Señalización molecular en la atrofia muscular por desuso MOLECULAR SIGNALING IN DISUSE MUSCLE ATROPHY Ramón Pinochet Urzúa José Luis Márquez Andrade Universidad Católica del Maule, Talca, Chile. RESUMEN Periodos prolongados de inactividad física pueden conducir a una significativa atrofia muscular, lo cual impacta en los costos de salud y en la calidad de vida de los pacientes, especialmente en ausencia de un adecuado proceso de terapia física. Para planificar de mejor manera el proceso de rehabilitación es necesario comprender los fenómenos biológicos que explican la atrofia por desuso y de esa forma realizar un abordaje científico de una problemática clínica habitual. El presente artículo ilustra los principales mecanismos que hasta ahora explican la atrofia muscular inducida por desuso, abordando con especial atención el aumento en la degradación de proteínas y la disminución en su síntesis. ABSTRACT Prolonged periods of physical inactivity can lead to a significant muscular atrophy, which impacts on health costs and the quality of life of patients, particularly in the absence of an adequate physical therapy program. In order to better plan the rehabilitation process it is necessary to understand the biological phenomena which explain the atrophy by disuse, so as to scientifically approach a habitual clinical situation. This article intends to illustrate the main mechanisms that account for disuse-induced muscular atrophy, focusing on both protein degradation increase and synthesis reduction. Palabras clave: Inactividad, factor nuclear-kB, síntesis de proteínas, degradación de proteínas. Key words: Inactivity, nuclear factorkB, protein synthesis, protein degradation. UCMaule - Revista Académica N°35 -Diciembre 2008 pág. 95 El desuso muscular es una condición habitual en situaciones de inmovilidad, reposo en cama, sedentarismo, envejecimiento, microgravidez o enfermedades crónicas (Powers et al., 2005) y desde hace más de dos siglos que se utiliza la inmovilización prolongada del paciente como medida terapéutica en patologías como fiebre reumática, tuberculosis, insuficiencia cardiaca congestiva entre otras, sin reconocer a cabalidad sus potenciales efectos deletéreos (Harper & Lyles, 1998). El desuso se manifiesta con alteraciones estructurales y funcionales en el músculo esquelético que incluyen disminución en el contenido de proteínas (desbalance síntesis/degradación), en el diámetro de las fibras musculares así como disminución en la capacidad de generar tensión y en la resistencia a la fatiga (Adams et al., 2003; Booth, 1982; Rennie, 2007). Si bien se han descrito muchos aspectos fisiológicos y clínicos asociados con el desuso muscular, la información respecto de los mecanismos moleculares involucrados es menos frecuente. Esta revisión describe aquellas moléculas clave, y las rutas de señalización sugeridas como responsables de la atrofia muscular inducida por desuso y los mecanismos relacionados con el aumento en la degradación de proteínas así como la disminución en la síntesis de las mismas. EL AUMENTO EN LA DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS Calpaína y Calpastatina Calpaína es una proteasa intracelular dependiente de calcio cuya función no es completamente conocida. En periodos de inactividad su actividad proteolítica se dirige a las proteínas estructurales que mantienen el ensamble de la sarcómera (titina, vinculina y nebulina, entre otras). En contraposición a esta actividad proteolítica se encuentra la proteína calpastatina, la cual presenta cuatro dominios inhibitorios para calpaína. Estudios in vitro han mostrado que tanto la inhibición de calpaína como la sobreexpresión del dominio inhibitorio de calpastatina disminuyen la degradación de proteínas (Huang & Forsberg, 1998). Por otra parte, Tibdal & Spencer (2002), han mostrado, mediante esperimentos realizados en ratones transgénicos, que la sobreexpresión de calpastatina es capaz de disminuir la atrofia muscular inducida por el desuso muscular describiendo por primera vez la forma en que este sistema proteolítico