1 TITULO: OBTENCIÓN DE MATERIALES DE REFERENCIA DE TRABAJO EN EL INSTITUTO FINLAY AUTORES: Brenda Serrano, Argentina Cruces, Mario Landys, Tania Barrios, Ivis Ontivero, Tatiana Mahy, Niurka Gutiérrez, Lucy Herrera, Patricia Hernández, Deborah Cisneros. INSTITUCIÓN: Instituto Finlay RESUMEN La preparación, caracterización e identificación de Materiales de Referencia (MRs) es un elemento esencial en la implementación y el mantenimiento de un sistema de mediciones coherente y de aplicación universal. Un MR es un material o sustancia de la cual una o más propiedades están suficientemente bien establecidas para ser usadas en diversas funciones de medición relacionadas con la calibración de instrumentos, métodos de evaluación y en la asignación de valores. Los MRs deben ser adecuados para el uso específico que fueron concebidos y los mismos deben reunir requisitos indispensables para su uso: ser suficientemente homogéneos, deben ser estables por un espacio de tiempo aceptable bajo condiciones reales de almacenamiento, transportación y uso, deben estar constituidos por matrices similares a la de las muestras y requieren de una rigurosa caracterización que permita establecer el valor real de la propiedad de interés y su intervalo de incertidumbre. Debido al alto costo en el mercado mundial de los Materiales de Referencia Internacionales o Certificados (MRC) y a la escasa disponibilidad de MRs comerciales que se ajusten a nuestras producciones y permitan un adecuado control de calidad, se hizo necesario la preparación y caracterización de Materiales de Referencia de Trabajo (MRT), que estuvieran a la disposición de todos los laboratorios de nuestra Institución, garantizando la confiabilidad y exactitud en las determinaciones realizadas. El presente trabajo describe de forma general la metodología a seguir para la preparación y caracterización de los Materiales de Referencia de Trabajo necesarios en el control de Calidad de nuestro Instituto. 2 INTRODUCCIÓN La preparación, caracterización e identificación de Materiales de Referencia (MRs) es un elemento esencial en la implementación y el mantenimiento de un sistema de mediciones coherente y de aplicación universal. Se define como MR un material o sustancia de la cual una o más propiedades están suficientemente bien establecidas para ser usadas en diversas funciones de medición relacionadas con la calibración de instrumentos, métodos de evaluación, control de calidad de productos y en la asignación de valores a otros materiales (1). Es por esto que el proceso de producción de los MRs debe ser llevado a cabo usando métodos de medición bien caracterizados, que tengan una alta exactitud y precisión y que suministren valores trazables a las unidades fundamentales de medición, siempre que sea posible. Cada propiedad de interés de un MRT ha sido establecida y determinada con una incertidumbre bien definida, por lo que este valor es usado como un valor de referencia para propósitos de intercomparación o de transferencia. Los MRs deben ser adecuados para el uso específico que fueron concebidos y los mismos deben reunir requisitos indispensables para su uso: ser suficientemente homogéneos para que los valores propios medidos en una porción del lote puedan ser aplicados en cualquier otra porción dentro de limites aceptables de incertidumbre y tanto el MR como sus valores propios deben ser estables por un espacio de tiempo aceptable bajo condiciones reales de almacenamiento, transportación y uso (2). Los MRs pueden estar constituidos fundamentalmente por matrices químicas o biológicas. Dentro de las matrices químicas podemos encontrar las sustancias obtenidas con un alto grado de pureza, las cuales se adquieren mediante la compra de reactivos químicos comerciales (Ej.: Seroalbumina Bovina (BSA), Cloruro de Acetilcolina, Tiomersal) y las matrices biológicas, constituidas por productos derivados de organismos biológicos tales como sustancias liberadas por microorganismos y sueros obtenidos a partir de la inmunización de animales. Los MRs se pueden clasificar en materiales de referencia Químicos (MRQ) o Biológicos (MRB) sobre la base de la naturaleza del ensayo en que serán empleados. Los Materiales de Referencia Certificados son aquellos MRs donde uno o más de sus valores propios son certificados por un procedimiento técnicamente válido, acompañado de un certificado u otra documentación trazable, la cual es expedida por un órgano de certificación (3). Esto implica un proceso de producción exhaustivo y riguroso, generalmente a largo plazo y de alto costo. Debido al alto costo en el mercado mundial de los Materiales de Referencia Internacionales o Certificados (MRC) y a la escasa