fiebre q

CAPÍTULO 2.1.12.
FIEBRE Q
RESUMEN
La fiebre Q (del inglés Query, interrogante) es una zoonosis presente en la mayoría de los países.
El hombre adquiere la infección a partir de los animales, en especial de los rumiantes domésticos.
La fiebre Q es una enfermedad muy infecciosa debida a la multiplicación de Coxiella burnetii, una
bacteria pequeña y pleomórfica que mide 0,3–1,5 µm de largo por 0,2–0,4 µm de ancho. Como se
trata de una bacteria estrictamente intracelular, C. burnetii solo puede crecer en los huevos
embrionados o en cultivos celulares o, cuando es necesario, en animales de laboratorio
inoculados. Se presenta en dos formas antigénicas: la fase patógena I, que se encuentra en los
animales infectados o en el hombre, y la fase avirulenta II, que se obtiene por pases repetidos en
huevos embrionados o en cultivos celulares. Debido a que este microorganismo es
extremadamente peligroso, el manejo de C. burnetii viable debe llevarse a cabo en servicios que
cumplan los requisitos de la OIE para patógenos del Grupo 3 de Contención.
En el hombre, la fiebre Q se presenta como una forma aguda (episodio febril autolimitado,
neumonía, hepatitis) o como una forma crónica grave (endocarditis) después de una infección
inicial que puede pasar desapercibida. La forma aguda se resuelve rápidamente después de una
terapia antibiótica adecuada, pero la manifestación crónica requiere una terapia antibiótica
prolongada (durante 2 años o más), junto a un seguimiento serológico. En algunos países, se
dispone de vacuna para grupos de población potencialmente expuestos por motivos profesionales.
En el ganado, los síntomas de la fiebre Q incluyen aborto, descendencia muerta o debilitada,
retención placentaria, metritis e infertilidad. En los pequeños rumiantes, la fiebre Q está a menudo
asociada a abortos esporádicos o a brotes de abortos seguidos de una recuperación sin
complicaciones. La infección por C. burnetii persiste durante varios años, y probablemente dura
toda la vida. Las ovejas, cabras y vacas son mayoritariamente portadores asintomáticos, pero
pueden liberar cantidades masivas de bacterias en el parto, y de forma intermitente en varias
secreciones y excreciones. Algunos animales domésticos, como perros, gatos, conejos, pájaros,
etc., también son susceptibles a la infección y deben considerarse como fuentes potenciales de
infección para los animales y el hombre.
Identificación del agente: Para el diagnóstico laboratorial, se pueden tomar muestras de la
placenta, de descargas vaginales y del hígado, los pulmones o el contenido del estómago de fetos
abortados, o de la leche, el calostro o las heces.
La bacteria se puede visualizar mediante tinción en frotis de tejidos mediante un microscopio con
objetivo de inmersión. Debido a que es resistente a los ácidos, se puede teñir por diversos
métodos: el de Stamp, el método modificado de Ziehl–Neelsen, el de Gimenez, el método de
Giemsa, y el método de Koster modificado. Esta detección constituye una prueba presuntiva de
fiebre Q, pero unida a pruebas serológicas, datos clínicos, y en ausencia de otros agentes
infecciosos abortivos, puede ser suficiente para establecer un diagnóstico de la enfermedad en el
rebaño o la explotación.
En la actualidad, se considera que la demostración del agente por inmunohistología usando
anticuerpos específicos o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) resulta más específica
y sensible que los métodos clásicos de tinción. No existen anticuerpos específicos para
inmunoquímica que estén disponibles en el mercado, pero la técnica de la PCR requiere
laboratorios convenientemente equipados. La PCR constituye una prueba útil para diagnosticar un
gran número de muestras y varios tipos de muestras. Además, las muestras se pueden inactivar
por calor, con la consiguiente seguridad para el personal del laboratorio.
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Capítulo 2.1.12. — Fiebre Q
Coxiella burnetii se puede aislar por inoculación de muestras en cultivos celulares convencionales
o en el saco vitelino de huevos embrionados o en animales de laboratorio. La inoculación en
animales de laboratorio (cobaya, ratón, hámster) es útil en los casos en que se requiere el
aislamiento a partir de tejidos contaminados con varios microorganismos o para obtener los
antígenos de Coxiella en fase I.
Pruebas serológicas: El diagnóstico de la fiebre Q se apoya con frecuencia en la serología. Se
pueden usar varias pruebas, en particular la prueba de inmunofluoresecencia indirecta, el
enzimoinmunoensayo, y la prueba de fijación de complemento. Actualmente, hay pruebas
comerciales disponibles que permiten la detección de anticuerpos anti-C. burnetii en fase II. La
presencia de anticuerpos IgG específicos representa una prueba de una exposición a C. burnetii
reciente o pasada.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Se han desarrollado varias vacunas
inactivadas contra la fiebre Q, pero solo deben considerarse como protectoras las que contengan
C. burnetii en fase I o estén preparadas a partir de ella. En áreas densamente infectadas, se
recomienda una vacunación anual repetida, particularmente en el caso de los animales jóvenes.
En Eslovaquia hay una vacuna inactivada de fase I que está disponible comercialmente. Un
estudio reciente ha demostrado su eficacia respecto al aborto y a la diseminación de C. burnetii en
las cabras gestantes que fueron vacunadas experimentalmente y luego infectadas, pero no existe
información sobre su seguridad.
A. INTRODUCCIÓN
La fiebre Q tiene una amplia distribución por todo el mundo, excepto en Nueva Zelanda. Aunque la fiebre Q está
prácticamente presente en todo el reino animal, incluyendo los artrópodos, la enfermedad afecta sobre todo al
hombre, al ganado bovino, al ovino y al caprino (27, 30). El agente etiológico, Coxiella burnetii, es una bacteria
Gram-negativa estrictamente intracelular, adaptada para desarrollarse en el interior del fagolisosoma del fagocito.
