciones del endotelio (96). PKB también fosforila a caspasa-9 y eNOS (106,107), por lo que la activación de PKB por estatinas ha demostrado inhibir la apoptosis e incrementa la producción del NO en cultivos de células endoteliales (108). La exposición a estatinas disminuye la expresión del inhibidor del plasminógeno en células endoteliales, favoreciendo la lisis de coágulos, un efecto pleiotrópico de las estatinas (109,110). Estudios clínicos y pre-clínicos han mostrado que el tratamiento con estatinas restaura las funciones normales de las células vasculares (111-113). Otros estudios pre-clínicos han mostrado que las estatinas pueden disminuir la inflamación vascular independientemente de la disminución de los niveles de colesterol (114). Pero cabe destacar que la mejoría de la función endotelial es a menudo observada antes de cambios en los lípidos plasmáticos. 1.3.2.2. Estatinas y factores nucleares La activación de receptores localizados en la superficie celular y la posterior activación de diversas vías transduccionales culminan en una serie de eventos nucleares que terminan en la regulación de la expresión de genes y cambios en la función celular. Diversos estímulos pro-inflamatorios convergen en el factor trascripción NFκB y el activador de la proteína 1 (AP-1), que inducen la expresión de genes pro-adhesivos y protromboticos en las células vasculares (115). Las proteínas G pequeñas Rho y Rac pueden inducir la actividad del NFκB por mecanismos que involucran la fosforilación de IκB (inhibidor del NFκB) y llevan a la acumulación del factor nuclear NF-κB (116,117). La proteína Rho también ha mostrado activar a AP-1 en células T (118). Se postula que las propiedades antiinflamatorias de las estatinas son mediadas a través de la inhibición de NFκB y AP-1. Las estatinas limitan la acumulación nuclear de NFκB y su unión al DNA, tal vez vía un incremento de la expresión de IκB (119-123). Con respecto al AP-1, las estatinas han mostrado reducir la expresión de c-Jun, una de las dos proteínas que forman el complejo AP-1(122). Otro mecanismo por el cual las estatinas confieren favorables propiedades en el endotelio es a través de la activación del receptor proliferador activado por peroxisoma (PPARs) (124), Los PPARα y γ se han identificado en células endoteliales y poseen una potente actividad anti-inflamatoria mediada en parte por la inhibición de factores transcripcionales como NFκB y AP-1 (125,126). Agonistas específicos de PPARγ y α inhiben la aterosclerosis experimental y la formación de células espumosas en macrófagos (127). Las estatinas pueden aumentar la expresión y/o incrementar la actividad de PPARα y γ (128,129). Más aún las estatinas y los ligandos de PPARγ pueden actuar de manera 9 cooperativa en atenuar la respuesta inflamatoria en monocitos humanos (128, 130). Además, las estatinas a través de la inhibición de Rho, aumentan la actividad de PPARα y como consecuencia de ello, la expresión de moléculas anti-aterogénicas como es la apoA-1 (131). Factores de crecimiento y citoquinas pro-inflamatorias Estatinas HMG-CoA reductasa Mevalonato Fernesil PP Genarilgenaril PP Esqualeno Estrés Oxidativo Proliferación Colesterol Factores de crecimiento y citoquinas pro-inflamatorias Figura 3. Efectos celulares de las estatinas. La inhibición de la HMG-CoA reductasa por estatinas, bloquea la síntesis de colesterol y la producción de isoprenoides, resultando en una reducción de la isoprenilación de proteínas G pequeñas, como Rho lo que lleva a la disminución de la actividad del NFκB. FPP, farnesilpirofosfato; GGPP genarilgenaril pirofosfato. 1.3.3. Eficacia de la terapia farmacológica con estatinas en la prevención secundaria de la cardiopatía coronaria. Un tratamiento farmacológico adecuado en prevención secundaria para pacientes portadores de cardiopatía coronaria, puede tener un gran impacto en la recurrencia de nuevos eventos coronarios (132). Las estatinas son uno de los medicamentos que ha mostrado mayores beneficios en estos pacientes, reduciendo significativamente los eventos cardiovasculares. En un meta-análisis prospectivo con datos de 90.056 pacientes, de 14 estudios clínicos que utilizaron estatinas, mostró menor recurrencia de IAM y accidentes cerebrovasculares (133). Estudios clínicos con gran número de pacientes muestran la eficacia de las estatinas en la cardiopatía coronaria aguda y crónica. Así lo muestran los 10 estudios en prevención secundaria 4S (Scandinavian Simvastatin Survival Study) (89), CARE (Colesterol And Recurent Event) (90), LIPID ( Long-Term Intervention with Pravastatin in Ischaemic Disease trial) (91) y HPS (Heart Protection Study) (92), PROSPER (PROspective Study of Pravastatin in the Elderly at Risk) (134), PROVE-IT-TIMI 22 (135), A to Z (Aggrastat to Zocor trial)(136), TNT(Treating to New Targets) (137) e IDEAL (Incremental Decrease in End points through Aggressive Lipid lowering(138). 1.3.4. Estatinas en la reducción del cLDL, inflamación y estrés oxidativo Las estatinas son los fármacos más efectivos en la disminución de los niveles plasmáticos de colesterol, logrando reducir los niveles de colesterol total y cLDL en aproximadamente 20 a 50%. A las estatinas también se les atribuyen efectos antiinflamatorios que pueden ser evaluados mediante la determinación de la PCRu. Además a las estatinas se les atribuye propiedades antioxidantes (139) que pueden ser medidas a través de la determinación de F2-isoprostanos. F2-isoprostanos son un producto de la lipoperoxidación de membranas y marcador de estrés oxidativo y puede ser determinado en plasma y orina. El marcador de inflamación PCRu se ha evaluado en innumerables ensayos clínicos. En el estudio CARE, que incluyó pacientes post-IAM, se describió que niveles elevados de PCRu incrementaban el riesgo de sufrir nuevos eventos cardiovasculares (58). Después de 5 años de análisis del CARE se demostró que pravastatina reduce significativamente los niveles plasmáticos de PCRu de manera independiente a los niveles de cLDL (140- 142). En el estudio clínico AFCAPS/TexCAPS, en prevención primaria, se demostró que individuos con elevados niveles de PCRu se beneficiaban con el tratamiento con estatinas, aún cuando los niveles de cLDL no estaban elevados (143). En el PRINCE (Pravastatin Inflammation/PCR Evaluation) que incluyó hombres y mujeres sin historia cardiovascular (prevención primaria) y con enfermedad cardiovascular (prevención secundaria), pravastatina 40 mg/día versus placebo redujo los niveles de PCRu independientemente de los niveles de cLDL, después de 12 y 24 semanas de tratamiento (144). También en los estudios MIRACL (Myocardial Ischemia Reduction with Agressive Colesterol Lowering) (145) y REVERSAL (Reversal of Atherosclerosis with Aggressive Lipid Lowering) (146) demostraron que la estatinas reducen los niveles de PCR y cLDL. En un subgrupo del estudio clínico PROVE IT-TIMI 22 (Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infecction Therapy- Thrombolysis in Myocardial Infarction 22) (147) con 3.745 pacientes con angina inestable y post-IAM, se comparó el uso de una terapia intensiva (80 mg/día de 11 atorvastatina) y una moderada (40 mg/día de pravastatina) midiendo los niveles de cLDL y PCRu antes y después de la terapia. Ambos marcadores se redujeron después de 30 días de tratamiento, pero los pacientes que redujeron los niveles de PCR a menos de 2 mg/L mejoraron su sobrevida independientemente de los niveles del cLDL. La terapia agresiva con atorvastatina (80 mg/día) logró niveles óptimos de cLDL < 70mg/dL y PCR <2 mg/L, disminuyendo el riesgo de un muevo IAM y muerte por causa coronaria. Así el PROVE ITTIMI 22 mostró la importancia de mantener los niveles de cLDL < 70mg/dL y los de PCRu < 2 mg/L. Este concepto también se apoya en las observaciones de Nissen y cols (148), en el estudio clínico REVERSAL. Este estudio incluyo a 502 pacientes con diagnóstico de cardiopatía coronaria, se evaluó a los pacientes con ultrasonografía intravascular, demostrando que los pacientes que lograron mayores reducciones de los niveles de cLDL y PCRu también registraron la mayor regresión del ateroma. Recientemente en el estudio clínico A to Z, los investigadores también describieron que alcanzar la meta de cLDL < 70 mg/dL y PCRu < 2 mg/dL, se asociaba a una mejor respuesta clínica. Este estudio se realizo en 3.813 pacientes con síndrome coronario agudo en tratamiento con estatinas (149). En el estudio Women’s Health Study (60) que incluyo a 22.939 mujeres sin historia de enfermedad cardiovascular seguidas por 8.3 años, determinó el riesgo según Framingham y comparó la concentración basal de cLDL y PCRu. Los niveles bajos de ambos marcadores fueron importantes predictores de una mayor sobrevida. En el estudio, JÚPITER (150) (Justification for the USE of Statins in Primary Prevention: an Intervention Trial Evaluating Rosuvastatin), que incluyo pacientes en prevención primaria y evaluó el efecto de rosuvastatina 20 mg versus placebo en pacientes sanos y con PCR ≥ 2mg/L, su hipótesis proponía que individuos con elevados niveles de PCR y bajos niveles de lípidos se benefician de la terapia con estatinas, disminuyendo el riesgo cardiovascular. Así el 29 de Marzo de 2008, el laboratorio AstraZeneca, suspendió el estudio a nivel mundial, por haberse demostrado una reducción significativa de los end-point clínicos con rosuvastatina. Adicionalmente el marcador de estrés oxidativo F2 isoprostanos, ha sido determinado en tratamiento con estatinas. El tratamiento con simvastatina 40 mg/día en pacientes con cardiopatía coronaria mostró una reducción significativamente de los niveles de F2 isoprostanos (151). En otro estudio realizado en pacientes chinos con diabetes mellitus tipo 2 e hiperlipidemia, el tratamiento con fluvastatina por 12 semanas redujo significativamente los niveles plasmáticos de F2-isoprostanos (152). Igual efecto se encontró con atorvastatina en la reducción los niveles urinarios de F2-isoprostanos (153). 