modula la atrofia muscular in vivo. pág. 96 UCMaule - Revista Académica N°35 -Diciembre 2008 Catepsina Catepsina es una cistein proteasa lisosomal cuya acción se asocia al catabolismo proteico intracelular, teniendo como sustratos principales al colágeno y la elastina. Su expresión y actividad aumentan durante el desuso muscular y su patrón de activación indica que juega un rol mayor en estados tardíos de atrofia muscular (4 días) (Taillandier et al., 1996; Stevenson et al., 2003). Estudios de Taillander et al. (1996) han mostrado que tanto la actividad proteolítica lisosomal como la dependiente de calcio son responsables de la degradación de proteínas en músculo sóleo de ratas, luego de nueve días de suspensión de una extremidad. El aumento de los niveles de ARNm que codifican para estas proteínas sugiere una regulación transcripcional. Sistema Ubiquitina-Proteosoma El sistema ubiquitina-proteosoma, corresponde a un complejo compuesto por tres enzimas, E1 (activadora de la ubiquitina), E2 (transportadora de ubiquitina) y E3 (ubiquitina-ligasa), que a través de una interacción cooperativa trasladan proteínas hacia el proteosoma, estructura responsable de la degradación de las mismas (Glickman & Ciechanover, 2002). UBE1 (del inglés ubiquitina-activating enzyme E1) pertenece a una superfamilia de enzimas activadoras de proteínas similares a ubiquitina, UBE2 (del inglés ubiquitina-conjugating enzyme E2), tiene la función de acercar las proteínas al proteosoma y UBE3C (del inglés ubiquitina protein ligase E3C) desarrolla la última etapa al poliubiquitinizar la proteína a degradar lo que permite su unión final al proteosoma. El desuso induce un aumento significativo de la expresión de compuestos relacionados al sistema ubiquitina-proteosoma (Taillandier et al., 1996; Stevenson et al., 2003). Atrogin-1, MAFbx (del inglés Muscle Atrophy F-box) y MuRF1 (del inglés Muscle-specific RING finger protein 1), son genes que codifican para enzimas E3 específicas de este sistema y que participan en la regulación de la atrofia muscular inducida por desuso. Bodine et al. (2001) han demostrado que la sobreexpresión de MAFbx o MuRF1 en miotubos, induce atrofia y plantean que el producto proteico de estos genes sería un blanco potencial de intervención para limitar la atrofia muscular. Krawiec et al. (2005) estudiaron, con un modelo de descarga unilateral, el efecto del desuso muscular en la síntesis de proteínas y las vías de control traduccional, observando que la tasa de síntesis de proteínas y la eficiencia de la etapa de iniciación y elongación de la traducción no sufrie- UCMaule - Revista Académica N°35 -Diciembre 2008 pág. 97 ron cambios, sin embargo, el contenido de ARNm de ubiquitina-ligasa, MAFbx y MuRF1 aumentó en los músculos inmovilizados, demostrando que la pérdida de masa muscular en el músculo estaría, al menos parcialmente, condicionada por el aumento de la degradación de proteínas. El aumento en los niveles de ARNm de múltiples factores relacionados al sistema ubiquitina-proteosoma y la inhibición parcial de sus efectos, con el uso de potentes inhibidores, posiciona a este sistema proteolítico como un importante modulador en la atrofia muscular inducida por desuso (Krawiec et al. 2005). Ruta dependiente de Factor Nuclear kappa B (NF-kB) La familia de los factores de transcripción NF-kB corresponde a proteínas presentes en la mayoría de las células, las que tienen un rol clave en la activación de la respuesta inmune e inflamatoria. NF-kB tiene la capacidad de unirse a sitios específicos en el ADN activando la transcripción de un gran número de genes, regulando la transcripción de estos y permitiendo así la adaptación celular a los cambios del medio (Hayden & Ghosh, 2004). En mamíferos, la familia NF-kB está formada por cinco miembros: p65 (RelA), RelB, c-Rel, p50 (NF-kB1) y p52 (NF-kB2). Todos los miembros de la familia se expresan en el músculo esquelético y en las células no estimuladas pueden existir en forma de homo o heterodímeros unidos a proteínas inhibidoras IkB. Cada uno de ellos presenta un