Históricamente se ha clasificado dentro de la familia Rickettsiaceae; sin embargo, las investigaciones
filogenéticas basadas principalmente en el análisis de la secuencia del ARN ribosómico 16S indican que el
género Coxiella está distante del género Rickettsia en la subdivisión alfa de las Proteobacterias (60). Ahora
Coxiella burnetii se sitúa en la familia Coxiellaceae en el orden Legionellales de la subdivisión gamma de las
Proteobacterias (26). Recientemente se ha logrado la secuenciación completa del genoma de C. burnetii y se
confirma su posición sistemática (47). A diferencia de las rickettsias, C. burnetii origina una forma semejante al
esporo, pequeña, densa y muy resistente, que es muy estable en el medio ambiente, una característica
importante para su transmisión (31). Esta capacidad se ha atribuido a la existencia de variantes en el ciclo de
desarrollo de C. burnetii: variantes con células grandes (LCV), variantes con células pequeñas (SCV) y células
pequeñas densas (SDC) (10, 17, 48). Las variantes SDC y SDV representan las formas de la bacteria con
mayores posibilidades para sobrevivir extracelularmente como partículas infecciosas. Otra característica esencial
es que C. burnetii tiene dos formas antigénicas: la fase I patógena, aislada de animales o humanos infectados, y
la fase II avirulenta, obtenida in ovo o in vitro. Durante los pases en serie, ocurre un cambio en el LPS
(lipopolisacárido): las células en la fase I, que contienen cadenas O de una longitud completa en el LPS, cambian
a fases intermedias disminuyendo la longitud de las cadenas O del LPS y luego a la fase II, con un LPS
incompleto. La variación de fase del LPS se acompaña de una delección cromosómica permanente que hace
imposible la reversión celular de la fase II a la fase I (56).
La fiebre Q es una zoonosis. En el hombre, la infección presenta una forma crónica aguda y una forma subclínica
(38). En general, las formas agudas incluyen un episodio febril autolimitado, neumonía y hepatitis granulomatosa.
La manifestación clínica principal de la fiebre Q crónica es una endocarditis en pacientes con valvulopatías. Las
complicaciones de la forma aguda pueden ser graves o fatales si no se aplica un tratamiento adecuado con
antibióticos (11). Además, la infección por C. burnetii puede provocar inflamación de la placenta y a menudo
acarrea nacimientos prematuros, limitaciones del crecimiento, aborto espontáneo o muerte fetal en las mujeres
embarazadas (36). La infección es endémica en muchas áreas, originando casos esporádicos o epidemias
explosivas. Su incidencia es posiblemente mayor que la descrita. La epidemiología de la fiebre Q sugiere que la
infección probablemente se transmite por la inhalación de partículas desecadas de aerosol, y a través del
contacto con los animales infectados y sus tejidos reproductores (29, 30). A menudo se ha sugerido la ingestión,
en particular a través del consumo de productos lácteos derivados de la leche sin procesar, e incluso
posiblemente después de ser pasteurizada (16, 38, 53). La fiebre Q se transmite muy raramente de persona a
persona; aunque esto es posible por contagio durante el nacimiento, a través de la transmisión sexual o por
transfusión sanguínea (12, 32). En los animales puede ocurrir una transmisión vertical y sexual, además de a
través de las vías respiratorias y digestivas (25, 58). Los artrópodos, sobre todo las garrapatas, pueden estar
implicados en la transmisión de la fiebre Q.
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Capítulo 2.1.12. — Fiebre Q
En las vacas, las ovejas y las cabras, la fiebre Q se ha asociado fundamentalmente con los abortos tardíos y con
desórdenes tales como los nacimientos prematuros, la muerte o la debilidad de las crías, la metritis y la
infertilidad (27). Sin embargo, las respuestas serológicas en una especie determinada o incluso el aislamiento de
C. burnetii no se correlacionan necesariamente con la expresión de la enfermedad clínica (18, 27, 44). El agente
puede persistir en los animales infectados, eliminarse intermitentemente a través de la leche, las heces y la orina,
y estar presente en la sangre. Puede recuperarse en grandes cantidades en los productos del parto (placenta,
líquido amniótico y feto), y los animales no grávidos representan menor riesgo. Se considera que los reservorios
principales de C. burnetii son los rumiantes domésticos, pero también se ha descrito que los gatos, perros,
conejos, pájaros, etc., pueden estar involucrados en la infección de los humanos (23, 29, 30, 51). Por tanto, los
animales domésticos y silvestres infectados normalmente liberan el agente sin signos visibles de la enfermedad,
y deberían considerarse como posibles fuentes de infección para el hombre.
Con frecuencia, se ha investigado el aborto en rumiantes para determinar si se trata de la fiebre Q, ya que puede
afectar a la salud humana y a la de otros animales. A estos efectos, el diagnóstico de la fiebre Q, y de otras
enfermedades abortivas se ha realizado tradicionalmente sobre resultados de la microscopía de las muestras
clínicas, y si eso se complementa con los resultados serológicos positivos, suele ser normalmente adecuado (27,
41, 43). El diagnóstico de la fiebre Q también resulta necesario para los análisis epidemiológicos de poblaciones
‘de riesgo’ o sospechosas en áreas limitadas (después de brotes recientes en el hombre o en animales), o con
fines comerciales de exportación. No obstante, en la actualidad no se lleva a cabo la identificación de los
eliminadores de C. burnetii ni de los portadores asintomáticos (4, 5, 7, 21).
Cuando varios animales resultan seropositivos, se recomienda, por lo general, una intervención adecuada. Las
medidas se pueden adaptar al contexto epidemiológico y de seroprevalencia concreto. Se debe asegurar una
pasteurización correcta de los productos lácteos (53). Usando hipoclorito sódico al 10%, se puede reducir la
cantidad de agente en el medio con una limpieza regular y la desinfección de las instalaciones animales,
teniendo un cuidado particular en las áreas de parto. Los animales gestantes deben mantenerse en corrales
separados, y las placentas y fetos abortados deben retirarse rápidamente y eliminarse de modo apropiado para
evitar su ingestión por perros, gatos o animales silvestres. Debe evitarse la dispersión del estiércol de granjas
contaminadas en áreas suburbanas y en jardines. Aunque no está evaluada la eficacia de la inactivación de
C. burnetii mediante fermentación por compostaje o por descontaminación mediante el tratamiento químico
(como, por ejemplo, con 0,4% de cianamida cálcica o con cal), estos métodos todavía son recomendables. Para
adquirir y mantener una población de animales libres de Coxiella, se debe reducir la introducción de animales, el
reagrupamiento de rebaños, el contacto con animales silvestres y la infestación por garrapatas. Estos métodos
pueden resultar eficaces para el control de la enfermedad, si bien los animales expuestos pueden continuar
infectados. Aunque se han desarrollado vacunas contra la fiebre Q animal, en la mayoría de los países no están
disponibles comercialmente.