12 1.4. Farmacogenómica del tratamiento con estatinas La farmacogenómica es una nueva ciencia que estudia las variaciones genéticas que influyen en la respuesta del individuo a los medicamentos (154-157). Estas variaciones cuando se generan en un porcentaje menor al 1% de la población se denominan mutaciones y cuando este porcentaje es superior al 1% se llaman polimorfismos (154-157). Estas variaciones se pueden encontrar en los genes que codifican para enzimas, transportadores y receptores (154-157). Estas diferencias genéticas explican la distinta eficacia y toxicidad interindividuales de algunos medicamentos (157, 158). Un polimorfismo se define como una secuencia de DNA que se transmite de generación en generación de forma simple. Los polimorfismos pueden ser de varios tipos, tales como: 1) polimorfismo de un sólo nucleótido (SNP) que se produce por el cambio de una base nitrogenada; 2) de inserción o deleción de una base; 3) por inserción o deleción de un conjunto de bases que pueden ser de cientos a miles; 4) polimorfismo de número variable de repeticiones tandem (VNTR) y 5) por inserción o deleción, repetidas veces, de una o más bases, constituyendo los denominados microsatélites (157,158). Aproximadamente, el 90% de los polimorfismos corresponden a SNP, identificándose alrededor de cuatro millones de ellos (157). Sin embargo, la mayor parte de los SNP no tiene relevancia clínica, puesto que son los denominados polimorfismos silentes, es decir, que no tienen efecto en la expresión proteica, debido a que distintos tripletes pueden codificar para un mismo aminoácido (157,158). Recientes avances en la determinación de SNP se pueden aplicar para caracterizar a los pacientes que experimentan un evento adverso o aquellos para los cuales un fármaco muestra eficacia (159-161). Además la determinación de polimorfismos de genes involucrados en farmacocinética y farmacodinamia de las estatinas, previo al inicio de la terapia con el fármaco, podría ayudar a identificar pacientes con riesgo de desarrollar reacciones adversas a medicamentos (RAM) (162). En la farmacocinética de las estatinas, el CYP3A4 es la principal vía de metabolización para lovastatina, simvastatina y atorvastatina. Un estudio observó una asociación entre el polimorfismo A290G del CYP3A4 y los niveles de cLDL en plasma después del tratamiento con atorvastatina (163). Así polimorfismos de genes que codifican para proteínas que juegan un importante rol en el 13 metabolismo de colesterol, tienen un importante papel en la respuesta diferencial a la terapia con estatinas. El gen de la apolipoproteína–E (Apo-E), que es sin duda el más estudiado y probablemente uno de los genotipos más importante que afecta la respuesta hipolipemiante a las estatinas (164). Otros genes importantes son el LDLR (receptor LDL) y el HMGCR (3hydroxy-3-metilglutaryl coenzyme A reductasa), reportándose polimorfismos en este último gen. El conocimiento de estos polimorfismos puede ayudar a una adecuada selección de medicamentos, de su dosis y a la optimización de la eficacia y seguridad del tratamiento (159-158, 165). 1.4.1 Polimorfismos en el gen de la HMG-CoA reductasa (HMGCR) El gen de la HMG-Co A reductasa está compuesto de 20 exones y se ubica en el cromosoma 5q 13.3 –q 14 (166). Existe un polimorfismo, en el intrón 2, que es del tipo de número variable de repeticiones en tandem (VNTR) y consiste en la repetición (TTA)n; se han descrito 7 alelos A1 a A7 que van desde 10 a 16 repeticiones (167). En la Figura 4 se muestra la ubicación del polimorfismo de la HMG-CoA reductasa. EXONES 1 2 EXONES 3 20 3´ 5´ TTATTATTATTATTATTATTATTATTAT Figura 4. Polimorfismo del tipo tandem (TTA)n, en el gen de la HMG-CoA reductasa. Esquema del gen HMGCR. Las líneas negras indican secuencias intrónicas. El polimorfismo tipo tandem se encuentra ubicado en el intron 2 de este gen, el fragmento puede tener de 175 a 193 pares de bases. Previos estudios han asociado a este polimorfismo del tipo VNTR, (TTA)n en el gen HMGCR, a patologías como la cardiopatía coronaria y la hipercolesterolemia (168,169). Un estudio que analizó este polimorfismo, encontró que la frecuencia de repeticiones (TTA)n varió desde 10 (55,2%) a 16 (3,0%), esta frecuencia de distribución sugiere que 10 repeticiones pueden ser consideradas como el alelo silvestre o “wild-type”. En este estudio 14 participaron 112 individuos no hipercolesterolémicos, de los países bajos, que consumieron en la dieta esteres de estanol, compuestos que disminuyen la absorción de colesterol a nivel intestinal (170). Como ya hemos mencionado, la terapia con estatinas es ampliamente prescrita para el tratamiento de la hipercolesterolemia, sin embargo existe una considerable variación interindividual en la respuesta clínica y en la reducción de los niveles plasmáticos de colesterol (171, 172). En el estudio clínico PRINCE (Pravastatin Inflammation/CRP Evaluation) se describieron dos variantes no codificantes en el HMGCR que se heredan juntas (SNPs 12 y 29) y se asociaron con la magnitud de la respuesta de la reducción de colesterol total y cLDL. Los portadores del haplotipo constituidos por estos SNPs mostraron un 22 y 19% de una menor reducción en el colesterol total y cLDL respectivamente, después del tratamiento con estatinas (173). En este estudio participaron 1.536 pacientes, 88,7% blancos, 6,7% negros, 2,9% hispanos, 1,2% asiáticos y 0,7% otras etnias (173) y la prevalencia del polimorfismo A/T fue 6,7%. Sin embargo, la asociación entre los SNPs en el gen HMGCR y la respuesta al tratamiento con estatinas no pudo ser reproducida en el estudio ACCESS (174). Aparte de los estudios clínicos PRINCE y ACCESS no hay más estudios farmacogenómicos que hayan estudiado polimorfismos en el gen de la HMG-CoA reductasa y respuestas al tratamiento con estatinas. En resumen lo que se conoce hasta ahora es: • Estudios clínicos multinacionales, con gran número de pacientes han demostrado que la hipercolesterolemia, especialmente los altos niveles plasmáticos de cLDL, se asocia a la cardiopatía coronaria. • Las estatinas son actualmente los fármacos de elección en el tratamiento de la hipercolesterolemia, especialmente en la reducción de los niveles plasmáticos del cLDL y por consiguiente la reducción de la mortalidad cardiovascular. Además en los últimos años, se les ha atribuido a las estatinas efectos extralipídicos o pleiotrópicos relacionados con la reducción de inflamación y estrés oxidativo. • Un polimorfismo del tipo SNP en el gen de la HMG-CoA reductasa se ha asociado a una respuesta diferencial frente al tratamiento con estatinas. Sin embargo estos datos no pudieron ser reproducidos. • Se desconoce si el polimorfismo de tipo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa se asocia a respuestas diferenciales en el tratamiento con estatinas. 15 En base a estos antecedentes, hemos elegido al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR para este estudio farmacogenético en el que se evaluará de la respuesta hipolipemiante a estatinas. 16 2. HIPÓTESIS La magnitud de la respuesta hipolipemiante por estatinas en pacientes con cardiopatía coronaria se asocia al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo general Objetivo primario: Evaluar los efectos del polimorfismo de número variable de repeticiones tandem (VNTR) (TTA)n de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa sobre la magnitud de la reducción de colesterol cLDL, en pacientes portadores de cardiopatía coronaria tratados con atorvastatina. Objetivo secundario: Estudiar el nivel de inflamación y estrés oxidativo en pacientes con cardiopatía coronaria estable por medio de la determinación de la proteína C-reactiva (PCRu) y F-2 isoprostanos y su modificación por estatinas. 3.2. Objetivos específicos Caracterizar una muestra de pacientes que presentan diagnóstico cardiopatía coronaria estable y no reciben tratamiento con estatinas. Determinar la prevalencia del polimorfismo de número variable de repeticiones tandem (VNTR) (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en una muestra de pacientes con cardiopatía coronaria. Evaluar el efecto de atorvastatina (40 mg/día) sobre la magnitud de la reducción de los niveles plasmáticos cLDL, colesterol total, PCRu y F-2 isoprostanos en pacientes con cardiopatía coronaria. Establecer correlaciones entre los distintos genotipos del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa y los cambios en las concentraciones plasmáticas del cLDL y PCRu en pacientes con cardiopatía coronaria tratados con atorvastatina 40 mg. 17 4. METODOLOGÍA 4.1. Diseño del Estudio El estudio clínico fue prospectivo y abierto, que siguió las pautas ICH-GCP. Los pacientes recibieron una dosis de 40 mg/día de atorvastatina (Saval S.A. Chile) por 8 semanas, siendo cada paciente su propio control. En la primera visita, se obtuvo la historia médica completa y la medicación concomitante del paciente. A todos los pacientes se les realizó un examen físico y se les entregó un consejo dietético. Los potenciales efectos adversos se registraron en cada una de las visitas de seguimiento. El esquema de diseño del estudio se muestra en Figura 5. Sceening Atorvastatina 40 mg V1 V2 -1 0 Visitas V3 Semanas 8 Figura 5. Diseño del estudio clínico. Esquema de las visitas del estudio. Visita 1, semana -1; Visita 2, semana 0; Visita 3, semana 8 y final del estudio. 