dominio altamente conservado de 300 aminoácidos, denominado Dominio de Homología Rel (RHD, del inglés Rel homology domain) el cual es responsable de la dimerización, la interacción con IkB, así como de la unión a sitios específicos en el ADN (Zhang et al., 2007). En células no estimuladas, los dímeros de NF-kB son mantenidos en el citosol merced a una interacción no covalente con las proteínas inhibidoras IkB, lo cual previene el ingreso de NF-kB al núcleo. Cuando la célula es expuesta a un estímulo adecuado, el complejo quinasa de IkB (IKK, del inglés IkB kinase) fosforila IBk en los residuos Ser32 y Ser36, promoviendo su ubiquitinación y subsecuente degradación por proteosomas. Así, NF-kB queda libre para translocar hacia el núcleo y unirse a las secuencias específicas de las regiones promotoras en genes blancos (Hayden & Ghosh, 2004). Existe evidencia que asocia NF-kB a la atrofia muscular por desuso involucrando principalmente a p50 y Bcl-3, pero no a p65, (Hunter et al. 2004), sometiendo a descarga las extremidades de ratones knockout para Nfkb1 (codifica pág. 98 UCMaule - Revista Académica N°35 -Diciembre 2008 para las proteínas p105 y p50) y para Bcl-3, encontraron que ambos genes son necesarios para que se exprese la atrofia muscular inducida por descarga. De esta manera, es concebible que NF-kB sea clave en la ruta de señalización involucrada en la atrofia por desuso, sin embargo, la falta de conocimiento de genes blanco corriente arriba o abajo de NF-kB, limita la obtención de resultados definitivos. Especies reactivas de oxígeno (ROS) Los activadores de NF-kB son variados, sin embargo, uno especialmente atractivo corresponde a las especies reactivas de oxígeno (ROS). Ellas pueden activar directamente NF-kB y tanto la atrofia muscular causada por inmovilización como por descarga han sido asociadas a un incremento en los niveles de oxígeno reactivo (Bar-Shai et al., 2008). El estrés oxidativo es una vía potencial de la atrofia muscular por desuso, que se ha relacionado a una disminución en la capacidad antioxidante y un aumento de las ROS en el músculo esquelético. Los radicales libres son moléculas extremadamente inestables y con gran poder reactivo que pueden dañar tanto las membranas como el material genético de las células. Son ejemplos de ROS el radical hidroxilo (HO); peróxido de hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2), oxígeno singlete (1O2), óxido nítrico (NO), radical peroxilo (ROO), semiquinona (Q), y Ozono (O3). La defensa antioxidante de la célula está constituída por proteínas que, presentes en concentraciones bajas con respecto al sustrato oxidable, retrasan o previenen significativamente la oxidación de éste. Como sustrato oxidable se consideran casi todas las moléculas orgánicas o inorgánicas que se encuentran en las células vivas (proteínas, lípidos, azúcares y ADN) y los tres sistemas enzimáticos antioxidantes de mayor importancia son: 1) Superóxido dismutasa (SOD): sistema formado por un grupo de enzimas metaloides, mientras la Cu-SOD y la Zn-SOD que contienen cobre y zinc en su sitio activo respectivamente, se encuentran en el citosol y en el espacio inter-membranoso mitocondrial, la Mn-SOD que contiene manganeso, se localiza en la matriz mitocondrial. Estas enzimas dismutan el oxígeno para formar peróxido de hidrógeno y su principal función es entregar protección contra el anión superóxido. 2) Catalasa (CAT): Enzima de una amplia distribución en el organismo humano, alta concentración en hígado y riñón, baja concentración en tejido conectivo y epitelios y prácticamente nula en tejido nervioso. A nivel celular se localiza en mitocondrias, peroxisomas y en el citosol de eritrocitos. Presenta dos funciones fundamentales: catalítica y peroxidativa y forma parte del sistema antioxidante CAT/ SOD que actúa en presencia de altas concentraciones de peróxido de hidrógeno. UCMaule - Revista Académica N°35 -Diciembre 2008 pág. 99 3) Glutatión peroxidasa (GPx): Su actividad está estrechamente ligada a la presencia de selenio, cataliza la reducción peróxido de hidrógeno