Finalmente, es importante recordar que C. burnetii es muy peligrosa para el hombre, y que son frecuentes las
infecciones en el laboratorio. Debido a su capacidad de causar una enfermedad incapacitadora en grandes
grupos de personas, a su baja dosis infectiva, a su resistencia ambiental, y la ruta de transmisión por aerosoles,
se considera a C. burnetii como un agente potencial de bioterrorismo y está clasificado por la CDC como un
agente del grupo B (9). Deben tomarse las precauciones adecuadas con este agente de grupo de riesgo 3. Los
cultivos vivos o el material contaminado de los animales infectados deben manejarse solamente en instalaciones
que cumplan los requisitos para los patógenos del Grupo 3 de Contención que se indican en el capítulo 1.1.2.
Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los
animales.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Se puede demostrar Coxiella burnetii de varios modos, dependiendo del tipo de muestra y el propósito del
diagnóstico (11, 41, 45). Las muestras deben tomarse lo antes posible en los fetos abortados, la placenta, y en
las descargas vaginales después del parto o del aborto. También se pueden tomar muestras en los tanques de
leche, la leche individualizada o el calostro, y en las heces.
a)
Tinción
En caso de sospechar que un aborto esté causado por una infección, se preparan frotis del cotiledón de la
placenta sobre portas para microscopía (42). Igualmente puede usarse el contenido del pulmón, hígado o
rumen de los fetos abortados o las descargas vaginales. Estas muestras se tiñen siguiendo varios métodos:
los de Stamp, Gimenez, Machiavello, Giemsa y el de Koster modificado (14, 35, 41, 42, 44). Con las tres
primeras técnicas se obtienen los mejores resultados. Estos métodos son similares al de Ziehl–Neelsen
modificado, y se realizan con una solución de fucsina básica para teñir las bacterias. Por ejemplo, el método
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de tinción de Stamp se realiza con una solución de fucsina básica al 0,4%, seguida de una decoloración
rápida con una solución de ácido acético al 0,5%, y haciendo una tinción de contraste con una solución de
azul de metileno o de verde malaquita al 1%. Los frotis se examinan microscópicamente con objetivo de
inmersión (×500 o más aumentos). El método Stamp es el preferido por los laboratorios veterinarios
mientras que el método Giménez se utiliza ampliamente para el diagnóstico en los humanos. El método
Giménez es más rápido de realizar puesto que no incluye una solución ácida para la diferenciación. Coxiella
burnetii se caracteriza por la presencia de un número muy grande de pequeñas bacterias teñidas de rosa
en forma de cocobacilos, destacando sobre un fondo azul o verde. A veces son difíciles de detectar debido
a su pequeño tamaño (0,3–1,5 µm de largo × 0,2–0,4 µm de ancho), pero esto se compensa por su gran
número; a veces aparecen dentro de la célula hospedadora inclusiones como manchas rojizas en un fondo
azul o verde. Se debe tener cuidado con la interpretación de los resultados, ya que se puede confundir
microscópicamente C. burnetii con Chlamydophila abortus o con Brucella spp. Sin embargo, usando el
mismo proceso de tinción, Chamydophila tiene perfiles más definidos, se trata de células ovaladas,
pequeñas y pueden parecer glóbulos. Las células de Brucella spp. son más grandes (0,6–1,5 µm de largo ×
0,5–0,7 µm de ancho), más claramente definidas y se tiñen más intensamente. Se deben de usar portas
con controles positivos de C. burnetii, Chlamydophila abortus y Brucella para su comparación. El
diagnóstico realizado por microscopía, junto a los resultados serológicos positivos, suele ser adecuado a
efectos rutinarios (43). Cuando la tinción biológica no resulte concluyente, se debe utilizar algún otro
método (ver más adelante) como prueba confirmativa.
b)
Métodos de detección específica
También se puede realizar la detección de C. burnetii en muestras por inmunodetección específica
(enzimoinmunoensayo de captura [ELISA], inmunohistoquímica) o por amplificación del ADN (8, 11, 55). La
inmunohistología se puede hacer con tejidos incluidos en parafina o en frotis fijados con acetona (37). El
método consiste en una inmunofluorescencia indirecta o en un ensayo con inmunoperoxidasa usando
anticuerpos policlonales frente a C. burnetii, procedentes de un antisuero bien caracterizado de origen
humano o de un antisuero específico producido en animales de laboratorio (conejo o cobaya). Para
visualizar la bacteria, se usa luego un conjugado anti-IgG obtenido en otra especie (hombre, conejo o
cobaya), que esté marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o con peroxidasa. Para la comparación,
se debe disponer de portas con preparaciones positivas de antígeno de C. burnetii. No existen anticuerpos
específicos para inmunoquímica a nivel comercial.
