enzimas utilizadas en biología molecular, vectores de clonado y de
Anuncio
Especialidad en Microbiología Clínica Módulo: “Biología Molecular Aplicada al Laboratorio de Microbiología” UCA Clase teórica III Genética y clonación Lic. M. Paula Quiroga Los temas de hoy: 22/4: Conceptos generales de: CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA y A. Mutaciones y mutantes. y B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos. y C. Adquisición de material genético exógeno. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE y A. Enzimas utilizadas en biología molecular. y B. Vectores de clonado y de expresión. y C. Construcción de bibliotecas genómicas. mutaciones y Espontáneas (sin mutagénicos) Tasa de mutación (10-4 y 10-12) Sustitución de bases: puntuales y Mutaciones con cambio de marco: y ◦ Deleciones ◦ Inserciones y Mutaciones inducidas: Estructura del ADN Cromosoma bacteriano Procariotas ADN doble cadena (1mm long) circular cerrado Condensado y ordenado (supercoiled o superenrollado) Origen de replicación Genes organizados en operones No contiene histonas Plásmidos • Tamaño de 1 a 400Kb • Cantidad variable de copias en una célula • Origen de replicación propio • Pueden integrase al cromosoma • Pueden movilizarse a otros genomas Adquisición de material genético exógeno: Conjugación Plásmidos y conjugación: Conjugativos Movilizables No movilizables Adquisición de material genético exógeno y Integración y Transposición ENZIMAS ENZIMAS PARA PARA MANIPULACI ÓN DEL MANIPULACIÓN DEL ADN ADN in in vitro vitro ENZIMAS ÓN DEL ENZIMASPARA PARAMANIPULACI MANIPULACIÓN DEL ADN ADNin invitro vitro Nucleasas Nucleasas Polimerasas Polimerasas -Endonucleasas - Exonucleasas - DNA Polimerasas - RNA Polimerasas Otras Otrasenzimas enzimasmodificadoras modificadoras - Fosfatasas, ligasas, metilasas, etc. ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro 5´ 3´ Nucleasas Endonucleasas Sitio específicas: enzimas de restricción Cortes en uniones fosfodiester Genera 3’OH y 5’PO4 cohesivos o romos Cortan en la zona de reconocimiento 5´ 3´ ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Endonucleasas Sitio Específicas 2 tipos de cortes COHESIVOS ROMOS ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Nucleasas Endonucleasas No Sitio específicas (Cortes en uniones fosfodiester) ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Endonucleasas No Sitio Específicas Mung bean: corta ADN simple cadena Nucleasa S1: corta regiones simple cadena de ADN DNasa I: corta ADN doble o simple cadena dejando extremos romos o con 1 o 2 nt. Uso: identificación de regiones del ADN unidas a proteínas RNAsas 2 tipos más comunes A: degrada todo tipo de ARN H: corta híbridos ARN:ADN ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Exonucleasas Cortan los ácidos nucléicos sólo por extremos Funcionalidad: proof reading en ADN ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Nucleasas Exonucleasas DNA doble cadena Bal 31 (degrada extremos dc 3’ y 5’ dejando extremos romos); utilizada para deleciones progresivas Exo III (degrada DNA dc del 3’ dejando extremos recesivos rellenables) Exonucleasa lambda (degrada DNA dc del 5´ dejando extremos recesivos no rellenables) DNA simple cadena ExoVII (remueve oligonucleótidos en 5’ o 3’ de DNA sc) ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Promotor específica ARN polimerasa Polimerasas de fagos T7, T3 y T6 Polimerasas Actividad 5´a 3´ ADN polimerasa Fragmento Klenow DNA polimerasa 1 de E.coli T4 DNA polimerasa T7 DNA polimerasa Polimerasas termoestables Trasncriptasa reversa Terminal transferasa ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Polimerasa