a radical hidroperóxido en presencia de Glutation (GSH) y selenio y la reducción del hidroperóxido a compuestos más estables también en presencia de GSH (Venereo, 2002). Estudios de Lawler et al. (2003) mostraron, en músculo esquelético de ratas, que un período de descarga incrementa el estrés oxidativo en el músculo esquelético y genera cambios en el equilibrio oxidativo del músculo sóleo evidenciando una leve disminución en la actividad de Mn-SOD, CAT y GPx y un aumento en Cu,Zn-SOD. Los resultados indican que el desuso muscular incrementa el estrés oxidativo en el músculo esquelético asociado a un descenso en la capacidad de defensa antioxidante, lo que facilita la producción de hidroperóxidos (Lawler, 2003). En esta misma dirección, Li et al. (2003) encontraron que el peróxido de hidrógeno (H2O2) estimulaba la degradación de proteínas musculares, proporcionando la primera evidencia directa que el H2O2 incrementa la actividad del complejo ubiquitina-proteosoma en células del músculo esquelético y que la exposición a H2O2 puede alterar la expresión de los genes que codifican para E2 (E214k y UbcH2) y E3 (E3k, atrogin1/MAFbx y MuRF1), proteínas que controlan esta vía de degradación de proteínas en el músculo esquelético (Li et al, 2003). LA DISMINUCIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS La ruta Akt/mTOR/p70S6k Durante el desuso, la tasa de síntesis de proteínas se ve disminuida, un fenómeno que ha sido asociado con el control de etapas iniciales de la traducción realizado por la ruta Akt/mTOR/p70S6k . Akt, también conocida como PKB, es una proteína quinasa cuya función es regular la sobrevivencia y la proliferación celular, estimulando el crecimiento a través de la activación de la síntesis de proteínas. Por su parte, mTOR (del inglés mammalian target of rapamycin), es una quinasa involucrada en la respuesta al estrés celular y a la deprivación de nutrientes. Finalmente, p70S6k (del inglés 70 kDa ribosomal S6 kinase) es otra proteína quinasa que presenta múltiples funciones, entre otras, regula el crecimiento celular, la sobrevivencia, la traducción de proteínas y media la apoptosis. Los blancos de esta ruta son el factor de iniciación eIF-2 y el factor de elongación eEF2. EIF-2 regula el primer paso en la iniciación de la traducción de proteínas, promoviendo la unión del tRNA a la subunidad ribosomal 40S. Estudios de Bodine et al. han pág. 100 UCMaule - Revista Académica N°35 -Diciembre 2008 mostrado que la vía Akt/mTOR es regulada positivamente durante la hipertrofia y negativamente durante la atrofia muscular y que al utilizar rapamicina (un bloqueador específico de mTOR) se bloquea la hipertrofia sin causar atrofia. Los autores concluyen que la vía Akt/mTOR es responsable de la regulación del tamaño de la fibra muscular y su activación puede oponerse a la atrofia muscular inducida por desuso (Bodine et al., 2001). Reynols et al. (2002) investigaron los efectos de diversos grados de carga muscular sobre la fosforilación de Ser2448 de mTOR (sitio de activación por Akt) mostrando que la carga mecánica modulaba la fosforilación de este sitio. La sobrecarga del músculo plantaris (inducida por ablación de musculatura sinergista) generó la hipertrofia e incrementó la fosforilación del residuo Ser2448, en tanto que la descarga del gastrognemio provocó atrofia y disminución en la fosforilación de Ser2448, sugiriendo que esta modificación post-traduccional es un importante punto de control de la síntesis proteica. Junto con esto, Hornberger et al. (2001), demostraron que la descarga y denervación de sóleo y extensor largo de los dedos, inducen alteraciones en la fosforilación y expresión de p70s6k, eIF-2a y eEF-2 en ratas Wistar hembras. La quinasa eEF2K, fosforila e inhibe al eEF2 y Stevenson et al. (2003) encontraron un aumento en su expresión luego de 14 días de descarga del sóleo de ratas Wistar, lo cual se asoció con una disminución en la síntesis de proteínas. eIF4E El desuso muscular induce una rápida disminución en la síntesis de proteínas debido al control establecido en la