En la actualidad, se están desarrollando varios métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), que se ha utilizado con éxito para detectar el ADN de C. burnetii en cultivos celulares y en muestras
biológicas. Como es probable que el número de células de C. burnetii sea menor en la leche, en el calostro
o en las heces que en el material derivado de los abortos, la PCR se puede utilizar para analizar esta gran
diversidad de muestras. Antes de realizar la PCR, se pueden inactivar las muestras biológicas
calentándolas a 90°C entre 30 y 60 minutos, dependiendo de la naturaleza, el tamaño o el peso de la
muestra. Esta técnica se puede realizar en los laboratorios debidamente equipados, usando cebadores
derivados de varias dianas, como por ejemplo, una secuencia de inserción de multicopias (número de
acceso M80806), la más de más aceptación de las utilizadas (4, 19). El uso de esos cebadores para la
amplificación de la mencionada secuencia proporciona un aumento de la sensibilidad de la prueba debido a
la presencia de varias copias en el genoma de Coxiella. El nivel de detección de la trans-PCR convencional
depende de las muestras que se utilicen (por ejemplo 1–500 bacteria/ml de una muestra de leche o
1 bacteria/mg de una muestra de heces). Se ha publicado que los otros genes que pueden usarse como
diana en la PCR específica para C. burnetii son: el gen de la superóxido dismutasa (sodB) (número de
acceso M74242); el gen com1, que codifica una proteína de 27 kDa de la membrana externa (número de
acceso AB004712); el operón de choque térmico que codifica dos proteínas de choque térmico (htpA y
htpB) (número de acceso M20482). El isocitrato deshidrogenasa; (icd) (número de acceso AF069035); y la
proteína potenciadora de la infectividad del macrófago (cbmip) (número de acceso U14170). Los diversos
cebadores usados en la PCR se pueden obtener en dos páginas Web (http://ifr48.timone.univmrs.fr/Fiches/Fievre_Q), que son actualizadas de forma periódica por la CNR francesa.
La PCR en tiempo real supone un medio adicional de detección y cuantificación (21, 22, 52). En lo que se
refiere a la PCR convencional, se utilizan varios genes diana: IS1111 (número de acceso M80806); com1
(número de acceso AB004712); e isocitrato deshidrogenasa (icd). A fin de cuantificar las bacterias en
muestras biológicas mediante la utilización de la PCR, se recomienda amplificar una única secuencia
específica. Algunos datos recientes ponen de manifiesto que el número de secuencias de inserción (IS) era
muy variado (entre 7 y 110) dependiendo de los aislamientos (22). Aunque el uso de esta secuencia podría
aumentar la sensibilidad de la prueba, puede que no sirva para obtener una cuantificación exacta.
En el mercado existen kits listos para ser utilizados, y pueden detectar las bacterias en varias muestras. Sin
embargo, existe una necesidad urgente de elaborar un método molecular para determinar la viabilidad
bacteriana, especialmente en las muestras de leche. El desarrollo de una PCR múltiple constituye otra
técnica para ensayar todos los agentes infecciosos abortivos.
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Capítulo 2.1.12. — Fiebre Q
c)
Aislamiento del agente
Para determinadas investigaciones de laboratorio, puede ser necesario aislar el agente. Cuando el examen
microscópico revela un gran número de células de C. burnetii y un bajo nivel de contaminación con otras
bacterias, es posible el aislamiento directo por inoculación de huevos de gallina embrionados o de cultivos
celulares (18). Por ejemplo, se homogeneiza una porción de la placenta en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) que contenga antibióticos (100–200 µg/ml de estreptomicina y 50–100 µg/ml de penicilina o
gentamicina). Después de centrifugar a baja velocidad, se inoculan diluciones del sobrenadante en huevos
de gallina embrionados de 5 días a través del saco vitelino. Preferiblemente, los huevos deben ser de
gallinas libres de patógenos específicos (SPF). Se desechan los embriones que mueren durante los
primeros 5 días después de la inoculación. Los sacos vitelinos se recogen después de 10–15 días de
incubación. Los frotis del saco vitelino teñidos se examinan para comprobar la ausencia de contaminación
bacteriana y para determinar la presencia de C. burnetii. Para confirmar la presencia de C. burnetii, se
puede utilizar un análisis por PCR. Se pueden necesitar varios pases para obtener un aislamiento en cultivo
puro.
Para aislar bacterias estrictamente intracelulares, o intracelulares facultativas, incluyendo a C. burnetii, se
ha adaptado un sistema de microcultivo celular disponible comercialmente para el cultivo del virus: el vial
cerrado de cultivo celular1.Tal método se describió en 1990 para C. burnetii (11, 39). Se inoculan
suspensiones de la muestra en fibroblastos de pulmón de embrión humano (células HEL) que se cultivan
sobre un cubre de 1 cm2 dentro de un vial cerrado. La centrifugación a 700 g durante 1 hora favorece la
fijación y la penetración de la bacteria en las células. Para la misma muestra se utilizan tres viales cerrados,
y los días 3, 10 y 21 se examina el efecto citopático (ECP) – es decir, las vacuolas características de
C. burnetii en las células HEL – mediante un microscopio invertido. En el cubre dentro del vial cerrado se
puede realizar directamente a los 10 días la detección de C. burnetii creciendo en el interiror de las células,
por medio de un ensayo de inmunofluoresencia directa con anticuerpos policlonales anti-C. burnetii y un
anticuerpo apropiado anti-especie conjugado con FITC. Las células del último vial cerrado se recogen y se
transfieren a un recipiente de cultivo de 25 cm2. Se puede incubar durante 3 meses, cambiando el medio de
cultivo una vez a la semana. La infección puede seguirse mediante la microscopía de las células
centrifugadas de un sobrenadante del cultivo y teñidas por la tinción de Gimenez y análisis por PCR del
sobrenadante del cultivo. Cuando las observaciones del ECP y las de la tinción de Gimenez, o los
resultados de la PCR son positivos, se realiza un pase a un recipiente de cultivo de 75 cm2. Luego se
inocula el sobrenadante en capas confluentes de células Vero o de células L929 de fibroblastos de ratón en
un recipiente de cultivo de 150 cm2 para establecer un aislamiento de C. burnetii. Este método fue
desarrollado para el caso de los humanos pero podría adaptarse para los animales (50).
Con muestras muy contaminadas, como las derivadas de la placenta, descargas vaginales, heces o leche,
puede ser necesaria la inoculación en animales de laboratorio. Se recomiendan los requisitos del nivel 3 de
biocontención para manipular a los roedores infectados de forma experimental (véase el capítulo 1.1.2.
Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones
de los animales). Los animales más apropiados a tal efecto son los ratones y los cobayas (45). Se controla
la temperatura corporal y el estado de anticuerpos después de la inoculación intraperitoneal de una dosis
de 0,5 ml por animal. Este método debería realizarse siempre en paralelo con las pruebas serológicas en
otros cobayas o ratones que se hayan inoculado con las mismas muestras. Si aparece fiebre, se sacrifica el
animal y se recoge el bazo para aislar el agente por inoculación en huevos de gallina embrionados o en
cultivos celulares. El examen microscópico de C. burnetii se lleva a cabo utilizando frotis y tinciones de los
bazos recogidos. Alternativamente, se puede realizar la PCR en los bazos recogidos sistemáticamente a los
7–9 días después de la inoculación (8).