disponibilidad de MRs comerciales que se ajusten a nuestras producciones y permitan un adecuado control de calidad, se hizo necesario la 3 preparación, caracterización e identificación de Materiales de Referencia de Trabajo (MRT), que estuvieran a la disposición de todos los laboratorios de nuestra Institución y de otras adyacentes, que garantizaran la confiabilidad y exactitud en las determinaciones realizadas. Estos MRT se caracterizan exhaustivamente y se hacen trazables a MRC o a patrones de referencia internacionales, en la medida de lo posible, reduciendo los indicadores económicos por la compra de los mismos y el tiempo de producción y asegurando la calidad de nuestras producciones. El presente trabajo describe de forma general la metodología a seguir para la preparación, caracterización e identificación de Materiales de Referencia de Trabajo empleados en el control de Calidad de nuestra Institución. Preparación, caracterización e identificación de los MRT Para la preparación de un MRT se tuvieron en cuenta las siguientes etapas: Obtención de la Materia Prima Activa (MPA), Control de Calidad de la MPA, Proceso de Formulación y Llenado y Proceso de Liofilización. Obtención de la Materia Prima Activa: La MPA se obtiene a partir de la solicitud directa al área de producción (Ej. Vesículas de membrana externa de Neisseria Meningitidis, Polisacáridos capsulares, Toxoides, etc.); mediante la compra de reactivos comerciales (BSA, Cloruro de Acetilcolina, Tiomersal) y por la obtención de antisueros mediante la inmunización de determinadas especies animales (suero hiperinmune de ratón, conejo y curiel inmunizados con VAMENGO-BC®, vaxTyVi® y vax-TET® respectivamente). Los volúmenes del material obtenido deben ser suficientemente grandes para garantizar la realización de 200-300 unidades por lote como mínimo. Control de Calidad de Materia Prima Activa: Una vez recibida la MPA se selecciona bajo condiciones asépticas la cantidad de muestra necesaria para la realización de los respectivos ensayos de control de calidad y se verifica el grado de cumplimiento en el material de partida de los parámetros de calidad definidos en las especificaciones. La materia prima activa para ser utilizada en la formulación de los lotes de MRT debe pasar los ensayos de control de calidad necesarios y los resultados de los mismos deben ser satisfactorios según las especificaciones de cada MPA. Si esto se cumple se procede a la formulación del lote a partir de la misma. Proceso de Formulación y Llenado: Los materiales de envase utilizados para todos los lotes de MRT producidos son bulbos de vidrio neutro, clase hidrolítica I y de fondo plano, tapones de goma y sellos de aluminio. Los materiales de envase, así como la cristalería necesaria y las misceláneas son esterilizados y el proceso se realiza 4 estrictamente bajo condiciones asépticas, en áreas con presión y temperatura controladas o en gabinetes de seguridad biológica (GSB) calificados. Se efectúa la formulación del lote, teniendo en cuenta el ajuste de la materia prima a la concentración o actividad requerida, utilizando el disolvente adecuado de acuerdo al tipo de Material de Referencia que se formula. Para esto se realizan los cálculos correspondientes, de acuerdo al material en cuestión y utilizando como valor de referencia el estimado de la característica de interés obtenido en el ensayo de control de calidad de la MPA. Previo al proceso de llenado se somete el material a una agitación lenta y moderada durante 15 minutos en agitador magnético evitando la formación de espuma. Las unidades del lote se enumeran consecutivamente a medida que se realiza el proceso de llenado, al igual que los contenedores metálicos que contienen los bulbos del MRT. Se dispensa un volumen de muestra suficiente para la realización de un solo ensayo. El llenado se realiza de forma automática o manual, utilizando un dispensador-dilutor automático o una pipeta automática de volumen adecuado respectivamente y previamente calibrados. Finalmente se identifica el conjunto de frascos con el nombre del MRT, su código como candidato a MRT y la fecha de preparación del lote. Precisión del llenado: La imprecisión del llenado se realiza con el objetivo de determinar la variación existente entre los bulbos durante el proceso de llenado. Para esto se tiene en cuenta el número de unidades que integran el lote y se selecciona del 1-2 % del total de bulbos (4). Esto se evalúa a través del coeficiente de variación (CV) existente entre las muestras seleccionadas aleatoriamente y el mismo debe dar un valor menor del 1% para la aceptación del lote. Los bulbos se seleccionan aplicando la herramienta de generación de