etapa de iniciación y elongación durante la traducción de proteínas. En este sentido, eIF4E (del inglés eukaryotic translation initiation factor 4E), que tiene la función de activar la iniciación de la traducción de proteínas, juega un papel relevante. Asociado a él, 4E-BP-1 (del inglés eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1), posee una función inhibitoria de esta fase y al presentarse en una condición defosforilada libera eIF4E permitiéndole su actividad. Bodine et al. (2001) han mostrado que 14 días de desuso muscular inducen un aumento en la expresión de 4E-BP-1 en gastrocnemio de ratas. IGFs IGF-1 (del inglés insulin-like growth factor) forma parte de una familia de péptidos que cumplen un importante rol en el desarrollo y crecimiento de los mamíferos y su función es modulada por las proteínas IGFBP-4 e IGFBP-5 (del inglés insulin-like growth factor binding proteins) (Schneider et al., 2002). Awedea UCMaule - Revista Académica N°35 -Diciembre 2008 pág. 101 et al. (1999), investigaron el efecto de la descarga y sobrecarga mecánica en la expresión génica de IGF-I, IGFBP-4 e IGFBP-5 en la musculatura esquelética de ratones. La sobrecarga indujo un 15% de hipertrofia en el músculo sóleo, un 60% en los niveles IGF-I transcrito y el doble en el ARNm de IGFBP-4. Por el contrario, los niveles de ARNm de IGFBP-5 descendieron a un tercio del valor control. La descarga por su parte, generó atrofia del músculo sóleo (20%), evidenciándose una disminución del 30% en los niveles de ARNm de IGF-I y un incremento en los de IGFBP-5, sugiriendo con esto que IGF-I y sus proteínas de unión IGFBPs, son regulados agudamente por descarga y sobrecarga mecánica del músculo esquelético y por tanto deben ser consideradas en el análisis de las bases moleculares de la atrofia. CONCLUSIONES Las señales intracelulares que regulan los cambios en la síntesis y degradación de proteínas durante la atrofia recién comienzan a ser dilucidadas. La atrofia por desuso ocurre cuando se pierde el equilibrio entre las dos grandes fuerzas que controlan la masa muscular, la síntesis de proteínas por un lado y su degradación por otro. Los mecanismos proteolíticos pueden contribuir más a la falta de proteínas que una disminuida síntesis, sin embargo, se necesita de más estudios para aclarar la verdadera contribución de cada ruta molecular involucrada en la degradación de proteínas. Los antecedentes aportados muestran claramente cómo una condición fisiológicamente anormal (el desuso), gatilla rápidos cambios adaptativos en la musculatura y hoy en día se hace esencial comprender los mecanismos biológicos involucrados pues a partir de este conocimiento se pueden desarrollar estrategias para detener, controlar o revertir la pérdida de musculatura y la consecuente disminución en la funcionalidad y la calidad de vida de quienes la padecen. AGRADECIMIENTOS Los autores han recibido financiamiento de la Dirección de Investigación y Perfeccionamiento (Proyecto DIPUCM 18403) y de la Oficina del Postgrado de la Universidad Católica del Maule. Ramón Pinochet es Becario Presidente de la República – Chile y José Luis Márquez es becario CONICYT - Chile. pág. 102 UCMaule - Revista Académica N°35 -Diciembre 2008 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adams, G.; Caiozzo, V. & Baldwin, K. (2003) Skeletal muscle unweighting: spaceflight and ground based models J Appl Physiol 95: 2185-2201. Awedea, B.; Thissenb, J.P.; Gaillya, P. & Lebacqa, J. (1999) Regulation of IGF-I, IGFBP-4 and IGFBP-5 gene expression by loading in mouse skeletal muscle. FEBS. 461: 263-267. Bar-Shai, M.; Carmeli, E.; Ljubuncic, P. & Reznick, A.Z. (2008) Exercise and immobilization in aging animals: the involvement of oxidative stress and NFkappaB activation. Free Radic Biol Med. 44(2):202-14. Bodine, S.C.; Latres, E.; Baumhueter, S.; Lai, V.K.; Nunez, L.; Clarke, B.A.; Poueymirou, W.T.; Panaro, F.J.; Na, E.; Dharmarajan, K.; Pan, Z.Q.; Valenzuela, D.M.; DeChiara, T.M.; Stitt, T.N.; Yancopoulos, G.D. & Glass, D.J. 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