Aunque la caracterización de los aislamientos parece necesaria para comprender la variable epidemiología
de la fiebre Q en diferentes áreas geográficas, no existen en la actualidad métodos diferenciadores de tipos.
A este respecto, los esfuerzos deberían ir dirigidos a la elaboración de métodos para la tipificación genética.
Los métodos de alta resolución para la tipificación molecular que se elaboran y evalúan actualmente
resultan ser prometedores para el avance de la catalogación de los clones y los estudios de rastreabilidad
de los contactos. Los estudios en que se utilizan la tipificación mediante multi-espaciadores (15) y los
patrones de repetición alternativa de nucleótidos (2, 54) han puesto de manifiesto elevados niveles de
resolución entre los aislamientos de C. burnetii. Se han descrito técnicas para la genotipificación de
C. burnetti.
2.
Pruebas serológicas
Entre las diversas técnicas que pueden emplearse, las tres más usadas son: la técnica de inmunofluorescencia
indirecta (IFI), el método ELISA y la prueba de fijación del complemento (FC) (11). En el diagnóstico rutinario ya
no se emplean las tres pruebas serológicas más antiguas: la técnica de microaglutinación, la prueba de
1
Sterilin, Bibby Sterilin Ltd, Stone, Staffordshire ST15 O5A, Reino Unido.
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Capítulo 2.1.12. — Fiebre Q
aglutinación capilar y la prueba de hemólisis indirecta. Se ha evaluado también una prueba de aglutinación con
partículas de alta densidad (HDPA) (33). Los ensayos serológicos son adecuados para analizar las poblaciones,
pero la interpretación a nivel del animal individual puede resultar difícil. Los animales pueden permanecer
seropositivos durante varios años después de una infección aguda, algunos pueden liberar C. burnetii y suponer
un riesgo de infección antes de desarrollar anticuerpos, y otros animales infectados no parecen sufrir
seroconversión (1, 6, 8). Los títulos serológicos de corte se indican más adelante; la interpretación de los
resultados requiere el uso de al menos, diez animales (abortados o no). Para establecer la presencia de la
infección, se necesita tanto la respuesta serológica como la evidencia de las bacterias.
a)
Prueba de la inmunofluorescencia indirecta
En medicina humana, el método de referencia para el serodiagnóstico de la fiebre Q es la prueba IFI
adaptada como una técnica de microinmunofluorescencia (11, 57). El procedimiento se puede adaptar para
realizar un ensayo de inmunoperoxidasa. Se dispone de algunos antígenos comerciales adecuados para
uso en la FC, pero son preferibles los antígenos preparados para el diagnóstico en los humanos (11). Se ha
demostrado que este método de preparación suministra antígenos con la sensibilidad más alta para
detectar anticuerpos frente a C. burnetii. En resumen, se utilizan antígenos de C. burnetii tanto de la fase I
como de la fase II; el antígeno de la fase II se obtiene creciendo la cepa de referencia C. burnetii Nine Mile
(ATCC VR 615) en cultivo celular, mientras que el antígeno de la fase I se obtiene del bazo de animales de
laboratorio inoculados con C. burnetii en la fase II en cultivos celulares. En la población en fase II aún
pueden estar presentes unas cuantas células en fase I y pueden ser seleccionadas y propagadas en de los
animales. El antígeno se diluye, se hace gotear en los pocillos de un porta de vidrio para microscopio, se
deja secar y se fija con acetona. Las dos formas de la infección, la aguda y la crónica, presentan perfiles
serológicos distintos: durante la fiebre Q aguda, los anticuerpos IgG aumentan solo contra la fase II,
mientras que durante la fiebre Q crónica se observan niveles elevados de anticuerpos IgG contra las fases I
y II de la bacteria (57). Además, se pueden comprar a suministradores portas con pocillos antigenados con
antígeno de fase II, o de fases I y II de C. burnetii. Estos se pueden adaptar cambiando el conjugado
humano por un conjugado adaptado a la especie animal.
Se colocan diluciones dobles del suero a ensayar en un porta para inmunofluorescencia que contenga
previamente uno o los dos antígenos. Si existen anticuerpos específicos, se fijan al antígeno en el porta. La
formación de este complejo se detecta luego en un microscopio de fluorescencia después de la adición del
conjugado fluorescente que reconoce las inmunoglobulinas de esa especie.

Preparación del antígeno
El antígeno debe prepararse en dependencias que cumplan los requisitos para los patógenos del Grupo de
Contención 3, como se describe en el capítulo 1.1.2. de este Manual.
Coxiella burnetii Nine Mile en fase II se cultiva en monocapas confluentes de células Vero o L929 en
recipientes de cultivo de 150 cm2 con el medio mínimo esencial (MEM) al que se añade glutamina 2mM y
4% de suero fetal bovino. La infección se sigue mediante el examen microscópico de las células que se
recogen de la parte inferior de los recipientes después de teñirlas por el método de Giménez. Cuando se
observa una gran infección por C. burnetii, se centrifugan individualmente los sobrenadantes de
15 recipientes (5.000 g, 15 minutos), se resuspenden en 1 ml de PBS con formaldehído al 0,1% y se
mantienen 24 horas a 4°C. Después de juntar los sedimentos, se lisan por sonicación las células que
queden. Los restos celulares se eliminan mediante dos centrifugaciones sucesivas (cada una a 100 g,
10 minutos). A continuación, la suspensión de 15 ml se centrifuga en 20 ml de PBS con 25% de sacarosa
(6.000 g, 30 minutos sin interrupción). El sedimento resultante se lava tres veces en PBS (6.000 g,
10 minutos), se resuspende en el menor volumen posible de agua destilada estéril y se ajusta por
espectroscopía de luz UV a 2 mg/ml. Se añade un conservante antibacteriano, como azida sódica a una
concentración final del 0,1% o tiomersal al 0,01%. El antígeno preparado de este modo se congela a –20°C.