4.2. Presentación y aprobación por Comité de Ética El estudio clínico se realizó bajo las normas internacionales y la declaración de Helsinki para la protección del paciente, siendo aprobado por el Comité de Ética del Hospital Clínico de la Universidad de Chile donde se realizó el enrolamiento de pacientes. Además se diseñó un consentimiento informado en el que se especificaron las finalidades del estudio. Todos los pacientes que aceptaron participar en él, firmaron este consentimiento informado (anexo 2). 18 4.3. Incorporación de los pacientes con cardiopatía coronaria al estudio Se elaboró una ficha de recolección de datos, la que permitió el registro de los datos personales y demográficos del paciente, como también información que permitiera determinar la presencia de cardiopatía coronaria o equivalente (pacientes en prevención secundaria), factores de riesgo y tratamiento farmacológico concomitante (Anexo 3). 4.4 Determinación del tamaño de muestra La determinación del tamaño de la muestra, consideró un número de individuos que permitiera asociar alelos con respuesta a terapias farmacológicas. Los pacientes se separaron en grupos de acuerdo a la presencia o no del polimorfismo (TTA)n, en el gen de la HMG-CoA reductasa. Para el cálculo de la muestra se asumió: a) la atorvastatina reduce a esas dosis los niveles de colesterol LDL en un 30%, b) la intensidad de la respuesta hipolipemiante (reducción de los niveles de cLDL) difiere en un 20% entre grupos. Se estimó que se necesitaban 12 pacientes por grupo, es decir i) con dos alelos de 10 repeticiones (10/10), ii) con dos alelos de más de 10 repeticiones (>10/>10) y iii) con cada uno de los tipos de alelos antes descritos (10/>10). Para encontrar diferencias significativas y como se desconocía la frecuencia alélica de este polimorfismo (TTA)n en la población chilena, usamos como referencia el de una población europea, 20% en el caso de dos alelos con más de 10 repeticiones. El tamaño de la muestra total incluyó a 60 pacientes. Se utilizó un análisis de varianza, con un error α 0.05 y una potencia del 80 %. 4.5 Pacientes Se aplicaron los siguientes criterios de inclusión y exclusión: a) Criterios de inclusión: • Hombres y mujeres mayores de 18 años. • Pacientes con evidencia de ser portadores de cardiopatía coronaria estable, definido por uno o más de los siguientes criterios clínicos: pacientes que han sufrido previamente un IAM, paciente con antecedentes de angina estable o inestable documentada con coronariografía, pacientes con Diabetes Mellitus no insulino dependiente y los pacientes a los cuales se les ha practicado una angioplastía ó una cirugía de revascularización coronaria. • Colesterol LDL en ayunas en un rango de ≥100 y ≤ 220mg /dL. 19 • Trigliceridemia < 400 mg/dL. • Pacientes que no hayan recibido tratamiento farmacológico con estatinas a lo menos dos meses previos al ingreso de este estudio. b) Criterios de exclusión: • Mujeres embarazadas, en período de lactancia o en edad fértil sin método anticonceptivo. • Pacientes que hayan sido hospitalizados dentro de los 90 días previos al ingreso del estudio con: síndrome coronario agudo o hayan sido sometidos a procesos de revascularización coronaria. • Pacientes con disfunción hepática, indicada por transaminasas GOT, GPT ≥ 2 veces limite normal superior. Pacientes con niveles plasmáticos de CK > 3 veces el límite normal superior y creatinina plasmática > 2.0 mg/dL. • Pacientes con antecedentes de hipotiroidismo, TSH ≥1.5 veces el limite normal superior. • Pacientes con antecedentes de intolerancia o hipersensibilidad a las estatinas. • En tratamiento con fármacos de conocida interacción con estatinas. • Con cuadro inflamatorios o infecciosos intercurrentes. • Con enfermedades gastrointestinales que limiten la absorción de medicamentos • Y pacientes con limitaciones para comprender la naturaleza del estudio o que sean portadores de enfermedades que limiten su sobrevida. 4.6. Enrolamiento de pacientes Entre Octubre del 2005 y Septiembre del 2006 se enrolaron pacientes del Centro Cardiovascular del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. Esto pacientes se contactaron telefónicamente y provenían de la base de datos de Rehabilitación Cardiaca, Cirugía Cardiovascular y Hemodinamia. Las fichas clínicas se revisaron y aquellos pacientes que cumplían con los requisitos de selección, se les invitó a participar en el estudio. 4.7. Recolección de muestras Después de haber firmado el consentimiento informado y como parte del protocolo se extrajo una muestra de sangre de 10 mL, al indicio del estudio y después de 8 semanas de tratamiento. 20 Las muestras de sangre venosa fueron extraídas por una enfermera universitaria y recolectada en tubos vacutainer con EDTA y gel activador respectivamente. Las muestras se enviaron al laboratorio Central del Hospital Clínico de la Universidad de Chile y/o a la Unidad de Farmacogenómica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, almacenándose a 4ºC para la posterior extracción del DNA genómico. 4.8. Exámenes de laboratorio Los exámenes, Tabla 1 se realizaron en el Laboratorio Central del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. • Perfil lipídico. Las determinaciones de los lípidos plasmáticos (colesterol total, cLDL y cHDL) se realizaron con la técnica de test enzimático in vitro. La determinación cuantitativa de colesterol en plasma se efectuó utilizando el kit Roche/Hitachi ref.03030024 y 11491458 para colesterol total y cHDL, respectivamente. El valor de cLDL se obtuvo utilizando la formula de Friedewald • Glicemia. La determinación de glicemia sanguínea se realizó mediante un test enzimático in vitro de Roche/Hitachi ref.11876899. • PCRu. La determinación los niveles plasmáticos de la proteína C reactiva ultrasensible (PCRu), se realizó mediante el test inmuno-turbidimétrico Tina–quant CRP usando anticuerpo anti-PCR (Roche/Hitachi 902). • Hormona estimulante de la tiroides (TSH). La determinación plasmática de TSH se realizó con una técnica inmunométrica, que implica la reacción de la TSH con un anticuerpo biotinilado (anticuerpo monoclonal de ratón anti-TSH total) y un anticuerpo conjugado (monoclonal de ratón subunidad alfa-TSH). Test TSH Vitros Immunodiagnostic Products. Johnson & Johnson. • Creatina kinasa (CK). La determinación plasmática de CK se realizó mediante test enzimático y detección fotométrica. Roche/Hitachi ACN 057. • Enzimas hepáticas. Transaminasa oxalacética y pirúvica (GOT) y transaminasa pirúvica (GPT). Las determinaciones plasmáticas de GOT y GPT se realizaron mediante test enzimático y detección fotométrica de Roche/Hitachi 917:ACN 457 y 917:ACN 075, respectivamente. 21 Tabla 1: Exámenes de laboratorio realizados por protocolo a todos los pacientes del estudio. Exámenes Basal, visita 1 Fin del estudio, visita 3 4.9 Glicemia (mg/dL) X X Colesterol total (mg/dL) X X Colesterol LDL (mg/dL) X X Colesterol HDL (mg/dL) X X Triglicéridos (mg/dL) X X PCRu (mg/L) X X CK (U/L) X X TSH ( mlU/L) X GOT (U/L) X X GPT (U/L) X X Aislamiento y cuantificación del DNA genómico El DNA se aisló usando el método de precipitación por NaCl, estandarizado por nuestro grupo de trabajo. Este consistió en la hemólisis y posterior centrifugación de la muestra de sangre para separar los glóbulos rojos del plasma y poder extraer el DNA presente en los núcleos de las células de la serie blanca. En el anexo 1 se describe el protocolo completo de la extracción del DNA genómico. La concentración de DNA resultante se determinó espectrofotométricamente en cubetas de cuarzo a partir de la absorbancia a 260 nm. La pureza del DNA se evaluó a través de la formula: (A260/A280) > 1,6, tomándose un valor óptimo entre 1,8 y 2,0 para esta relación. 22 4.10 Estandarización de la concentración de Magnesio en la reacción de PCR para la amplificación del gen de la HMGCR En la Figura 6 se observa el efecto de la concentración de Mg2+ en la mezcla del PCR, quedando para el protocolo una concentración final de 1,5 nM. 0,5 1 1,5 2 nM Figura 6. Estandarización de concentración de Mg2+ en la amplificación por PCR del gen de la HMGCR. Utilización de diferentes concentraciones de Mg, en la reacción de PCR para la amplificación del gen de la HMGCR. 4.11 Genotipificación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n en el gen de la HMG- CoA reductasa Para la genotipificación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n presente en el intrón 2 del gen que codifica para la enzima HMG-CoA reductasa (ver Fig. 7), se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de acuerdo al protocolo de Lalovic y col (167). La estandarización comenzó con la verificación de la concentración de los partidores y de magnesio. La mezcla final de reacción consistió en mezclar 1 μL de solución de DNA con 2 μL de cada uno de los partidores; primer R: 5´CAGAGTGACACTCTGTCTCC-3´ y primer F: 5´CATGTTCCATCCATGTCTGC-3´, en concentraciones de 5 μM, 0.75 μL de MgCl2 50 mM, 4 μL tampón10x PCR, 0.5 μL de solución que contiene cada uno de los deoxinucléotidos 10 mM, 0,4 μL de Taq polimerasa y 16,35 μL de agua nanopura en un volumen final de 25 μL. Luego se utilizó la técnica de PCR, cuyas condiciones fueron: 35 ciclos de denaturación del DNA a 94ºC por 30 seg., alineamiento a 57°C por 30 seg. y elongación a 72ºC por 30 seg., seguido por un ciclo de extensión final de 7 min a 72ºC. Los productos amplificados se mezclaron con azul de bromofenol, se transfirieron 30 μL a un gel de poliacrilamida al 8% (p/v) en TBE 0,5x y se separaron por electroforesis. El gel se tiñó con bromuro de etidio y los fragmentos se visualizaron bajo luz UV en un transluminador como bandas de 175-193 pb. Siete alelos de 10 a 16 repeticiones están presentes en este fragmento. 