Layered PowerPoint Slides for Introduction to Genetic Analysis Ninth Edition Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, and Sean B. Carroll CLASE 04-05 Mutaciones y reparación del DNA Como surgen las variantes génicas? Introducción ● ● ● Joven, desarrolla una enfermedad, su piel es muy sensible a la luz. Diagnóstico: enfermedad autosómica recesiva, llamada Xeroderma pigmentoso. Varios genes se encuentran asociados a esta enfermedad, los cuales mutados generan la enfermedad Que ocurre para los pacientes sanos? ● Los genes que contribuyen a procesos bioquímicos en la célula que responden al daño químico del DNA y lo reparar antes de que se formen nuevas mutaciones ● Que vamos a entender? Como mutaciones en el sistema de reparación conducen a enfermedades genéticas Análisis genético ● Identificación de una propiedad biológica … encontrar gen o los genes en el genoma que influyen o determinan esa propiedad “descubrimiento del gen asociado” y de alli como actua etc,y continuar con mayor investigación. Análisis genético Relación biología-genética: análisis genético ● ● Una de las formas mas difundidas es la detección de los patrones de herencia de genes simples. Patrones de herencia pueden reconocidos en la progenie de ciertos cruces controlados. Elementos principales: Mutantes: que son formas alteradas de una propiedad normal y Tipos silvestres. Si no existieran las variantes génicas no existiría el análisis genético ● ● Cómo surgen las variantes génicas? Cuales son los dos procesos mas importantes para el origen de la variación? ● La mutación produce nuevas cartas de juego y la recombinación las intercambia produciendo diferentes manos de juego. Capítulo de citogenética. Las principales fuentes de la variación son: la mutación y la recombinación ● ● Mutación: es el cambio en la secuencia del DNA en un gen. La Mutación es la fuente del cambio evolutivo. ● Nuevos alelos surgen en todos los organismos algunos por mutación expotanea y otros por efecto de la radiación y sustancias químicas entre otros. Interacción de genes ● El producto de múltiples genes son activos, funcionales en caminos biosintéticos que determinan propiedades biológicas tales como el color del ojo ● ● El ojo normal del Drosophila es rojo, pero es el producto de interacción de diferentes pigmentos sintetizados en diferentes caminos. El gen normal en el cual ocurre la mutación white funciona corriente abajo en el camino de la formación del pigmento. Interacting mutations affect eye color in Drosophila A malfunctioning enzyme leads to albinism Variantes génicas ● ● En el ambiente celular el DNA no es completamente estable, y cada bp tiene cierta probabilidad de mutar. Los nuevos alelos producidos por la mutación son el material básico para un segundo nivel de variación efectuado por el proceso de recombinación. ● La recombinación es el resultado de procesos celulares que genera que alelos de diferentes genes se agrupen en nuevas combinaciones. Mutaciones ● ● La mutaciones varían desde cambios en una base, cambio de pares de bases, deleciones de regiones cromosómicas Hasta desaparición de un cromosoma total Eventos mutacionales que afectan genes individuales ● ● ● Células han evolucionado sofisticados sistemas de reparación. Sin embargo siempre es tolerado un bajo nivel de mutación Cuales son la consecuencias fenotípicas de las mutaciones? ● Por qué? ● Cuál es su relación con la evolución? Mecanismos asociados ● ● ● Replicación del DNA Sistemas de reparación pueden introducir mutaciones. Otras mutaciones pueden ser devastantes como el rompimiento de una hebra sencilla. Mutuaciones puntuales: Sustituciones de bases , indel Reflexión sobre la lectura del código genético Propiedades del código genético ● ● ● ● El código genético es degenerado, en el sentido en que mas de un tRNA decodifica varios aminoaćidos No tiene ambiguedades en el sentido que cada triplete especifica para un aminoácido El codigo no es solapado, una vez inicia el proceso de transcripción siempre es leido en tripletas El código es casi universal, casi todos los organismos usan este diccionario Reconocimiento de los tRNAs Overview: traducción ● ● ● Etapas de Iniciación: IF (initiation factors), tRNAfMet i, Etapas de elongación: Ef (elongation factors) Etapa de terminación: Rf (release factors) reconocen los anticodones de terminación. Tipos de mutaciones puntuales: cap.15 Efecto: ● ● ● sinonimas (el codon alterado