Para obtener antígeno correspondiente a la fase I, se inoculan ratones con la cepa de C. burnetii Nine Mile
crecida en células (principalmente en fase II). Nueve días después se extraen los bazos. Cada uno se
disgrega en 7,5 ml del MEM y se inocula en tres recipientes de cultivo de 75 cm2 con monocapas de células
L929 o Vero (2,5 ml por recipiente). La amplificación de la fase I de C. burnetii se lleva acabo durante
4 semanas, cambiando el medio de cultivo una vez por semana. Después se recogen las células infectadas
y se purifican las bacterias como se describió anteriormente (principalmente en fase I).
La producción de antígeno también puede hacerse cultivando C. burnetii en huevos embrionados SPF. El
microorganismo se inocula en el saco vitelino de huevos embrionados de 5–6 días de edad, y se recogen a
los 12–15 días después de la muerte del embrión. Los sacos vitelinos infectados tienen un color amarillento
pajizo característico. Los no infectados son de color naranja y presentan una consistencia viscosa.
Cualquier embrión que muera entre los 5 y 10 días de incubación se elimina. La cepa usada en la
inoculación de los huevos es una dilución al 1/100 de un homogeizado de saco vitelino en PBS con
penicilina (500 Unidades Internacionales/ml) y estreptomicina (0,5 mg/ml). Los sacos vitelinos se juntan y se
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.1.12. — Fiebre Q
homogenizan con tres partes de PBS. La suspensión se inactiva durante 24 horas a 37ºC con formaldehído
al 1,6%. El sobrenadante lipídico se desecha. La suspensión se centrifuga luego a una velocidad moderada
(unas 500 g) durante 30 minutos. Se elimina el sobrenadante, se añade más PBS y se repite la
centrifugación. La suspensión final se diluye con PBS. Se añade azida sódica o tiomersal como
conservante antibacteriano. En los homogeneizados de los sacos vitelinos suspendidos en PBS, se
comprueba la abundancia de C. burnetii y la ausencia de contaminantes bacterianos mediante el examen
microscópico de un frotis sobre un porta y la tinción por el método de Stamp. Para obtener antígeno de fase
I, se puede propagar C. burnetii recogida de material del bazo de animales de laboratorio infectados, ya que
estos extractos se transfieren a continuación a sacos vitelinos, pues la cantidad de células en fase I es
todavía alta hasta el sexto pase en el vitelo (EP6).
Es suficiente realizar la titulación del antígeno con al menos tres sueros diferentes conocidos (con título alto,
moderado y bajo, respectivamente) para disponer de la dilución apropiada para otros ensayos de
inmunofluorescencia.

Material y reactivos
Microscopio equipado con fluorescencia, incubador con humidificador, pila de lavado.
Se necesitan portas adecuados para el antígeno. Este puede prepararse en el laboratorio o comprarse a un
proveedor (véase más arriba). El método descrito está adaptado de la preparación comercial de BioMérieux
a título de ejemplo. Los portas preparados contienen 12 pocillos por porta, cada uno de 7 mm de diámetro,
recubiertos con antígeno de fase II obtenido de cultivos en células Vero y pueden guardarse a 4ºC o a
–20°C.
Conjugado fluorescente concentrado, para ser diluido cuando sea necesario con PBS + azul de Evans al
1%, a las diluciones recomendadas por la casa comercial.
PBS, glicerina tamponada, colorante azul de Evans en solución al 1%.

Procedimiento de la prueba
i)
Se inactiva el suero problema durante 30 minutos a 56°C, y luego se diluye en PBS de 1/40 a 1/640.
ii)
Se deja que los portas recubiertos con el antígeno tomen la temperatura ambiental. No deben tocarse
los pocillos.
iii)
Se añaden a los pocillos 20 µl de cada dilución de suero. Se añaden sueros de control positivo y
negativo. A un pocillo, se añaden como control de antígeno 20 µl de PBS.
iv)
Se incuba en una cámara húmeda 30 minutos a 37º C. Se lava el porta dos veces con PBS durante
10 minutos cada vez. Se lava con agua destilada y se deja secar al aire.
v)
Se añaden a los pocillos, incluyendo los de los controles, 20 µl de conjugado dirigido contra la especie
apropiada (por ejemplo, los anticuerpos obtenidos en conejo contra IgG [H+L] de cabra u oveja
marcados con FITC), diluidos en el momento en PBS + azul de Evans. Se incuba en una cámara
húmeda 30 minutos a 37°C, se lava con agua destilada y se seca al aire. Se añaden unas cuantas
gotas de glicerina tamponada y se tapa con un cubre. Se examina en un microscopio de fluorescencia
con aumentos de ×400 o más.

Interpretación de los resultados
Una reacción positiva se manifiesta por la presencia de pequeños puntos brillantes en un fondo oscuro. Hay
que comprobar que el conjugado solo y el control de suero negativo dan un resultado negativo (ausencia de
los pequeños puntos brillantes). La fluorescencia inespecífica suele tomar forma de manchas de tamaño
irregular. El control positivo debe corresponder al título conocido + un orden de dilución.
La reacción se considera positiva si aparece inmunofluorescencia a una dilución 1/160 o mayor. En
medicina humana, este método se utiliza para determinar anticuerpos contra las fases I y II en las
fracciones de IgG, IgM e IgA, lo que permite la diferenciación entre la forma aguda y la crónica de la fiebre
Q. Para eliminar las IgG antes de determinar las IgM e IgA, se usa absorbente de factor reumatoide. El
análisis de los sueros se realiza con antígeno de la fase II, y los sueros positivos se ensayan después para
detectar la presencia de las diferentes clases de Ig dirigidas contra los antígenos de la fase I y la II. No
obstante, ni las respuestas de los anticuerpos a las fases I y II ni las respuestas de las clases de Ig
implicadas se han estudiado con detalle en los animales domésticos.