números aleatorios que brinda el Programa Excel. Estos bulbos son tarados con el tapón de goma, previo al llenado, en una balanza analítica y se llenan a lo largo del proceso, alternando con el resto de los frascos del lote. Al final se pesan nuevamente y se calcula el contenido del producto por la diferencia entre el peso final y el peso inicial. Se obtiene el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación de estos valores. Para nuestros MRT obtuvimos valores de coeficiente de variación menores del 1 % en todos los casos, tanto en los procesos de llenado con dispensador automático como en aquellos donde se realizó el llenado manual. Proceso de Liofilización: Generalmente las formas liofilizadas le confieren mayor estabilidad a los productos biológicos en el tiempo (5). Por lo general se recomienda la liofilización de los Materiales de Referencia siempre que la sustancia en cuestión no sufra alteraciones durante el proceso. Entre los MRT liofilizados de mayor estabilidad podemos mencionar los MRQ (Acetilcolina, Seroalbumina Bovina, Polisacárido C) y los MRB (Antitoxinas y Toxinas Tetánicas y Diftéricas). En la mayoría de los casos los 5 lotes de MRT fueron liofilizados a continuación del proceso de llenado, en una sesión de trabajo y respetando la ubicación de los frascos en los contenedores metálicos. En aquellos casos donde el número de unidades es muy grande y no es posible liofilizar el lote en un mismo proceso se considerará como un lote diferente. Los parámetros de congelación y secado para la ejecución del proceso de liofilización son específicos de cada MRT y estos deben ser estrictamente controlados por el personal encargado de realizar esta operación. Estudio de Homogeneidad: Un material es aceptado como homogéneo con respecto a una característica dada, si la diferencia entre el valor de esta característica de una parte o unidad a otra no puede ser detectada experimentalmente. La técnica escogida debe medir de forma eficiente una característica relacionada con la homogeneidad del o los componentes de interés del material bajo estudio (6). Para el desarrollo del estudio se toman 12 muestras del MRT escogidas aleatoriamente. Se realizan de 2-3 réplicas de cada muestra, teniendo en cuenta que el tamaño de la misma sea suficiente para estos fines. El método a emplear debe lograr una precisión igual o mejor que la del ensayo en el que se pretende usar el material de referencia candidato.Todos los bulbos seleccionados son evaluados en condiciones de repetibilidad, siempre que el número de muestras que es posible analizar en cada tipo de ensayo lo permita. En aquellos casos que no se cumpla lo anterior se aplica un diseño anidado. Una vez obtenidos los resultados se realiza el procesamiento estadístico de los resultados para determinar la homogeneidad del lote (7). La prueba de homogeneidad da positiva en aquellos casos donde no se encuentran diferencias significativas desde el punto de vista estadístico entre los bulbos. Esto se evalúa a partir del valor de probabilidad (p) correspondiente al efecto de los bulbos. Para los MRT donde se obtiene un valor mayor o igual que 0.05, el material se considera suficientemente homogéneo. Si por el contrario, p es menor que 0.05, desde el punto de vista estadístico existen diferencias significativas entre los bulbos. En este caso, se determina si estas diferencias son intrascendentes con relación al uso previsto para el material de referencia. En caso contrario el lote debe desecharse por falta de homogeneidad (7). Estudio de Caracterización: Existen diferentes vías técnicamente válidas para la caracterización de un material de referencia. Estas incluyen la caracterización por uno o más métodos involucrando uno o varios laboratorios. Dependiendo del tipo de material de referencia, de sus requisitos para el uso final, de la calificación de los laboratorios involucrados y de la calidad del método seleccionado, se escoge una de las vías como más apropiada. Debido a la poca disponibilidad de MRC y que los MRT son usados en otros laboratorios de forma rutinaria es necesario la realización de un estudio interlaboratorio para la caracterización. Este estudio tiene como principio que 6 los laboratorios sean igualmente competentes en la determinación de las características del MRT para proporcionar resultados con una exactitud aceptable. En aquellos casos en donde se disponga de un MRC, este se utiliza para la asignación de unidades al MRT. Cada media de laboratorio es considerada un estimado de la característica del material. Usualmente la media de los laboratorios se asume como el mejor estimado de esta característica (6). Se selecciona el método de ensayo necesario