codifica para el mismo aminoácido.) No sinonimas (missense) (el codon alterado codifica para otro aminoacido. Conservativa o no conservativa). Sin sentido (nonsense) (el codon alterado es un codon de parada) Mutaciones: sustituciones y indel ● Sustituciones: subtipos: transiciones y transversiones Definición teniendo en cuenta su efecto en la hebra complementaría. Transiciones: reemplazamiento de la base por una de la misma categoria: Pu X Pu, Py X Py A:T T:A C:G G:C Mutaciones:sustituciones, indel ● Transversiones: opuesto a sustituciones. Reemplazamiento de la base es una base de otra categoría química: Pu X Py y Py X Pu. A:T T:A C:G G:C El efecto debe observarse sobre la doble hélice ● ● Referirse a la mutación asi efecto en la doble hélice: Transicion: G:C A:T ● ● Transverciones: G:C T:A Inserciones y deleciones: insertar o quitar un par de nucleótidos ● ● Indel mutations (insertion:deletions). Consecuencias moleculares de las mutuaciones puntuales en la región codificante ● ● ● Considerar cuales son las consecuencias cuando la mutación ocurre en la región que codifica para el polipeptido: que propiedades del código genético funcionan aqui: degeneración y la existencia de codones de terminación Sinonimas: no alteran la secuencia del polipepetido (silenciosas) No-sinonimas y sin sentido: la severidad del efecto depende: conservativa o no. El efecto real se observa en la estructura de la proteína y su función. Cambios que incativan proteinas están relacionados por mutaciones en los sitios de splicing Mutaciones de cambio de lectura Cambian la secuencia corriente abajo del sitio de mutación y la secuencia producida no tiene relación con la secuencia original, esperada. Consecuencias moleculares de mutaciones puntuales en regiones no codificantes ● Si crea o altera un sitio de unión. Si altera región regulatoria (cantidad de producto de expresión). Resumen ● Consecuencias moleculares de las mutaciones puntuales (sustituciones, indel): 1. Si ocurren en la región codificantes 2. Si ocurren en las regiones no codificantes Cambios que inactivan proteinas están relacionados por mutaciones en los sitios de splicing Cuales serían las consecuencias de mutuaciones puntuales en regiones no codificantes? ● Si crea o altera un sitio de unión. Si altera región regulatoria (no expresión, cantidad de producto de expresión modificada). Consecuencias de las mutaciones puntuales en productos de genes Detección de moléculas usando sondas marcadas Las bases moleculares de mutaciones expontaneas ● ● ● Las mutaciones en los genes pueden surgir de forma espontanea o pueden ser inducidas. Mutaciones espontaneas: ocurren de forma natural. Mutaciones inducidas: surgen a travez de la acción de ciertos agentes, llamados mutágenos que incrementan la velocidad a la cual la mutación ocurre. La mutación es un proceso al azar, cualquier alelo de una célula puede mutar ● Fuentes: 1. Proceso de replicación. 2. Ambiente celular puede producir un cambio. Lesiones espontaneas. 3. Inserciones de elementos transponible Visión molecular de las mutuaciones puntuales: errores en la replicación Tautomeros ● Tautomeros: las bases del DNA pueden aparecer en diferentes formas. Difieran la posición de sus átomos y los enlaces entre los átomos. Comunmente migraciónde un átomo de Hidrógeno o de un protón. Cambio de enlace sencillo a doble. Mecanismos de reparo por la función de edición de la polimerasa. Y los que escapan son reparados por “Sistemas de reparación”. Que tipo de mutación es ? Los cambios tautoméricos puden causar mutaciones Indel: resultan en cambio del marco de lectura “replication slippage. Video 15.10” Lesiones espontaneas ● Depurinación: Rompimiento del enlace glicosilico entre la base y el azucar. 10.000 purinas por ciclo celular son perdidas en células de mamiferos. ● Corregido por los sistemas de reparación. Lesiones espontaneas ● ● Deaminación de la citosina produce uracilo, el cual aparea con A en la replicación (G: C → A: T). Dibuje el esquema de replicación para la primera y segunda progenie Lesiones espontaneas: radicales libres ● ● ● Productos del metabolismo normal aeróbico (H202, .OH, radicales super oxido) producen daño oxidativo tanto al DNA como al GTP. A: bloquea la replicación B: produce aparemiento con A, resultando incremento de transverciones G→T. A B Mutaciones espontaneas: Enfermedades de repeticiones de tripletas ● ● Sindrome del cromosoma X fragil: (CGG)n