23 5´ 3´ (TTA)n Figura 7. Organización estructural del gen HMGCR. Representación estructural del gen humano de la HMGCR. Los 20 exones están representados por barras verticales. En la parte central de la figura se muestra una ampliación del intrón 2, donde se encuentra localizado el polimorfismo (TTA)n. Las puntas de flecha indican la posición aproximada del par de primers para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 4.12 Secuenciación Como control en la determinación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n en el gen de la HMGCG se realizó la secuenciación de un templado, en este caso el templado 5 con el partidor F, el cual correspondía a un paciente homocigoto 10/10, encontrándose que la secuenciación contenía la repetición (TTA)n 10 veces (ver Figura 8). CCCNATTTTCTTCTTTAAATACATGTTNATACGTTTATTGGTAAAATGCAATTTTTTTGC CAGCTTTATTGAGGTATACTTGCACAAAATTTCTATTTTA/TTA/TTA/TTA/TTA/TTA/TTA/ TTA/TTA/TTATTGTTTTGGAGACAGAGTGNTCACTCTGCNGN Figura 8. Secuenciación de un templado amplicado de DNA que contiene repetición TTA. En color rojo se muestra la secuencia de repetición (TTA)10, la cual se utilizó como control. 4.13 Análisis de resultados y estadística Los datos se analizaron mediante los test de Chi- cuadrado o Prueba exacta de Fisher, según lo apropiado en cada caso. Las diferencias en variables continuas se analizaron mediante el test de Student, análisis de varianza o Kruskal Wallis. El test no paramétrico de Kruskal Wallis se usó para determinar las diferencias de cambios desde el basal de variables con distribución no normal. Los resultados se expresan como promedios ± DS, para la PCRu se muestran las medianas. Se consideraron significativos aquellos resultados con valores p < 0,05. 24 4.14 Materiales y equipos Los equipos usados fueron: termociclador Gene Cycler Bio-Rad, Transluminador Vilber Lourmat, cámara vertical para geles de poliacrilamida, centrífuga Heraeus Suprafuge 220, Speedvac, Centrifuga Heraeus 220, termociclador Gene Cycler Bio-Rad, Speed Vac, transluminador Vilber Lourmat, cámara para geles de poliacrilamida Mini Protean® II Cell Bio-Rad. Los compuestos orgánicos e inorgánicos, sales, ácidos y solventes de calidad analítica se adquirieron en Merck. La enzima Taq pol, Taq I, Aci I, dNTPs, MgCl2 y tampón 10x se obtuvieron de Invitrogen. Marcador de DNA escala de 100 bp, de Winkler T. 25 5. RESULTADOS 5.1. Genotipificación del polimorfismo del tipo tandem (TTA)n en el gen de la HMGCoA reductasa Los productos de PCR correspondieron a fragmentos de 175-193 pares de bases que contenían la repetición (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa. Este fragmento contiene 7 alelos, de 10 a 16 repeticiones. Los pacientes se dividieron en tres categorías. El primer grupo tenía dos alelos con más de 10 repeticiones >10/>10 (homocigoto o heterocigoto), el segundo grupo con un alelo de más de 10 repeticiones >10/10 (heterocigoto) y el tercer grupo con los dos alelos con 10 repeticiones 10/10 (homocigoto). La Figura 9 muestra un gel de poliacrilamida, con el polimorfismo (TTA)n del gen HMGCG, de 8 pacientes (carriles 2 a 9). 200 pb 1 2 3 4 10/10 10/10 >10/>10 5 10/10 6 10/10 7 8 >10/>10 10/10 9 10/>10 Figura 9. Electroforesis en gel de poliacrilamida que muestra la separación de los productos de PCR del polimorfismo (TTA)n del gen HMGCR de distintos pacientes. Carril 1: estándar de 200pb. Carrilles 2,3,5,6 y 8 pacientes: homocigotos para ambos alelos 10/10; carriles 4 y 7: pacientes homocigotos >10/>10 y carril 9 heterocigoto >10/10. 5.2. Pacientes del estudio Un total de 94 pacientes se seleccionaron para ingresar a la etapa de screening en el Centro Cardiovascular del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. De ellos, 69 cumplieron con los criterios de inclusión y 25 fueron excluidos. Las principales causas de exclusión de pacientes fueron: niveles de LDL colesterol < 100 ó > 220mg/dL, TG > 400mg/dL e hipotiroidismo. Sesenta y cuatro pacientes completaron el protocolo y 5 se retiraron durante el estudio por: eventos adversos 1 paciente (1,5%), perdidos en el followup 3 pacientes (4,5%) y un 1 paciente (1,5%) por aparición de cáncer pancreático. El diagrama de flujo del estudio se muestra en la Figura 10. De los 64 pacientes que completaron el tratamiento con atorvastina, 51 fueron hombres (80%) y 13 mujeres (20%). 26 Screening n= 94 Reclutados n= 69 Completaron estudio n= 64 Excluidos n= 25 cLDL<100>200mg/dL(n=19) TG > 400 mg/dL (n=3) Mialgias previas (n=1) Hipotiroidismo (n=2) Retirados n= 5 Evento adverso (n=1) Perdidos al follow-up (n= 5) Patología grave (n=1) Figura 10. Diagrama de flujo 5.2.1 Características basales de los pacientes enrolados Las características basales de los 64 pacientes que completaron el protocolo se resumen en la Tabla 2. Los resultados se expresan como promedio ± desviación estándar, número de pacientes (porcentajes), o medianas (rangos). Los pacientes se dividieron en 3 categorías. El primer grupo tenía: dos alelos con más de 10 repeticiones >10/>10 (homocigoto o heterocigoto); el segundo grupo: un alelo con más de 10 repeticiones >10/10 (heterocigoto) y el tercer grupo: dos alelos con 10 repeticiones 10/10 (homocigoto). 27 Tabla 2. Características basales de los pacientes en estudio (TTA)n >10/>10 (TTA)n >10/10 (TTA)n 10/10 (n=22) (n=14) (n=28) P 66 ± 8 0,796¥ 12 (86%) 23 (82%) 0,668§ 76 ± 16 70 ± 13 75 ±12 0,526¥ Índice de masa corporal (Kg/m2) Presión arterial sistólica (mm Hg) 29 ± 5 155 ± 24 26 ± 4 154 ± 28 28 ±3 149 ±22 0,227¥ 0,595¥ Presión arterial diastólica (mm Hg) 88 ± 12 89 ± 18 88 ±9 0,795¥ 21 (95) 13 (93) 27 (96) 0,875§ 5 (23) 3 (21) 9 (32) 0,762§ Dislipidemia 22(100) 14(100) 28(100) Fumadores 3 (14) 4 (29) 1 (4) 0,070§ Historia familiar de CC 8 (36) 4 (29) 17 (61) 0,114§ IAM previo 11 (50) 9 (64) 14 (50) 0,691§ Cirugía de bypass previa 17 (77) 8 (57) 23 (82) 0,242§ 9 (41) 9 (64) 10 (36) 0,228§ 2 (9) 2 (14) 3 (11) 0,886§ Enfermedad Vascular 3 (14) 6 (43) 2 (7) 0,102§ Angina estable 6 (27) 4 (29) 9 (32) 0,939§ Angina inestable 7 (32) 7 (50) 12 (43) 0,529# 13 (59) 9 (64) 14 (50) 0,649§ 1 (5) 1 (7) 5 (18) 0,353§ 15 (68) 7 (50) 17 (61) 0,552# Diuréticos 5 (23) 2 (14) 11 (39) 0,216§ Antagonistas de calcio 5 (23) 2 (14) 2 (7) 0,335§ 11 (50) 13 (93) 26 (93) 0,235 § Colesterol Total (mg/dL) 206,6 ±29 229,1 ±39 213,3 ±37 0,173 ¥ Colesterol LDL (mg/dL) 134,2 ±23 141,4 ±30 137,1 ±34 0,793* Colesterol HDL (mg/dL) 40,8 ± 9 48,7 ± 17 41,1 ±10 0,342* 158,3 ±63 183,3 ±69 175,2 ±86 0,645* 2.6 (0.4 – 20.3) 1.2 (0.1 - 6.8) 2.1 (0.1 - 14.1) 0,267* 44,2 ± 20 53,1 ± 19 48,9 ±23 0,317* 64 ± 8 65 ± 9 Hombres 16 (73%) Peso (Kg) Edad (años) Factores de riesgo CV: Hipertensión Diabetes mellitus Etiología : Angioplastía previa AVE previo Terapia crónica: Inhibidores de la ECA Bloqueadores de receptores de Angiotensina (ARA II) β-bloqueadores Ácido acetil salicílico Laboratorio: Triglicéridos (mg/dL) PCRu (mg/L) F2-isoprostanos (pg/mL) Valores son promedio ± DS, número de pacientes (porcentajes), o medianas (rangos). AVE: Accidente vascular encefálico, IAM. Infarto agudo del miocardio, CC: Cardiopatía Coronaría, ECA: Enzima convertidora de angiotensina, PCRu: Proteína C reactiva ultrasensible, ¥ANOVA, *Kruskal-Wallis rank test. §Prueba exacta de Fisher, #Test Chi-cuadrado 28 Los tres grupos presentaron características basales similares, no observándose diferencias significativas. 