para la realización del estudio de caracterización. En aquellos MRT donde se selecciona más de un método de ensayo para determinar una característica de interés se tuvo en cuenta que tuvieran principios claramente diferentes. Se toma la cantidad de muestra suficiente para la realización de seis ensayos independientes, por duplicado. Se ejecuta el número de determinaciones indicado por tipo de MRT, incorporando en la evaluación el MRT en uso y/o aquellos Materiales de Referencia Certificados primarios o secundarios ya sean internacionales, regionales, de fabricantes reconocidos e incluso de trabajo. Se identifican los laboratorios que realizan las diferentes técnicas relacionadas con cada tipo de MRT específico y se selecciona el analista de mayor experiencia en cada uno de los laboratorios. Se confecciona un protocolo específico de caracterización para cada tipo de MRT y este es entregado a todos los laboratorios participantes en el estudio. Cada laboratorio realiza igual número de determinaciones y evalúa igual número de muestras. Los datos obtenidos por cada laboratorio son sometidos a un análisis estadístico para determinar el valor de la característica de interés estudiada y la incertidumbre de la caracterización (8). Para el procesamiento estadístico de los resultados se elabora una tabla resumen con todos los resultados. Se le realiza la prueba de normalidad a todos los datos y en aquellos casos donde se rechaza la hipótesis de normalidad se analizan las causas de este comportamiento y la posibilidad de aplicar alguna transformación para hacer normales los valores. Se eliminan los valores detectados como atípicos, si existen, por cada laboratorio. Se le realiza las pruebas de homogeneidad de varianzas y de las medias para detectar si existen diferencias significativas entre los laboratorios incluidos en el estudio. Se determina el valor de caracterización como el promedio de las medias por laboratorio y su incertidumbre. Una vez concluida la etapa anterior se comprueba el desempeño del nuevo MRT en el sistema de ensayo correspondiente, utilizando para esto el MRT en uso y las muestras controles. Se realizaron 3 determinaciones como mínimo y se verificaron los criterios de aceptación del MRT y del ensayo en cuestión. Posteriormente se confecciona un gráfico de control de valores individuales para el seguimiento de la estabilidad del MRT considerando la media y la desviación estándar calculada con los datos de caracterización. 7 Determinación de la humedad residual: Esto solo se aplica para los MRT que se conserven en forma liofilizada. El resultado del ensayo no debe exceder el 5 %. Se escogen 10 muestras al azar del MRT y se les determina la humedad residual mediante el método de Karl Fisher (9). Todos los lotes de MRT preparados cumplieron con este criterio. Estudio de la hermeticidad: Se realiza con el objetivo de garantizar que exista una hermeticidad total en los bulbos liofilizados, logrando de esta forma estabilidad e integridad en la pastilla liofilizada durante su conservación. El criterio de aceptación de este ensayo es que se mantenga la coloración original del material liofilizado. Si se observa coloración azul de la pastilla liofilizada, indica falta de hermeticidad, implicando el rechazo del bulbo. Se realiza mediante la inmersión del total de los bulbos en una solución indicadora de bromofenol azul al 0.1 % por un período de tiempo de 10 minutos (2). En los lotes analizados de MRT se obtuvo que todos los bulbos pasaron la prueba satisfactoriamente. Puesta de prueba del MRT: Este estudio tiene como objetivo evaluar los MRT en los laboratorios consumidores de los mismos y en las condiciones de ensayo especificas de cada uno. El MRT que se encuentra en uso y el de nueva producción en estudio deben asegurar un adecuado desempeño del método de ensayo. Los lotes de MRT son puestos a prueba en los diferentes laboratorios y se evalúa su desempeño mediante la utilización de muestras controles. Posteriormente se comparan los valores obtenidos de estas muestras con el MRT en uso y con el nuevo y se verifica la existencia de diferencias significativas entre los mismos. Esto nos permite establecer el buen funcionamiento del MRT y verificar la estimación de la característica de interés y su incertidumbre. Este procedimiento se realiza durante los primeros 3 ensayos para pruebas biológicas y los primeros 10 ensayos para las pruebas químicas e inmunoquímicas. Estudios de estabilidad: El uso de los estudios de estabilidad tiene como objetivo determinar si el MRT mantiene su valor de referencia durante el tiempo de producción y hasta el momento de ser usado. La frecuencia de estos ensayos depende del riesgo que presente el material de sufrir cualquier cambio con el transcurso del tiempo. Para llevar a cabo estudios de estabilidad es necesario tener en cuenta diferentes aspectos como son el método de ensayo, la selección del número de muestras, condiciones de ensayo, frecuencia de ensayo y procesamiento estadístico. En todos los estudios de estabilidad se toma como criterio de aceptación que el valor obtenido a una temperatura y tiempo determinado no muestre variaciones significativas con respecto al valor de referencia y/o se encuentre dentro de la incertidumbre de la medición. Los estudios de estabilidad comprenden la estabilidad acelerada y el estudio de vida de estante. 