Polimerasa Termoestables Termoestables Taq polimerasa Vent polimerasa Pfu polimerasa Uso en PCR Pfx polimerasa ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Ligasas Metilasas Otras Otrasenzimas enzimasmodificadoras modificadoras Fosfatasas Kinasas ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Enzimas modificadoras del DNA Fosfatasas Remueven grupos fosfatos de los extremos 5´ de ADN Uso: prevención de ligación de extremos complementarios y preparación del ADN para marcado radiactivo P CCCCCC-OH GGGGGG-OH P OHOH-GGG OHOH-CCC Fosfatasa Alcalina: •Calf intestine (CIP) •Bacteria (BAP) •Shrimp (SAP) ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Enzimas modificadoras del DNA Kinasas Agrega grupos fosfatos a los extremos 5´ de ADN Uso: marcado radiactivo en el extremo 5´ T4 Polinucleótido kinasa ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Enzimas modificadoras del DNA Metilasas Metilan bases dentro de una secuencia específica Dam Dcm ENZIMAS PARA MANIPULACIÓN DEL ADN in vitro Enzimas modificadoras del DNA Ligasas CCCGGG GGGCCC Cataliza uniones covalentes entre nucleótidos T4 DNA ligasa para extremos romos o cohesivos E.coli DNA ligasa para nicks METODOLOG ÍA DEL ADN RECOMBINANTE METODOLOGÍA Ligación Que significa clonar? Utilizar tecnología de ADN especializada o “tecnología recombinante” para producir múltiples copias exactas de un gen u otro segmento de ADN. ADN que se introduce en diferentes células huésped Äutiliza su maquinaria de replicación. Células huésped: bacteria (mas común), levaduras y células mamíferas. Objetivo: amplificación y/o expresión Como clonar Obtener el fragmento de ADN a ser estudiado y prepararlo para insertarlo en un vector vector Molécula de ADN proveniente de virus, bacterias o levaduras Capacidad de inserción: 12kb para vectores bacterianos. 1Mb para vectores de levaduras. Células Huésped Levaduras Células mamíferas Bacterias Saccharomyces cereviseae, Pichia pastoris, etc. Líneas celulares como CHO ( cél. Ovario Hamster) GRAM NEGATIVAS (E. coli, P.aeruginosa) GRAM POSITIVAS (Bacillus subtilis, S.aureus, Streptommyces) Células Huésped: Bacterias Sistema más desarrollado 4 Cepas recombinantes con deleciones en el genoma que permiten: 4 4 seleccionar genotípicamente, 4 seleccionar fenotípicamente, 4 estudiar expresión de una proteína, 4 estudiar la respuesta celular, etc. VECTORES RECOMBINANTES Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de una célula huésped SISTEMAS BACTERIANOS Plásmidos Fagos Cósmidos BAC • Inserción de hasta 10kb • Sistema más común • Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb) • Tipo I (T1, capacidad 23kb) • Capacidad de 44kb • Plásmidos con sitios cos • Capacidad de 300kb • Cromosoma artificial de bacterias Bacteriófagos Fagos Utiliza la capacidad lisogénica Mayor eficiencia de transformación Cósmidos ¾ Propagación similar a la de un plásmido ¾ Sitios cos derivados de fagos que envuelven el ADN ¾ Introducción del ADN en bacterias por transformación o empaquetamiento como fago plásmidos utilizados como vehículos de clonado Vectores de clonado o de expresión Multicopia: bajo número (15) o alto número (>50). Con sitios de corte únicos para el clonado. Polylinker o MCS (multiple cloning sites). Con marcador fenotípico, fácilmente detectable. Pequeño tamaño (entre 2.5- 7kb). Plásmidos VECTORES •VECTORES DE CLONADO •VECTORES DE EXPRESIÓN VECTORES de CLONADO Genes de resistencia a antibióticos (selección) Origen de replicación Sitios de corte de endonucleasas, dispersos VECTORES de CLONADO Marcador de selección Marcador de selección VECTORES de EXPRESIÓN