5.2.2. Frecuencia alélica de los pacientes participantes en el estudio Como se mencionó anteriormente, los pacientes se dividieron en 3 categorías, >10/>10, >10/10 y 10/10. En la Tabla 3 se muestra la distribución genotípica de los pacientes, observándose que el 44% del total de pacientes pertenecen al genotipo 10/10. Tabla 3. Frecuencia alélica de los pacientes Pacientes con CC (n= 64) (TTA)n (TTA)n (TTA)n >10/>10 >10/10 10/10 N % N % N % 22 34 14 22 28 44 CC: Cardiopatía Coronaria 5.2.3 Condiciones de los pacientes después de un año de finalizado el estudio La Tabla 4 muestra las condiciones de los pacientes después de transcurrido un año de la fecha en que el ultimo participante finalizo el protocolo de tratamiento. En el grupo de pacientes que permanecen el tratamiento con atorvastatina se incluyó a aquellos que consumían la misma atorvastatina utilizada en el estudio, LowDen® (Laboratorios Saval S.A) o atorvastatina genérica. Tabla 4. Condiciones de los pacientes después de un año de finalizado el estudio (TTA)n (TTA)n (TTA)n >10/>10 >10/10 10/10 (n=22) (n=14) (n=28) N Pacientes permanecen en tratamiento con % N % N % 15 68 10 71 13 46 20 91 13 93 24 86 atorvastatina Pacientes vivos Pacientes con nuevos eventos CV Pacientes en control médico 1 5* 1 8* 3 13* 16 80* 9 69* 18 75* * cálculo realizado en base a pacientes vivos, CV: Cardiovascular 29 5.3 Lípidos plasmáticos 5.3.1 Niveles de lípidos plasmáticos basales y después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina, para diferentes polimorfismos (TTA)n, en pacientes con cardiopatía coronaria La Tabla 5 muestra los valores plasmáticos de colesterol total, cLDL, triglicéridos y cHDL, al inicio y después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día. Los valores plasmáticos de cLDL y colesterol total se redujeron significativamente (p < 0,0001); de igual modo que los niveles plasmáticos de triglicéridos (p < 0,05). Estas reducciones se observaron en todos los grupos de pacientes al aplicar la prueba t de Student para datos pareados. La Tabla 5 también muestra que los valores plasmáticos de cHDL no cambiaron significativamente después del tratamiento. Tabla 5. Valores basales de lípidos plasmáticos y después de 8 semanas de tratamiento (TTA)n (TTA)n >10/>10 >10/10 10/10 (n=22) (n=14) (n=28) (TTA)n P Basales Colesterol total (mg/dL) 207±29 229±39 213±37 Colesterol LDL(mg/dL) 134±23 141±30 137±34 Colesterol HDL(mg/dL) 41 ±9 49 ±17 41 ±10 Triglicéridos (mg/dL) 158±64 183±69 175±86 8 semanas Colesterol total (mg/dL) 133±23 155±35 141±30 <0,0001 ¥ Colesterol LDL(mg/dL) 72±17 76±22 76±24 <0,0001 ¥ Colesterol HDL(mg/dL) 40 ±10 46 ±15 42 ±11 NS Triglicéridos (mg/dL) 105±36 146±91 115±62 <0,05¥ Valores son promedio ± DS. ¥ANOVA 30 La Figura 11 muestra los niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total al inicio y después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día. Los pacientes se agruparon de acuerdo al polimorfismo (TTA)n. Los valores plasmáticos de cLDL y colesterol total disminuyeron significativamente (p<0,0001). Al separar los grupos por sexo se observó la misma significancia antes/después del tratamiento. A * * B 250 C o le s te r o l to ta l (m g /d L ) * 150 * * * c L D L (m g /d L ) 200 100 150 100 50 0 >10/>10 >10/10 10/10 50 0 >10/>10 >10/10 10/10 Figura 11. Niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total según polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR. Los pacientes se dividieron en tres categorías >10/>10, >10/10 y 10/10. Panel A: valores plasmáticos cLDL. Panel B: valores para colesterol total. Las barras |negras y blancas indican los valores basales y post tratamiento, respectivamente. Reducciones significativas después del tratamiento para todos los grupos de pacientes en tratamiento, p< 0,0001. 5.3.2 Reducción y porcentaje de cambio desde el basal de lípidos plasmáticos, después de 8 semanas de tratamiento, para diferentes polimorfismos (TTA)n, en pacientes con cardiopatía coronaria. La Tabla 6 muestra la reducción y porcentaje de cambio de los lípidos plasmáticos después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día. No se observaron diferencias significativas en los lípidos plasmáticos al comparar las reducciones alcanzadas al final del tratamiento entre los tres grupos de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n, con valores de p iguales a 0,890 y 0,979 para cLDL y colesterol total, respectivamente. 31 En relación al porcentaje de cambio en el colesterol total y cLDL, los test estadísticos mostraron que esta respuesta no fue diferente al comparar los cambios alcanzados al final del tratamiento entre los tres grupos de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n, con un valor de p = 0,743 para cLDL y p = 0,117 para colesterol total. Al separar los grupos por sexo, no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de cambio entre los tres grupos de pacientes, para cLDL y colesterol total. Tabla 6. Reducción y porcentaje de cambio desde el basal de los lípidos plasmáticos Colesterol total Promedio ± SD (mg/dL) Porcentaje Colesterol LDL Promedio ± SD (mg/dL) Porcentaje Colesterol HDL Promedio ± SD (mg/dL) Porcentaje Triglicéridos Promedio ± SD (mg/dL) Porcentaje (TTA)n (TTA)n >10/>10 >10/10 10/10 (n=22) (n=14) (n=28) -74 ± 29 -74 ± 28 -73 ± 28 0,979¥ -35,1 -32,3 -33,7 0,117* -63 ± 22 -65 ± 25 -61 ± 24 0,890* -46,1 -45,6 -44,5 0,743* -0.7 ± 7 -3 ± 8 0.7 ± 6 0,216* -1,4 -5,0 2,0 0,292* -53 ± 55 -37 ± 60 -60 ± 71 0,759* -27,0 -20,3 -28,7 0,667* (TTA)n P *Kruskal-Wallis rank test 32 >10/>10 >10/10 10/10 0 -10 -20 -30 -40 -50 >10/>10 B p o rc e n t a je d e c a m b io d e C T d e s d e b a s a l p o rc e n t a je d e c a m b io d e c L D L d e s d e b a s a l A >10/10 10/10 0 -10 -20 -30 -40 Figura 12. Porcentaje de cambio de niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR. En A cLDL, p = 0,743, entre los grupos de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n. En B, colesterol total (CT), p = 0,117, entre los grupos de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n. 5.4 5.4.1 Proteína C reactiva ultrasensible y F-2 isoprostanos Reducción y porcentaje de cambio de los niveles de proteína C reactiva ultrasensible y F-2 isoprostanos después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina para diferentes polimorfismos (TTA)n en pacientes con cardiopatía coronaria. Los cambios de PCRu y F-2 isoprostanos por atorvastatina se muestran en la Tabla 7. Al final de las 8 semanas de tratamiento, los niveles de PCRu se redujeron significativamente para los pacientes de los grupos >10/>10 y 10/10, respectivamente (p < 0,05). El grupo de pacientes >10/10 no mostró reducción significativa. Los niveles de F-2 isoprostanos disminuyeron significativamente en relación a los valores basales (p <0,001). Los test estadísticos mostraron que esta respuesta no fue diferente al comparar los promedios y porcentajes de cambio alcanzados al final del tratamiento entre los tres grupos de pacientes con diferentes polimorfismos (TTA)n, con un valor de p = 0,406 para PCRu y p = 0,542 para F-2 isoprostanos. 33 Al separar los grupos por sexo se observó la misma significancia antes/después del tratamiento para los grupos >10/>10 y 10/10, para PCRu. Para F-2 isoprostanos se muestra la misma significancia antes/después del tratamiento para los pacientes de todos los grupos, al separarlos por sexo. No hubo correlación de Pearson para F-2 isoprostanos con pacientes fumadores y ex fumadores. Tabla 7. Reducción y porcentaje de cambio de los niveles de proteína C reactiva ultrasensible y F2-isoprostanos PCRu (mg/L), mediana (rango) F2-isoprostanos (pg/mL) Porcentaje (TTA) >10/>10 (n=22) -1,2 ± 6,4 (TTA) >10/10 (n=14) -0,3 ± 2,4 (TTA) 10/10 (n=28) -0,9 ± 3,9 p value 0,8 (-18,2 a 19,0) 0,2 (-2,3 a 6,6) 0,5 (-11,5 a 12,5) -21 ± 18 -23 ± 21 -25 ± 25 -41,9 -38,2 -44,9 0,406* 0,542* Valores son promedios de cambio ± SD. Para PCRu mediana (rango. PCRu: Proteina C reactiva ultrasensible * test Kruskal-Wallis 5.4.2 Distribución de PCRu La Tabla 8 muestra la distribución de la PCRu antes y después del tratamiento. Los pacientes se agruparon por polimorfismo y sub-dividieron por valores de PCRu ≥ 2 y <2 mg/L. De acuerdo al estudio PROVE IT- TIMI 22, el valor límite en el cual la PCR, aumenta el riesgo de re-infarto o muerte por causa cardiovascular, es 2mg/L, ello justifica nuestra clasificación. Los resultados se expresan en porcentaje de pacientes. Tabla 8. Distribución de PCRu (TTA)n (TTA)n (TTA)n >10/>10 >10/10 10/10 (n=22) (n=14) (n=28) % % % ≥2 <2 ≥2 <2 ≥2 <2 Pre- tratamiento 33 67 62 38 48 52 Post- tratamiento 57 43 15 85 70 30 Pacientes con CC (n= 64) PCRu: Proteína C reactiva ultrasensible. 34 5.5 Índice de masa corporal y peso de los pacientes del estudio La Figura 13 muestra los valores de índice de masa corporal (IMC) y peso de los pacientes participantes del estudio. No se observaron cambios significativos en los tres grupos de pacientes después del tratamiento. B A 30 80 70 60 20 Kg K g /m 2 50 40 30 10 20 10 0 0 >10/>10 >10/10 10/10 >10/>10 >10/10 10/10 Figura 13. Valores de índice de masa corporal y peso de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR. Los pacientes se dividieron en tres categorías >10/>10, >10/10 y 10/10, En A, valores de índice de masa corporal. En B, valores para peso corporal. Barras negras y blancas indican los valores basales y post tratamiento, respectivamente 5.6 Tolerabilidad e evaluación de la seguridad en la utilización de atorvastatina, como medicamento del estudio No se observaron efectos adversos relacionados con el fármaco del estudio, tales como molestias gastrointestinales, dolores musculares o efectos hepáticos. La evaluación de la seguridad se realizó midiendo de manera basal y al final de las 8 semanas de tratamiento los niveles plasmáticos de las enzimas hepáticas GOT y GPT y creatinina quinasa (CK) para evaluar posibles efectos adversos a nivel muscular. Se observaron leves aumentos de CK, GOT y GPT, que se mantuvieron dentro de los rangos normales de laboratorio y no tuvieron significación clínica. Figura 14. La Figura 15 muestra los niveles plasmáticos de GOT y GPT. Los pacientes se separaron según el polimorfismo (TTA)n en el gen HMGCR. 35 A * B * 150 40 C K U /L U/L 30 20 100 50 10 0 Pre Post Pre GOT 0 Post Pre Post GPT CK Figura 14. Valores de GOT, GPT y CK. En Panel A se muestran los valores de GOT y GPT. En Panel B se muestran los valores para CK. Las barras blancas y negras indican los valores basales y de post tratamiento, respectivamente Hubo aumentos significativos, pero sin significancia clínica, después del tratamiento para GOT y GPT. p< 0,05. A B GOT 40 * 35 * * * >10/10 10/10 30 30 25 20 U/L U/L GPT * 20 15 10 10 5 0 >10/10 >10/10 10/10 0 >10/10 Figura 15. Valores de GOT y GPT de acuerdo al polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR. En Panel A se muestran los valores de GOT. En Panel B se muestran los valores de GPT. Las barras blancas y negras indican los valores basales y de post tratamiento, respectivamente Hubo aumentos significativos, pero sin significancia clínica, después del tratamiento para GOT y GPT. p< 0,05. 