TECNOLOGÍA DE CONGELACIÓN DEL ESPERMA PORCINO

TECNOLOGÍA DE CONGELACIÓN DEL ESPERMA PORCINO
(PURSEL ET AL., 1975; WESTENDORF ET AL., 1975)
´
´
´
Selección
S l ió cuidadosa
id d
de
d los
l verracos “buenos
“b
congeladores”
l d
” y calidad
lid d de
d
las dosis seminales
Recogida de la fracción rica sobre 100 cc de diluyente comercial (BTS,
MR-A) y después se completa a dilución 1:2 con diluyente a 32 ºC
Diluyentes para congelación
«
«
«
«
«
´
Periodo de equilibrado
q
«
´
«
«
«
«
75
Ha de ser rápida, con el fin de pasar el punto crítico en el menor tiempo posible
Para ello el semen a 5 ºC debe dejarse caer sobre nieve carbónica o incidir sobre
el mismo vapores de nitrógeno líquido (a unos 5 cm sobre el nitrógeno líquido)
para posteriormente
t i
t almacenarse
l
en nitrógeno
it ó
lí id
líquido
Presentación (envase)
«
«
«
´
Para proceder a la dilución es preciso eliminar total o parcialmente el plasma
seminal.
i l Para
P
ello
ll se centrifuga
if
10 minutos
i
(3 min.)
i ) a 800 g (2.400
(2 400 g)) en
centrífuga refrigerada a 15 ºC y después se elimina el sobrenadante
La dilución se hace con diluyente
y
a 15 ºC ((se añade hasta 3 cc p
por dosis de
lactosa-yema) y después se equilibra por 2 h a 5 ºC.
A continuación se añade lactosa-yema + glicerol + OEP hasta 5 cc.
Congelación
«
´
El espermatozoide de verraco precisa recubrirse de una capa proteica que actúe
como agente crioprotector en el momento de la congelación, para lo cual es
preciso de 3-4 h (1h a 22-23 ºC y 2 h a 15 ºC)
Centrifugación-Dilución
«
´
sustancias energéticas
g
(glucosa,, fructosa,, lactosa))
(g
crioprotector (glicerol)
proteínas (yema de huevo o leche)
Aditivos (detergente sintético Amino-Na-Lauryl Sulfato conocido como Orvus
Es paste-OEP)
Presión osmótica: alrededor de 400 mOsm/Kg
En pajuelas de 0,25
0 25-00,55-5-6
5 6 ml o en envases planos plásticos (pet
(pet-flat
flat bags)
congelados en vapores de nitrógeno líquido con capacidad de 2,5-5 ml.
Las dosis utilizadas deben contener como mínimo 3-5-6 x 109 espermatozoides
(
(I.A.
convencional)
i l) (disminuye
(di i
ell número de
d dosis
d i por eyaculado)
l d ) (1
( x 109
esper. en IA intrauterina profunda)
El coste de estas dos
dosiss es 33-4 veces eel de laa dos
dosiss refrigerada
e ge ada
Descongelación
«
«
«
La Tª y el tiempo de descongelación es determinante para la viabilidad y
capacidad de fecundación de los espermatozoides
Ha de realizarse rápidamente, introduciéndose las dosis directamente desde el
nitrógeno líquido al baño María a 42 ºC
C (50 ºC
C, 37 ºC)
C) durante 40-45 (12,
(12 30)
segundos y a continuación verter el contenido sobre 60-70 ml (80, 30) de
diluyente de refrigeración (mejor específico) (tipo ACROMAX, MR-A THAW®,
BTS) a 15 ºC (37 ºC)
Hay que seguir rigurosamente las instrucciones indicadas por el fabricante de la
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dosis
´
´
´
´
´
´
´
´
´
´
´
´
Técnica aplicada en el INIA (modificación de Wenstendorf et al, 1975)
Obtención de la fracción espermática del eyaculado
Dilución 1/3 con diluyente de refrigeración a 32ºC
Equilibración durante 90 minutos a temperatura ambiente (20 – 22ºC)
Equilibración a 15
15ºC
C durante 120 minutos
Centrifugación a 800 x g durante 10 minutos en viales con 5 x 109 spz
Eliminación del plasma seminal
Dilución hasta 33,5
5 ml con Lactosa – Yema (A)
Equilibración durante 120 minutos para disminuir a 5ºC
Dilución hasta 5 ml con Lactosa-Yema + glicerol + OEP (B)
C
Congelación
l ió inmediata
i
di t en pajuela
j l de
d 6 mll en vapores de
d nitrógeno
it ó
a una altura
lt
de 5 cm., durante 20 minutos
Introducción en nitrógeno liquido
D
Descongelación:
l ió
«
«
Introducir las pajuelas en baño Maria a 42ºC durante 40 segundos
Añadir la dosis de 5 ml a 45 ml de medio de conservación (dilución 1/10)
Composición de Lactosa – Yema (A):
«
«
«
Lactosa ........................... 8,8 g.