b)
Prueba de fijación de complemento
Este micrométodo de fijación en frío, semejante al desarrollado por Kolmer, se realiza en placas de
microtitulación con 96 pocillos de fondo cóncavo. Mediante esa prueba, se detecta la presencia de
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.1.12. — Fiebre Q
anticuerpos fijadores de complemento en el suero. Esta prueba de FC es específica, pero menos sensible
que la IFI o el ELISA (11, 34). La seroconversión se detecta por la prueba de FC más tarde que por la
prueba IFI o ELISA, aunque los anticuerpos de FC pueden persistir durante largos períodos después de la
enfermedad y esta prueba da resultados excelentes para diagnóstico rutinario de enfermedades abortivas a
nivel de poblaciones (41, 43). En muchos países la prueba de FC aún es muy utilizada por muchos
laboratorios. Con frecuencia, en este método se utiliza antígeno en fase II preparado a partir de una mezcla
de dos cepas (Nine Mile Henzerling)2 o la mezcla de antígeno en fase I y II preparada a partir de una cepa3
de Nine Mile. En Francia, este método está estandarizado (AFNOR-NFU47-006).
La reacción se hace en dos etapas. Primero se mezcla el antígeno con los anticuerpos fijadores del
complemento, y se añaden eritrocitos de oveja que están sensibilizados por suero anti-eritrocitos de oveja.
Durante el primer paso, la fijación del complemento por el complejo antígeno/anticuerpo no permite la lisis
de los eritrocitos; por el contrario, si no existen anticuerpos fijadores del complemento, el complemento
induce entonces la lisis de los eritrocitos sensibilizados. Por consiguiente, la velocidad de la hemolisis es
inversamente proporcional al nivel de anticuerpos específicos que están presentes en la muestra de suero.

Reactivos
Tampón Veronal/calcio/magnesio (VB), pH 7,2
El sistema hemolítico: Una mezcla a partes iguales de una suspensión de eritrocitos de oveja al 2% en VB y
de suero hemolítico diluido en VB según su título específico.
Complemento: Una preparación comercial liofilizada de suero fresco de cobaya.
Antígeno: Usar antígenos comerciales al título recomendado por el fabricante, si la titulación del antígeno se
realiza por este método.
Controles de suero positivo y negativo.
2
3
8

Pre-titulaciones
i)
Se diluyen los eritrocitos de oveja a una concentración final de 2% en VB.
ii)
Se titula el suero hemolítico en una microplaca: 25 µl de complemento a una concentración hemolítica
conocida (por ejemplo, 1/30); 25 µl de diluciones crecientes de suero hemolítico + eritrocitos de oveja
al 2%. Se incluyen los controles sin complemento. Se incuba 30 minutos a 37°C. Se establecer la
dilución equivalente a 2 unidades hemolíticas.
iii)
Se diluye el antígeno como recomienda el fabricante. El antígeno también puede titularse: se hacen
diluciones crecientes de antígeno (25 µl horizontalmente) y un suero positivo de título conocido (25 µl
verticalmente). Se añaden 25 µl de la suspensión de eritrocitos sensibilizados y se incuba 30 minutos
a 37°C. El título del antígeno es la dilución más alta que produce una reacción positiva con la dilución
más alta del suero. Se debe comprobar la ausencia de actividad anti-complementaria del antígeno a
diferentes diluciones.
iv)
Se titula el complemento en una microplaca: se hacen diluciones seriadas del complemento o del
suero de cobaya en VB, por ejemplo de 1/15 a 1/200. A cada pocillo con 25 µl de esta dilución, se
añaden 25 µl de antígeno y 25 µl del sistema hemolítico. Se incuba 30 minutos a 37°C y se establece
la dilución equivalente a 2 unidades hemolíticas de complemento.

Procedimiento de la prueba
i)
En seis pocillos se hacen diluciones dobles de 1/10 a 1/320 del suero problema inactivado (con el
complemento eliminado) y en otros cuatro pocillos a diluciones de 1/10 a 1/80 para detectar actividad
anti-complementaria (25 µl por pocillo) (pocillos control de suero).
ii)
Se añaden 25 µl de antígeno diluido o 25 µl de VB a los pocillos de control de suero.
iii)
Se añaden 25 µl de complemento a todos los pocillos. Se cubre la placa con una lámina de plástico
adhesivo y se incuba 18 horas a 4°C.
iv)
Se sacan las placas del refrigerador, se deja que alcancen la temperatura ambiente, y se añaden 25 µl
de sistema hemolítico recién preparado. Se incuba a 37°C durante 30 minutos. Se centrifugan las
placas a 500 g durante 5 minutos a 4°C. Se examinan los controles y se leen los resultados.
Dade Behring, Marburg, Germany.
Virion, Zürich, Switzerland
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.1.12. — Fiebre Q

Interpretación de los resultados
Los títulos comprendidos entre 1/10 y 1/40 son característicos de una infección latente. Los títulos de 1/80 o
más, en uno o más sueros de un grupo de cinco a diez animales, revelan una fase evolutiva de la infección.
c)
Enzimoinmunoensayo
Esta técnica presenta una gran sensibilidad y una buena especificidad (11, 40, 59). Es fácil de realizar en
laboratorios que tienen el equipo necesario (un espectrofotómetro) y reactivos. Las pruebas ELISA tienden
a reemplazar a las pruebas IFI y FC como técnicas de referencia porque son adecuadas para el análisis a
gran escala y, en particular, para los diagnósticos en Veterinaria, ya que es una técnica fiable para
demostrar anticuerpos contra C. burnetii en varias especies animales (20, 49). Requiere un antígeno
relativamente puro. Para recubrir las placas, pueden usarse los antígenos preparados para la prueba de
FC. Existen preparaciones comerciales disponibles con las que se pueden detectar anticuerpos contra la
fase II o contra la fase I y II.
Los pocillos de la microplaca se recubren con el antígeno de células enteras de C. burnetii inactivado. Se
añaden a los pocillos muestras de suero diluido que reacciona con los antígenos unidos al soporte sólido. El
material no unido se elimina mediante un lavado después de un período adecuado de incubación. El
conjugado (Ig anti-rumiante marcada con peroxidasa de rábano) reacciona con los anticuerpos específicos
unidos al antígeno. El exceso de conjugado que no reacciona se elimina mediante el lavado después de un
período adecuado de incubación. Se añade el substrato del enzima. La velocidad de conversión del
substrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos unidos. La reacción se termina después de un
período adecuado de tiempo y el color desarrollado se mide espectrofotométricamente.