36 DISCUSION En esta tesis se estudió la asociación entre la reducción del cLDL por atorvastatina y el polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR en pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. También se determinaron los cambios producidos por atorvastatina sobre los niveles de colesterol total, PCRu, F2-isoprostanos y su asociación con el polimorfismo (TTA)n. Los principales resultados fueron: • Se establecieron las frecuencias genotípicas del polimorfismos (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en una muestra de pacientes chilenos portadores de cardiopatía coronaria. • La frecuencia genotípica del polimorfismos (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa fue 34% para el alelo >10/>10, 22% para el alelo >10/10 y 44% para el alelo 10/10. • La magnitud de la reducción de los niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total al final de las 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día, no difirieron entre las variantes genotípicas estudiadas. • El tratamiento con atorvastatina 40 mg/día por 8 semanas produjo reducciones plasmáticas de PCRu y F2-isoprostanos de una manera paralela a la disminución de cLDL. Las estatinas y dentro de ellas la atorvastatina, son uno de los medicamentos más prescritos para el tratamiento de la hipercolesterolemia. Sin embargo se ha observado que existe una marcada diferencia interindividual en su eficacia (171,172). Las variaciones genéticas en el gen de la HMGCR, el blanco directo de las estatinas, han sido poco estudiadas. En la presente tesis se determinó la asociación entre la magnitud de la reducción de los niveles plasmáticos de cLDL por atorvastatina y la presencia del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR, en pacientes con CC. También fueron evaluados los cambios 37 inducidos por atorvastatina sobre los niveles de colesterol total, PCRu y F2-isoprostanos y su relación con el polimorfismo (TTA)n. La frecuencia genotípica del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR, obtenida en esta tesis fue diferente a la observada en otra población. El estudio de Plat y col (170) reportaron en sujetos normales una distribución genotípica de 21% para el alelo >10/>10, 47% para el alelo >10/10 y 31% para el alelo 10/10. Sin embargo en nuestra población la distribución genotípica fue 34%, 22% y 44% para los pacientes de los grupos >10/>10, >10/10 y 10/10 respectivamente. Estos resultados pueden ser explicados por las diferencias étnicas de la población. Estudios previos han indicado que el polimorfismo (TTA)n del tipo número variable de repeticiones en tandem (VNTR) en el gen de la HMGCR se asocia a patologías como la cardiopatía coronaria y la hipercolesterolemia (168, 169). Además se ha reportado que este polimorfismo ha sido estudiado en individuos que consumían ésteres de estanol, compuestos que disminuyen la absorción de colesterol a nivel intestinal. Los resultados de este estudio mostraron una diferencia significativa entre el polimorfismo de repeticiones (TTA)n en el gen de la HMGCR y la absorción de colesterol en respuesta al consumo de los esteres de estanol. (170) En relación al efecto de atorvastatina en la disminución de los lípidos plasmáticos se observó que todos nuestros pacientes disminuyeron significativamente los niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total después de 8 semanas de tratamiento con atorvastatina 40 mg/día. Sin embargo no se encontró una relación entre la magnitud de reducción de los niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total y la presencia de distintos genotipos del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa. En relación a otro polimorfismo en el gen de la HMGCR, resultados controversiales han sido reportados. El estudio clínico PRINCE (Pravastatin Inflammation/CRP Evaluation) describió dos variantes no codificantes que estaban en estrecho linkage disequilibrium (SNPs 12 y 29) y que se asociaban con la magnitud de la respuesta de colesterol total y cLDL frente al tratamiento con pravastatina. Los pacientes portadores del haplotipo constituido por estos SNPs mostraban una menor disminución de los niveles plasmáticos de cLDL que aquellos no portadores (173). Sin embargo la asociación entre estos SNPs en el gen de la HMGCR y la respuesta en la reducción de cLDL no pudo ser reproducida en el estudio de cohorte ACCESS (174). Aparte de los estudios clínicos PRINCE y el ACCESS no hay más estudios farmacogenéticos que hayan investigado los polimorfismos en el gen 38 de la HMGCR y la respuesta a estatinas. En esta tesis se encontraron pequeñas diferencias entre los tres grupos de pacientes de acuerdo al polimorfismo (TTA)n y la magnitud de la reducción de los niveles plasmáticos de cLDL. Cabe destacar que ninguno de los polimorfismos, SNPs o (TTA)n altera la función o expresión del gen HMGCR. Las variantes SNP 12 y 29 están presentes en el intrón 5 del gen y la repetición (TTA)n en el intrón 2 del gen de la HMGCG. Los efectos extralipídicos de las estatinas, incluyen la mejora de la disfunción endotelial, aumento de la biodisponibilidad del oxido nítrico, propiedades antioxidantes, inhibición de la respuesta inflamatoria y estabilización de las placas ateroscleróticas (175). El efecto anti-inflamatorio ha sido relacionado con la PCR, no sólo como un marcador de inflamación, sino también como un participante activo en este proceso patológico inflamatorio. Por otro lado, las estatinas juegan un importante rol en el estrés oxidativo, a través de la inhibición de la producción de F-2 isoprostanos (176). La reducción de los niveles de PCRu y F-2 isoprostanos por estatinas, en el presente trabajo, refuerza los efectos extralipídicos de las estatinas, independientemente del haplotipo de los pacientes. Cabe destacar además que no se encontró correlación entre los niveles plasmáticos de cLDL y PCRu. En conclusión no se encontró una asociación entre la magnitud de la reducción del cLDL y colesterol total por atorvastatina y la presencia de los distintos genotipos del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMGCR en estos pacientes chilenos con cardiopatía coronaria. Esta tesis tuvo algunas limitaciones experimentales que requieren ser consideradas. Primero, se utilizó como tratamiento sólo una estatina, siendo ella atorvastatina, por lo que se debe tener cuidado antes de generalizar estos datos a otras estatinas. Segundo, el diseño del estudio no permitió la evaluación de un efecto dosis-respuesta. Se utilizó una dosis de 40mg, que es una dosis alta, comparada con la dosis rutinariamente utilizada de este medicamento. Por lo que se esperaba una alta respuesta en la reducción de los lípidos plasmáticos, cabe la posibilidad de haber testeado una dosis mas baja, 10 mg que también corresponde a un dosis utilizada en la practica clínica, habríamos obtenido una respuesta mas pobre en la reducción de los lípidos, lo que quizás nos habría permitido observar una respuesta diferencial en la reducción de los niveles de colesterol, dependiendo del genotipo de cada paciente. Es por ello que futuros estudios deberían determinar si esta pequeña 39 diferencia en la reducción de colesterol entre los distintos polimorfismos, podría ser explicada por un ajuste de dosis. Tercero, este estudio tiene un tamaño de muestra relativamente pequeño, que si bien es cierto fue determinado estadísticamente, requiere como cualquier estudio genético ser reproducido en un estudio prospectivo con una cohorte de pacientes más numerosa. También cabe destacar que este estudio se realizó en Santiago de Chile, lo que nos lleva a pensar que todos estos pacientes corresponden a una sola étnia, ya que los apellidos de los pacientes participantes fueron todos de origen español. Y por ultimo mencionar que este estudio farmacogenético se realizó e un sólo centro clínico, por lo que sería de gran importancia entonces, realizar este estudio a nivel multicéntrico, aumentando así el numero de pacientes. Se espera que la información generada en estudios farmacogenéticos, tenga un gran impacto en el área clínica, permitiendo en el futuro la identificación de pacientes susceptibles de obtener el mayor beneficio y el menor riesgo durante un tratamiento farmacológico. 40 CONCLUSIONES 1. Las frecuencias genotípicas del polimorfismos (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa fueron: • 34% para el grupo de pacientes con el polimorfismo (TTA)n, >10/>10 • 22% para el grupo de pacientes con el polimorfismo (TTA)n, >10/10 • 44% para el grupo de pacientes con el polimorfismo (TTA)n, 10/10 2. El tratamiento con atorvastatina 40 mg/día disminuyó significativamente los niveles plasmáticos de cLDL y colesterol total. No se encontró asociación entre la magnitud de la reducción del cLDL y colesterol total por atorvastatina y la presencia de los distintos genotipos del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa. 3. El tratamiento con atorvastatina 40 mg/día redujo significativamente los niveles plasmáticos de PCRu. No se encontró asociación entre la magnitud del cambio de la PCRu por atorvastatina y la presencia de los distintos genotipos del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa. 4. El tratamiento con atorvastatina 40 mg/día también disminuyó los niveles plasmáticos de F2-isoprostanos, no encontrándose asociación entre la magnitud de la reducción de sus niveles por atorvastatina y la presencia de los distintos genotipos del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa. 41 BIBLIOGRAFÍA 1. Murray CJ, Lopez A.D. Global mortality, disability and the contribution of risk factors. Global Burden of Disease Study. Lancet 1997; 349: 1436-1442. 