Agua destilada
destilada................ hasta 80 ml
Yema de huevo .............. 20 ml
Composición de Lactosa – Yema + glicerol + OEP (B):
«
«
«
Lactosa – yema ............... 93,5
93 5 ml
O.E.P............................… 1,5 ml
Glicerol ………………… 5 ml
77
(1975)
(agente regulador
del pH)
< 3 % de glicerol
(1975)
(agente detergente)
Hasta el 50 % resultan dañados
Píldoras (100 microlitros)
100-200 pajuelas por eyaculado de 0,5 ml con una
concentración de 1 x 109 espermatozoides (IA intrauterina
profunda)
f d )
Maxipajuelas (5 ml) o pajuelas de 0,5 ml
(Gómez Rincón et al., 2008)
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Tasa
fecundidad
Prolificidad
Semen
refrigerado
80-90 %
11-12
Semen
Congelado
40-70 %
9-10
(Bolarín et al., 2006)
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Causas que originan esta disminución en los resultados reproductivos:
- Cambios estructurales y funcionales de los espermatozoides
- Viabilidad disminuida de los espermatozoides en el tracto genital de la hembra
- Producción de espermatozoides con menor viabilidad
• Marcadores de congelabilidad
Posible utilización de los bancos de semen (Rubalcaba et al., 2003):
- Contingencia por motivos sanitarios
- Transporte de material genético a larga distancia
- Trabajos de recuperación de razas en extinción
- Baja temporal de los machos por problemas diversos
(ver tabla)
(Conde et al., 2003)
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- Marcadores moleculares de congelabilidad: algunos transportadores de
membrana (GLU-3) o de proteínas (HSP90), algunos enzimas (SOD)
- Marcadores no moleculares: LIN y STR
Bonet et al., 2009)
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TÉCNICAS DE APLICACIÓN DEL SEMEN
DETECCIÓN DE CELOS: Signos de celo (Palomo Yagüe, 1999)
z
Precelo:
–
–
–
–
–
z
la cerda está muy nerviosa y prueba a montar a sus congéneres
cuando la cerda es montada, no presenta el reflejo de inmovilidad
la vulva está edematizada-hinchada
las mucosas vulvares están rojas y con una ligera mucosidad pastosa
dura de 2-5 días (menos en nulíparas y primerizas)
Celo verdadero, la cerda se deja montar por el verraco:
–
Primer período de verraco (PV1):
z
z
z
z
–
Período del investigador (PI):
z
z
z
z
z
–
z
z
la cerda no presenta más el reflejo de inmovilidad a las manipulaciones del investigador, pero sí aun para el verraco
la vulva puede permanecer todavía roja
las tasas de fertilidad cuando se insemina en este período son muy bajas.
Postcelo:
–
82
es el período crítico para llevar a cabo la inseminación (en los primeros ¾ partes de esta fase)
la vulva está rosa y no hinchada, sino arrugada, la mucosidad es menos opaca, más acuosa y casi transparente
la cerda presenta el reflejo de inmovilidad tanto para el verraco como para las manipulaciones realizadas por el responsable
en este período, la cerda realiza generalmente un movimiento de orejas a veces muy claro, presentando los ojos saltones
la duración de la fase PI está entre 32-40 h.
Segundo período de verraco (PV2):
z
z
lla vulva
l estáá todavía
d í roja,
j pero menos hinchada
hi h d y con moco opaco
la cerda permanece inmóvil cuando se le comprime los flancos; no siendo así cuando se la oprime el lomo (espalda)
la cerda permanece más tranquila y se deja montar por las compañeras y por el verraco
duración de 8-10 h.
–
–
no hay reflejo de inmovilidad para el investigador ni para el verraco
los signos exteriores de celo son dispares, presentándose a veces una ligera hinchazón de la vulva que por el contrario no
está roja
en esta fase no existe ninguna posibilidad de fecundación.
Detección de celo en la práctica:
- actitud
tit d inquieta
i
i t ((nerviosismo)
i i
)
- vulva hinchada y enrojecida
- emisión de gruñidos característicos
- permite ser montada y monta sobre otras hembras
- búsqueda del macho
- se suele utilizar un verraco adulto recela o estímulos
simuladores del verraco (aerosoles con feromonas)
- posición rígida (lordosis) con las orejas erectas y cola
levantada cuando se las monta (reflejo de inmovilidad).
(Gordon, 1999)
Introducir el macho en grupos de
hembras reducidas
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Cerdas alojadas en celdas individuales y
acceso amplio
li por la
l parte
t trasera
t
que
permita verificar la inmovilidad e inseminar
Pasillo en la parte delantera para
que el verraco de recela pueda
circular
(Quiles y Hevia, 2008)
(Mozo Martín, 2009)
- Conducir a las hembras dudosas o con problemas al corral del macho (incrementa su estimulación)
- Iluminación en las salas destinadas a recela: 16 h luz (350 lux) / 8 h oscuridad
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