Materiales y reactivos
Placas de microtitulación con 96 pocillos de fondo plano, recién recubiertas o recubiertas de antemano con
antígeno de la fiebre Q; lector de microplacas (espectrofotómetro; filtros de 405 y/o 450 y/o 492 nm);
incubador con humidificador a 37ºC; pipetas de 8 y 12 canales con puntas desechables de plástico; agitador
de microplacas (opcional).
Sueros control positivos y negativos; conjugado (inmunoglobulina anti-rumiante marcada con peroxidasa);
diluyente diez veces concentrado (PBS–Tween); agua destilada; substrato o cromógeno (TMB
tetrametilbenzidina), ABTS [2,2´-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico] para la peroxidasa);
peróxido de hidrógeno.

Procedimiento de la prueba
i)
Se diluyen las muestras de suero, incluyendo los sueros control, a una dilución apropiada
(normalmente 1/100) y se distribuyen por duplicado 0,1 ml por pocillo. Los sueros control son sueros
positivos y negativos suministrados por el fabricante y un suero positivo de referencia interna del
laboratorio para comparar los títulos en ensayos diferentes.
ii)
Se cubre la placa con la tapa y se incuba a temperatura ambiente durante 30–90 minutos. Se vacía el
contenido y se lava tres veces a temperatura ambiente con solución de lavado.
iii)
Se añade a los pocillos la dilución adecuada de conjugado recién preparado (0,1 ml por pocillo).
iv)
Se cubre cada placa y se incuba como en el paso ii. Se lava de nuevo tres veces.
v)
Se añade a cada pocillo 0,1 ml de substrato cromogénico recién preparado (por ejemplo: TMB en
ácido acético 0,1 M, y solución de H2O2 al 30% [0,2 µl/ml]; o ABTS 0,25 mM en tampón citrato fosfato,
pH 5,0, y solución de H2O2 al 30% [0,1 µl/ml]).
vi)
Se agita la placa; se incuba según las instrucciones del fabricante, se detiene la reacción añadiendo a
cada pocillo solución de parada, por ejemplo, 0,05 ml de ácido sulfúrico 2 M para el TMB o 10% de
dodecilsulfato sódico para ABTS.
vii)
Se lee la absorbancia de cada pocillo con el lector de microplacas a 405 nm (ABTS) o a 450 nm
(TMB). Los valores de absorbancia se utilizan para calcular los resultados.

Interpretación de los resultados
En el caso de preparaciones comercializadas, las interpretaciones y los valores se suministran con la
preparación.
Por ejemplo: calcular la absorbancia media (Ab) de la muestra de suero y de los sueros control positivos
(Abpos) y negativos (Abneg), y calcular el porcentaje para cada suero:
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.1.12. — Fiebre Q
Ab - Abneg
Abpos - Abneg x 100
Intrepretar los resultados del siguiente modo:
Ab <30%
suero negativo
Ab 30–40% suero dudoso
Ab >40%
suero positivo
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO.
1.
Vacuna
La vacunación es la estrategia más lógica para evitar la fiebre Q en los animales y en los ganados expuestos.
Sólo se puede preparar una vacuna contra C. burnetii cuando lo hace con personal preparado y en condiciones
adecuadas de protección (como mínimo en un laboratorio de nivel 3 de bioprotección). Se recomienda obtener la
vacuna de fabricantes capaces de completar y certificar las pruebas sobre seguridad, inactivación y esterilidad.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el capítulo 1.1.8. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el capítulo 1.1.8 intentan ser de naturaleza
general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.
En algunos países, se practica la vacunación del personal sujeto a la exposición ocupacional, como sucede con
los trabajadores de mataderos, los veterinarios y el personal de laboratorio. En 1989 las autoridades australianas
aprobaron una vacuna inactivada con formaldehído (Q-VAX, CSL Ltd, Australia) preparada a partir de la cepa
Henzerling de C. burnetii en fase I (28). Las vacunas de fase I son más eficaces, pero está contraindicada la
vacunación de individuos con seroconversión o expuestos a C. burnetii antes de la inmunización.
Se han desarrollado varias vacunas contra la fiebre Q animal. Hasta la fecha, los resultados son más favorables
hacia el uso de una vacuna de fase I, ya que las vacunas de fase II son 100 veces menos eficaces que las de
fase I en evitar la colonización del bazo de ratón (13). En Eslovaquia existe una vacuna comercial inactivada de
fase I para la vacunación del ganado. Un estudio sobre la fiebre Q en Eslovaquia sugiere que el descenso en los
casos de fiebre Q en el hombre y en los animales podría deberse a la vacunación a gran escala realizada allí en
el ganado durante 10 años, y a las mejoras en el control veterinario del transporte de los animales en el interior
del país (46).
La vacuna contiene un antígeno muy purificado de la cepa Nine Mile en fase I (pases de cultivo 2 a 6 en huevo) e
inactivado con formaldehído. Un reciente estudio ha demostrado la eficacia de esta vacuna en Francia mediante
la vacunación y la posterior infección experimental de cabras gestantes: la vacuna evitó el aborto y la eliminación
del agente en la leche, disminuyendo considerablemente la liberación en las secreciones vaginales y en las
heces (3). En teoría, la eficacia de la vacuna se debe demostrar mediante pruebas en todas las especies a las
que puede ir dirigida.
En el caso de vacunación de animales ya infectados, no se dispone de información sobre posibles efectos
adversos ni sobre la eliminación del agente de la fiebre Q. Por consiguiente, algunos autores creen que resulta
preferible seleccionar para la inmunización las explotaciones o los animales seronegativos, y continuar con la
vacunación de los animales jóvenes durante varios años (24). Hasta ahora, no existen datos comparativos de la
relación coste–beneficio de esta estrategia respecto a una estrategia no selectiva de control de la fiebre Q.
2.
Materiales de diagnóstico
Véase la sección B.2.a. (Preparación de antígeno).
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