2. Mackay J, & Mensah G (eds). The Atlas of Heart Disease and Stroke. WHO, Geneva, Switzerland, 2004. 3. Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 2002; 420:868-874 4. Szmitko PE et al. Mew markers of inflammation and endothelial cell activation. Circulation 2003; 108:1917-1923. 5. Ross R, Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science 1976; 193:10941100. 6. Wilson PW, D'Agostino RB, Levy D, Belanger AM, Silbershatz H, Kannel WB. 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Transferir 5 ml de sangre total (o 1 ml de concentrado leucocitario) a un tubo cónico de 15 ml y agregar la mezcla de 5 ml de buffer TKM1 con 125 l de Triton X-100 para lisar las células. Esta solución de lisis celular se debe calentar (55°C) previamente por 5 min para disolver el detergente y de esta forma facilitar la interacción del tritón, TKM1 y sangre. 2. Centrifugar a 2200 rpm. por 10 min. a temperatura ambiente. 3. Eliminar el sobrenadante por inversión y conservar el pellet nuclear (pellet pequeño). 4. Lavar el pellet con 5 ml de buffer TKM1. Resuspenderlo suavemente, usar una pipeta pasteur de ser necesario. 5. Centrifugar a 2200 rpm. por 10 min. a temperatura ambiente. 6. Resuspender suavemente el pellet en 800 l de buffer TKM2, usar una pipeta pasteur de ser necesario. 7. Agregar 50 µl de SDS al 10%, mezclar bien. 8. Incubar 10 min. a 55º C. 9. Agregar 300 µl de NaCl 6N (saturado) y mezclar bien, hasta observar la formación de un precipitado de proteínas. 10. Centrifugar a 3500 rpm. por 15 min. a temperatura ambiente. 11. Recolectar el sobrenadante en un tubo de 15 ml por inversión. Descartar el pellet de proteína. 12. Agregar al sobrenadante 2 volúmenes de etanol 100% a temperatura ambiente. Invertir para mezclar. 13. Remover el DNA precipitado con la ayuda de una punta de pipeta y transferirlo a un tubo de 1,5 ml que contiene 1 ml de etanol 70% frio (mantener en hielo). 14. Centrifugar a 12000 rpm. por 5 min. a 4º C (puede ser a temperatura ambiente). 15. Eliminar el sobrenadante, dejar secar el precipitado a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos. 16. Resuspender el DNA en 100 a 500 µl de buffer TE PCR (Tampón Tris-EDTA pH 7.4 (TrisCl 10 mM pH 7,4, baja concentración de EDTA 0,1 mM pH 8) o en NaOH 8mM. 17. Determinar la concentración y pureza del DNA midiendo la absorbancia 260 y 280 nm 58 REACTIVOS: TKM1 TKM2 Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 KCl 10 mM MgCl2 10 mM EDTA 2 mM Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 KCl 10 mM MgCl2 10 mM EDTA 2 mM NaCl 0,4 M Triton X-100 SDS al 10% NaCl 6 M. (saturado) Etanol 100% Etanol 70% Para preparar los buffers TKM1 y TKM2 a partir de las soluciones concentradas: 200 ml de TKM1 2 ml 2 ml 2 ml 0.8 ml 193 ml Tris-HCl 1 M, pH 7,6 KCl 1 M MgCl2 1 M EDTA 0.5 M H2O nanopure autoclavada 50 ml de TKM2 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.2 ml 5 ml 43 ml Tris-HCl 1 M, pH 7,6 KCl 1 M MgCl2 1 M EDTA 0.5 M NaCl 4 M H2O destilada 59 ANEXO 2 CONSENTIMIENTO INFORMADO Centro Cardiovascular Hospital Clínico Dr. José Joaquín Aguirre Universidad de Chile ESTUDIO CLÍNICO INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO DE HMG-CoA REDUCTASA EN LA RESPUESTA HIPOCOLESTEROLEMICA DIFERENCIAL A ESTATINAS EN PACIENTES CON CARDIOPATÍA CORONARIA Antecedentes: el medicamento atorvastatina está indicado en el tratamiento de los niveles elevados de colesterol en la sangre. Actualmente se indica de rutina en pacientes con antecedentes de enfermedad coronaria y diabéticos, incluso si ellos tienen colesterol en rangos normales. Esto se explica por que la atorvastatina tiene otros efectos, además de reducir el colesterol, que benefician a los pacientes con las características mencionadas. Propósito del presente estudio: Se evaluará si hay diferencias en la magnitud de la reducción de colesterol en la sangre, según las características genéticas de los pacientes. Se postula que esta diferencia genética puede determinar una diferente respuesta en la reducción de colesterol. Esto es importante por que en el futuro podríamos ajustar las dosis de los pacientes según la necesidad individual. Que pacientes participarán? Se invitará a participar a pacientes con antecedentes de infarto agudo del miocardio, con antecedentes de angina estable o inestable documentada con coronariografía y pacientes a los cuales se les ha practicado una Angioplastía ó Cirugía de revascularización coronaria y/o pacientes con Diabetes Mellitus que no estén en tratamiento con insulina. Además los pacientes que participen no deben haber recibido tratamiento previo con atorvastatina (u otro fármaco de este grupo denominado estatinas) por lo menos en los dos meses previo al ingreso en este estudio. Procedimiento y seguimiento: Si usted acepta participar, se tomarán muestra de sangre para medir los niveles plasmáticos de colesterol LDL y proteína C reactiva que es un marcador inespecífico de inflamación, además de exámenes generales. Estos exámenes se repetirán después de completar 8 semanas de tratamiento con 40 mg de atorvastina al día. Necesitamos además extraer 10 ml de sangre por una vez para analizar una parte de su DNA o material genético. Para su conocimiento el DNA es una molécula que está en todas nuestras células y que contiene la información de las características genéticas de cada persona. La única molestia que podría causarle la toma de muestra, es la que ocasiona el pinchazo para tomar muestra de sangre. Este estudio no significará gastos para usted. Seguridad del medicamento: Atorvastatina es un medicamento comercializado desde hace años en Chile y el mundo para el tratamiento del colesterol elevado. Entre los efectos adversos se describe que puede producir dolores musculares con una frecuencia cercana al 1%. Se han descrito también en 0,7% de los pacientes una alteración bioquímica hepática, caracterizada por aumento de las transaminasas. Durante el estudio se realizarán exámenes de sangre y evaluaciones médicas, para 60 detectar estas eventuales alteraciones y tomar las medidas que correspondan según la alteración encontrada, teniendo como objetivo siempre la seguridad para el paciente. Confidencialidad: Todos los datos que se obtengan del estudio serán absolutamente confidenciales y su nombre no aparecerá en ningún tipo de publicación Relevancia del estudio. Sus resultados podrían ayudar a identificar en cuales pacientes de nuestra población es necesario utilizar dosis mayores o menores de atorvastatina para lograr el objetivo terapéutico. Los encargados del estudio podrán contestar sus inquietudes. Si persisten dudas adicionales durante el curso del estudio, diríjase a los Dres. Juan Carlos Prieto (6788355) o Marcelo Llancaqueo (6788355). Su participación en el presente estudio es voluntaria. Usted es libre de negarse a participar sin que se modifique en nada la calidad de su atención médica. Este estudio ha sido revisado y aprobado por el Comité de Ética del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. HE LEÍDO Y ENTENDIDO ESTE CONSENTIMIENTO. MIS PREGUNTAS HAN SIDO RESPONDIDAS Y ACEPTO PARTICIPAR EN FORMA VOLUNTARIA Nombre del paciente: ................................................................................................ Cédula de identidad: ................................... Firma: ........................................ Nombre del médico: Dr.:..............................….......................................................... Cédula de identidad: ................................... Firma: ........................................ 61 ANEXO 3 CRF. RECOLECCION DE DATOS. INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO DE HMG-CoA REDUCTASA EN LA RESPUESTA HIPOCOLESTEROLEMICA DIFERENCIAL A ESTATINAS EN PACIENTES CON CARDIOPATÍA CORONARIA CRF RECOLECCIÓN DE DATOS NUMERO PACIENTE INICIALES |___|___| |___|___||___|___| nombre FECHA NACIMIENTO M SEXO F apellido |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa 62 VISITA 1 Semana -1 NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido CONSENTIMIENTO INFORMADO He informado al paciente acerca de la naturaleza, objetivo y riesgos del estudio. El paciente ha aceptado participar en el estudio y ha firmado el consentimiento informado. Fecha de la firma del consentimiento informado |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa CRITERIO DE INCLUSION 1. 2. 3. 4. 5. 6. NO SI Diagnostico de cardiopatía coronaria estable, definida por: • Pacientes con IAM previo • Paciente con antecedentes de angina estable o inestable documentada con coronariografía • Pacientes con Diabetes Mellitus no insulino dependiente • Pacientes con angioplastía previa • Pacientes con cirugía de revascularización coronaria previo Hombres y Mujeres mayores de 18 años. Colesterol LDL en ayunas en un rango de ≥100 y ≤ 220mg /dL Triglicéridos < 400 mg/dL Pacientes que no hayan recibido tratamiento farmacológico con estatinas a lo menos dos meses previo al ingreso al estudio Firma del Consentimiento informado para la participación del estudio ) Si una de las respuestas es NO, el paciente no puede participar en el estudio. CRITERIO DE EXCLUSION 1. 