Polilinker o MCS Selección Origen de replicación Región Reguladora (promotor inducible) VECTORES SHUTTLE • Dos marcadores de selección • Dos orígenes de replicación • Sitios de corte único para el clonado VECTORES RECOMBINANTES SISTEMAS EUCARIÓTICOS Estudio del genoma eucariotico in vivo, necesita huésped eucariótico. Vectores Integrativos: disrupción génica, reemplazamiento génico Lineales Cromosomas Artificiales de levaduras (YACs) Plasmídicos (derivados de Ti) Virales (SV40, papiloma bovino, retrovirales) VECTORES RECOMBINANTES SISTEMAS EUCARIÓTICOS Vector viral: SV40 Usado para infectar células tumorales YAC capacidad de 1Mb de genoma, pero baja eficiencia Vector plasmídico para Eucariotas: plásmido Ti, circular de Agrobacterium tumefaciens, permite a las bacterias infectar plantas Como clonar??? PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA Gen de interés ADN cromosomal Extracción de ADN Recuperación del fragmento de interés (idealmente x PCR) ELECTROFORÉSIS Producto de PCR ADN muy limpio!!! Insertar en el vector El vector debe estar listo!!! ADN extraído Digestión del ADN plasmídico con enzima de restricción ADN digerido ADN no digerido Tratar con Fosfatasas Extremo del ADN genómico digerido Extremo del ADN plasmídico digerido Ligación???? Ligación INSERCIÓN DE ADN EN UN PLÁSMIDO INTRODUCCIÓN DEL PLÁSMIDO EN UNA BACTERIA Transformación Células debilitadas que permiten el acceso de ADN foráneo: T. Química (CaCl2) T. Física (electroporador) INTRODUCCIÓN DEL PLÁSMIDO EN UNA BACTERIA Una vez obtenida la colonia… y Corroborar fenotípica o genotípicamente la presencia del fragmento insertado GENÓMICA Estructural Funcional Conjunto de estrategias y tecnologías empleadas para la caracterización molecular del genoma Biblioteca de cDNA Construida a partir de ARNm Contiene las regiones codificantes del genoma Depende de la célula de origen y su estadio Bibliotecas Genómicas • Fragmentos de ADN que representan todo el genoma • Vectores: plásmidos o fagos lambda (fagos: recomendado por mayor eficiencia y mayor capacidad). También YAC y cósmidos. • Reconocimiento de fragmentos por screening con regiones conocidas • Proyectos genoma Bibliotecas Genómicas Digestión de un genoma completo Reemplaza el paso de PCR inicial Bibliotecas Genómicas Corte con una sola enzima Bibliotecas Genómicas Análisis de Secuencias Armado de estructuras mediante ensamblado Contigs Genomas Virus Grupos Contienen I dsDNA viruses II ssDNA viruses III dsRNA viruses IV (+)ssRNA viruses V (-)ssRNA viruses VI ssRNA-RT viruses VII dsDNA-RT viruses ss: single-stranded, ds: double stranded RT: reverse transcribing •Pueden ser líticos o lisogénicos (Herpes simplex) •Contiene ADN o ARN simple o doble cadena o ambos (CMV) •Tamaño del genoma ronda en 5Kpb a 5000Kpb •Virus de ARN poseen genomas más chicos que virus de ADN (asociado a la fidelidad de la polimerasa) Bacteriófagos •Reconocen receptores en bacterias •Pueden ser líticos o lisogénicos •Contiene ADN o ARN simple o doble cadena •Tamaño del genoma ronda en 170kbp Bacterias Cromosoma Plásmidos Genoma de E. coli Tamaños 600Kpb a 10Mpb •Mycoplasma genitalium contiene el genoma más chico •Patógeno intracelular obligado •Aproximadamente 250 genes esenciales Las mayoría de las bacterias tienen su genoma organizado Genomas organizados en islas Hongos Levaduras Fermentación Obtención de biomasa •Utilizado en procesos relacionados con los alimentos •Utilizado en la producción de fármacos •Modelo eucariótico para biotecnología médica Altamente avanzada por el estudio de Saccharomyces Modelo Eucariótico Genoma 13Mpb 6000 genes aprox. MUCHAS GRACIAS!!!