8 Estabilidad Acelerada: El estudio de estabilidad acelerada se lleva a cabo cuando se produce un MRT de nuevo tipo para recomendar las condiciones óptimas de su manipulación y transportación. Además se realizan en aquellos MRT que no tienen historia confiable sobre la estabilidad de los lotes precedentes. Primeramente se identifica la propiedad de interés del MRT, teniendo en cuenta su valor estimado y la incertidumbre correspondiente, para que estos valores sirvan como punto de referencia. Se selecciona el mismo método de ensayo utilizado en la caracterización y las temperaturas del estudio según la naturaleza del MRT (10).Se seleccionan 3 muestras por cada lote de MRT estudiado para evaluarlas por duplicado, por cada temperatura y tiempo de estudio. Esto se realiza en paralelo con las muestras controles conservadas a la temperatura óptima de almacenamiento del MRT. Las muestras son identificadas cuidadosamente e incubadas a las temperaturas establecidas en equipos previamente calibrados y fijados a la temperatura específica. Estabilidad de vida de estante: El estudio de vida de estante se lleva a cabo a la frecuencia de muestreo establecida de cada material. Se seleccionan las muestras aleatoriamente y se realizaron 3 ensayos por cada tiempo, a razón de 3 muestras por cada ensayo evaluadas por duplicado. El ensayo se realiza bajo condiciones similares a las que se emplean en la caracterización del MRT. Algunos MRT muestran pérdida de actividad o degradación imprevista en los estudios de estabilidad de vida de estante que se realizan periódicamente. Ante este comportamiento, se investigan las causas más probables con el objetivo de descartar la posibilidad de errores analíticos en los ensayos realizados durante el estudio. Identificación de MRT: Los lotes de MRT deben tener una adecuada identificación para facilitar su localización y distribución a los laboratorios consumidores, por esto se deben etiquetar una vez que se concluyan todas las etapas de caracterización y procesamiento estadístico. La etiqueta debe reflejar el nombre del centro elaborador, nombre del MRT, identificación del lote, fecha de fabricación, valor estimado de la característica de interés, volumen por frasco y temperatura de conservación. Para la oficialización del MRT una vez concluidas las fases de caracterización, de estabilidad y de puesta a prueba del MRT se elabora un certificado de ensayo de Materiales de Referencia y el mismo debe acompañar al producto cada vez que este sea distribuido. El certificado contiene la siguiente información: nombre del MRT, número de lote, fecha de fabricación, origen de la materia prima, descripción del MRT, método de preparación, uso, valor estimado de la característica de interés, incertidumbre del valor estimado y las instrucciones para su uso. 9 CONCLUSIONES El presente trabajo estableció la metodología del proceso de obtención de los MRT involucrados en las diferentes producciones del Instituto Finlay. Además se describieron los aspectos fundamentales de cada etapa con sus correspondientes análisis estadísticos. BIBLIOGRAFÍA 1. NC ISO Guía 30. Términos y definiciones usados en relación con los materiales de referencia. 1998. 2. OMS. Comité de Expertos en Patrones Biológicos. Pautas para la preparación, caracterización y establecimiento de Patrones Biológicos Internacionales y reactivos de Referencia. Serie de Informes Técnicos No. 800 (1990). 3. NC ISO Guía 35. Certificación de Materiales de Referencia. Principios Generales y Estadísticos. 1998. 4. CECMED. Regulación 22-2006. Certificación de Materiales de Referencia para Medicamentos. 2006. 5. Showman, John W. Downstream Processes: Equipment and techniques, pages 315-351, 1988; Alan R Liss, Inc. 6. Brookman B. y cols. 1998. Guidelines for the in-house production of reference materials. Version 2. LGC/VAM. 7. Linsinger. T y cols. 2001. Homogeneity and stability of reference materials. Accred Qual Assur. 6: 20-25. 8. 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