2. 3. Mujeres embarazadas, en periodo de lactancia o en edad fértil sin método contraceptivo Pacientes que hayan sido hospitalizados dentro de los 90 días previos al ingreso del estudio con: síndrome coronario agudo o hayan sido sometidos a procesos de revascularización coronaria Pacientes con CK > 3 LNS 4. Pacientes con hipotiroidismo TSH ≥ 1,5 LNS 5. Diabetes Mellitus insulino dependiente 6. Con cuadros inflamatorios o infecciosos interecurrentes 7. Disfunción hepática y/o renal, definido por los siguientes parámetros de laboratorio, GOT o GPT≥ 2 veces el LNS y creatinina sérica > 2.0 mg/dL. Tratamiento con fármacos de conocida interacción con atorvastatina 8. 9. 10. 12. Antecedentes de intolerancia o hipersensibilidad a atorvastatina Evidencia de enfermedades gastrointestinales que limiten la absorción de los medicamentos Enfermedades terminales o que determinen una reducida sobrevida a corto plazo Pacientes con limitaciones para comprender la naturaleza del estudio 13. Antecedentes de dependencia a alcohol o drogas 11. ) Si una de las respuestas es SI, el paciente no puede participar en el estudio. NO SI NA VISITA 1 Semana -1 NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido DATO DEL PACIENTE Talla |___|,|___|___| mt Peso |___|___|___|,|___| Kg FACTORES DE RIESGO CARDIOVASCULAR NO Fuma cigarros (actualmente) SI Si es SI, numero de cigarros/día |___|___|___| EX fumador Si es EX, hace cuantos años |___|___| Antecedentes familiares Padre o familiar de primer grado de sexo masculino con IAM o muerte subita antes de los 55 años NO SI Madre o familiar de primer grado de sexo femenino con IAM o muerte subita antes de los 65 años NO SI Hipertensión Arterial diagnostico NO SI Fecha de |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa 2 IMC( Peso/ Talla ) Sobrepeso (IMC 25-30) Obesidad (IMC > 30) NO NO SI SI Diabetes Mellitus tipo II NO SI Dislipidemia NO SI SIGNOS VITALES Efectuar la evaluación con el paciente en posición sentado PAS |___|___|___| mmHg permanezca PAD |___|___|___| mmHg Se tomara una vez que el paciente sentado por 5 minutos Frecuencia Cardiaca |___|___|___| latidos/min VISITA 1 Semana -1 NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido TRATAMIENTO FARMACOLOGICO EN PREVENCION SECUNDARIA El paciente esta en tratamiento con medicamentos de prevención secundaria ? NO calcio SI Si es SI, especifique Aspirina IECA Antagonistas β bloqueadores ARA II PATOLOGIA / COMORBILIDAD RELEVANTE El paciente tiene alguna patología concomitante? Si es SI, especifique NO SI Fecha diagnostico Patología 1. ___________________________________________ En terapia?* |___|___|/|___|___| NO |___|___|/|___|___| NO |___|___|/|___|___| NO |___|___|/|___|___| NO |___|___|/|___|___| NO SI 2. ___________________________________________ SI 3. ___________________________________________ SI 4. ___________________________________________ SI 5. ___________________________________________ SI mm aa TRATAMIENTO CRONICO CONCOMITANTE Anotar todos los medicamentos que el paciente esta actualmente consumiendo o ha consumido en los últimos 30 días Nombre comercial del medicamento Número administraciones/día Dosis total diaria Indicación* 1. __________________________ _____________ ______________ ____________________________________________________ 2. __________________________ _____________ ______________ ____________________________________________________ 3. __________________________ _____________ ______________ ____________________________________________________ 4. __________________________ _____________ ______________ ____________________________________________________ 5. __________________________ _____________ ______________ ____________________________________________________ * La indicación debe corresponder a una de las patologías concomitantes descritas en “PATOLOGIA /COMORBILIDAD/RELEVANTE” VISITA 1 Semana -1 NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido EXAMEN FISICO Normal Anormal Observación 1. Apariencia general ____________________________________________________ 2. Piel ____________________________________________________ 3. Cabeza ____________________________________________________ 4. Ojos ____________________________________________________ 5. Cuello ___________________________________________________ 6. Tórax ___________________________________________ 7. Abdomen ___________________________________________________ 8. Extremidades ___________________________________________ 9. Músculo esquelético ____________________________________________________ 10. Neurológico Firma Dr. _______ Fecha __________________________________________ |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa VISITA 2 – Semana 0 NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido EXAMENES DE LABORATORIO Antes de la iniciación del estudio, para confirmar los criterios de exclusión. cLDL Fecha examen |___|___|___| mg/dL |___|___|/|___|___|/|___|___| ) Si ≤ 100 o ≥ 220 mg/dL el paciente no puede ser incluido Glicemia en ayunas |___|___|___| mg/dL Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| Creatinina ) CK Fecha examen |___|,|___|___| mg/dL |___|___|/|___|___|/|___|___| Si > 2 mg/dl el paciente no puede ser incluido Fecha examen |___|___| U/L ) GPT |___|___|/|___|___|/|___|___| Si > 3 respecto al limite normal superior el paciente no puede ser incluido Fecha examen |___|___| U/L |___|___|/|___|___|/|___|___| ) Si ≥ 2 respecto al limite normal superior el paciente no puede ser incluido GOT Fecha examen |___|___| U/L |___|___|/|___|___|/|___|___| Dd mm aa ) Si ≥ 2 respecto al limite normal superior el paciente no puede ser incluido Test de embarazo Fecha examen ) Si es positivo el paciente no puede ser incluido |___|___|/|___|___|/|___|___| EXAMENES DE LABORATORIO Efectuados en Visita 1 Colesterol total Fecha examen |___|___|___| mg/dL |___|___|/|___|___|/|___|___| Colesterol HDL Fecha examen |___|___|___| mg/dL |___|___|/|___|___|/|___|___| Triglicéridos Fecha examen |___|___|___| mg/dL |___|___|/|___|___|/|___|___| TSH Fecha examen |___|___|___| mlU/L |___|___|/|___|___|/|___|___| SIGNOS VITALES Efectuar la evaluación con el paciente en posición sentado PAS |___|___|___| mmHg latidos/min Firma Dr. PAD |___|___|___| mmHg _______ Frecuencia Cardiaca Fecha |___|___|___| |___|___|/|___|___|/|___|___| Dd mm aa VISITA 3 – Semana 8 NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido CUMPLIMIENTO DEL TRATAMIENTO N° comprimidos entregados |___|___| N° comprimidos retornados |___|___| Días de tratamiento |___|___| Cumplimiento del tratamiento |___|___|___| % DATOS DEL PACIENTE Peso Circunferencia Cintura |___|___|___|,|___| Kg |___|___|___| cm SIGNOS VITALES Efectuar la evaluación con el paciente en posición sentado PAS |___|___|___| mmHg permanezca PAD |___|___|___| mmHg Se tomara una vez que el paciente sentado por 5 minutos Frecuencia Cardiaca |___|___|___| latidos/min EXAMENES DE LABORATORIO Glicemia en ayunas |___|___|___| mg/dL Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| Colesterol total |___|___|___| mg/dL Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| Colesterol LDL |___|___|___| mg/dL Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| Colesterol HDL |___|___|___| mg/dL Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| Triglicéridos |___|___|___| mg/dL Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| Creatinina |___|,|___|___| mg/dL Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| CK |___|,|___|___| U/L Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| GOT |___|___|___| U/L Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___| GPT |___|___|___| U/L Fecha examen |___|___|/|___|___|/|___|___ Dd mm aa aa VISITA 3 – Semana 8 NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido EVENTO ADVERSO Presento algun evento adverso durante este periodo NO SI Si es SI, especifique_________________________________________________________________________ Firma Dr. _______ Fecha |___|___|/|___|___|/|___|___| Dd mm aa EVENTO ADVERSO VISITA _____ NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido Diagnostico (si no esta disponible describir los síntomas) _____________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ Duración del evento Inicio dd mm Leve Intensidad Término |___|___|/|___|___|/|___|___| Relación con el fármaco en estudio |___|___|/|___|___|/|___|___| aa dd Moderado mm aa Severo Probable No- pobable Ninguna Acción Interrupción temporal del tratamiento con el fármaco Retiro definitivo de la terapia Tratamiento del evento con medicamentos Otro, especificar ___________________________________________________ Mejoría Resultado Empeoramiento Ningun cambio Muerte ) Evento Adverso Serio* Desconocido / perdido del follow-up Muerte NO SI Hospitalización NO SI Aumento del tiempo de hospitalización NO SI Causa invalidez/incapacidad grave o prolongada NO SI Evento adverso serio* * Si en uno de los siguientes criterios es “SI ” enviar la información dento de las siguientes 24 horas a los Comité de Ética correspondientes. Firma Dr. _______ Fecha |___|___|/|___|___|/|___|___| dd mm aa EVENTO ADVERSO VISITA _____ NUMERO PACIENTE|___|___| FECHA VISITA |___|___|/|___|___|/|___|___| dd INICIALES PACIENTE |___|___||___|___| Nombre apellido mm aa