Enfermedad de Huntington:(CAG)n Bases moleculares de las mutaciones inducidas: mutagenos ● 3 Tipos principales: 1. Reemplazan una base en el DNA 2. Alteran una base talque genera apareamiento incorrectos con otras base. 3. Daño cuando una base no puede aparearce con ninguna otra base bajo circunstancias normales. Mecanismos de mutagénesis inducidas ● Incorporación de análogos de bases: son compuestos similares a las bases nitrogenadas: 5-bromouracil (análogo a timina). La forma inestable aparea con G. Mecanismos de mutagénesis inducidas ● ● Mutagenos no incorporados al DNA, sino que alteran una base y ésta puede generar un mal apareamiento: agentes alquilantes (EMS etil metano sulfonato) y Nitrosoguanidina (NG), transfieren grupos alkilos (etil y metil) Mecanismos de mutaciones inducidas ● Agentes intercalantes: Naranja de acridina (causar indel) ● Daño de las bases: Luz ultravioleta: fotoproductos ● ● Moleculas ionizadas: peroxidos producidos por ionización por radiación. Formación de sitios apurínicos por rompimiento del enlace glicosidico Fotoproductos Los mecanismos de reparación biológica Despues de observar diferentes fuentes de error de daño de DNA: (dentro de la células): replicación, productos del metabolismo y externos (luz UV, radiaición por ionización, mutagenos) Cómo la vida ha sobrevivido millones de años? Mecanismos de corrección de errores ● Tipo 1. Función prueba de lectura de DNA polimerasas. DNA polimerasa I y III son capaces de eliminar bases mal apareadas. Mecanismos de reparación del DNA ● ● Tipo II: hacer reversa la mutación. Ciclobutano pirimidine dimero (CPD) (reversible por la enzime CPD fotoliasa). Metiltransferasas que remueven los grupos alkil recien incertados Mecanismos de reparación del DNA ● Tipo III: Reparación por escición de la base: (Sistemas de reparación dependientes de homología.) . Secuencias (crear sitios apurinicos AP por la ruptura DNA glicosilasa, AP endonucleasa, Deoxiribofosfodiesterasa elimina el esqueleto PD. Ligasa sella ) Mecanismos de reparación del DNA ● ● ● ● ● Tipo IV: Reparación por escisión del nucleótido. Reconocimiento del daño: parada o retención de los complejos de replicación y transcripción. Ensamble del complejo de multiproteinas en el sitio Corte de la hebra dañada 30 nt up and down stream. Uso de la hebra no dañada como moldel para DNA polimerasa seguida por ligación. Mecanismos de reparación del DNA ● ● ● Tipo IV: Reparación por escisión del nucleótido. Activados por parada o retención de los fork de replicación y transcripción: En el sindrome de Cockayne las proteinas de reconocimiento de retención de la transcripción están mutadas activando frecuentemente la apopotisis. En Xeroderma pigmentosum: XPB y XPD se encuentran defetuosas y no se puede dar reparación del daño y se acumulan las mutaciones. Mecanismo de reparación postreplicación ● ● La tasa de error en la replicación es 10 -5 . Con la prueba de lectura de la 3' – 5' de la polimerasa se reduce a 10 -7. ● Nos queda un error que puede mantenerse, pero el mecanismo de reparación de no-coincidencias “mismatch repair” lo disminuye a 10-9 Mecanismo de reparación post-replicación: reparación de no coincidencias:modelo en E.coli ● ● ● Esta asociado a metilación del DNA en E.coli regiones inestables por presencia de indel, loops. Se asocia a la metilación de la hebra molde para hacer reconocimiento de la hebra nueva. MutS, MutL, MutH y UvrD Mecanismo de reparación post-replicación: reparación de no coincidencias:modelo en E.coli ● ● ● ● Reconocimiento de mistmatch (MutS). Atrae a MutL, MutH y UvrD Reconocimiento y corte de la hebra que posee el nucleótido incorrecto (MutH), la no metilada es la nueva. UvrD tiene actividad helicasa mientras se da el corte Otros mecanismos ● ● ● Sintesis de DNA por translesión. Reparación de rupturas de doble hélice Mecanismos de reparación en meiosis en la recombinación. Guia para el laboratorio: Enzimas de restricción ● Generación de Moléculas recombinantes: ● DNA donor ● Enzimas de restricción ● Formación de la molécula recombinante ● Transformación ● Amplificación Cortar el DNA: de gran tamaño a pequeños tamaños ● ● ● Uso de enzimas de restricción bacteriana. Características: cortan secuencias específicas del DNA, llamadas sitios de restricción. Por azar cualquier genoma tiene sitios de restricción ● 5'-GAATTC-3' ● 3'-CTTAAG-5' ● ● ● Segmentos palíndromes Pareamiento de extremos libres … hibridación