Manual Pneumo CLART bacteria V1 castellano

Pneumo CLART bacteria®
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE BACTERIAS CAUSANTES DE INFECCIONES
RESPIRATORIAS HUMANAS
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
1
Pneumo CLART bacteria®
Amplificación
48 determinaciones Ref: CS-1013-48
16 determinaciones Ref: CS-1013-16
Detección
48 determinaciones Ref: CS-1213-48
16 determinaciones Ref: CS-1213-16
CLART y CLART-Strip, Pneumo CLART bacteria son marcas registradas por GENOMICA
Para ampliar la información descrita en este manual puede consultar la siguiente página web:
www.genomica.com
Marcado CE
Los microorganismos Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Bordetella holmesii,
Bordetella bronchiseptica son de uso exclusivo en investigación.
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain
Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
Versión 1
Octubre 2013
2
ÍNDICE:
1. GLOSARIO DE TÉRMINOS
2. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
3.1. Reactivos de amplificación
3.2. Reactivos de visualización
3.3. Otros componentes
4. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
4.1. Reactivos y material
4.2. Equipos
5. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
5.1. Recomendaciones generales
5.2. Precauciones para la extracción y la adición del material extraído al tubo de
amplificación
5.3. Precauciones para la amplificación
5.4. Precauciones para la visualización
6. MUESTRAS
7. PROTOCOLO DE TRABAJO
7.1. Extracción automática del material genético.
7.2. Reacción de amplificación
7.3. Visualización del producto amplificado
8. LECTURA DE RESULTADOS
9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
11. BIBLIOGRAFÍA
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1.-GLOSARIO DE TÉRMINOS
Atención, ver instrucciones de uso
Fecha de caducidad
Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro
Lote
25ºC
Conservar a temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 4 ºC y 8 ºC
4ºC
-18ºC
Conservar entre –30 ºC y –18 ºC
- 30ºC
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2.-DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
Pneumo CLART bacteria® detecta la presencia de las principales bacterias causantes de infecciones
respiratorias humanas en las siguientes muestras clínicas: esputos, lavado/exudados/aspirados
nasofaríngeos, lavado broncoalveolar (BAL) y broncoaspirados (BAS).
A continuación se detallan las bacterias detectadas:
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•
•
•
•
•
•
Staphylococcus aureus1, 2
Streptococcus pneumoniae2
Haemophilus influenzae2
Haemophilus spp2
Moraxella catarrhalis2
Chlamydophila pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Bordetella pertussis
Bordetella parapertusis
Bordetella bronchiseptica
Bordetella holmesii
Bordetella spp.3
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Incluyendo la detección del transposón responsable de la aparición de la resistencia a meticilina,
mecA. La presencia de mecA puede ser debida a la presencia de S. aureus, o de cualquier otro
Staphylococcus Coagulasa Negativo (SCN) presente en la muestra. En el informe de este kit solo se
informa de la presencia de mecA en presencia de S. aureus.
2
Estos microorganismos pueden estar presentes en la flora comensal del paciente de forma
habitual; de manera que un resultado positivo del kit debe valorarse teniendo en cuenta la
anterior circunstancia.
3
El resultado de Bordetella spp. aparecerá cuando el software no sea capaz de distinguir entre las
especies de Bordetella anteriormente mencionadas.
La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento específico para cada
microorganismo cuyo tamaño oscila entre 150 y 550 pares de bases.
Para evitar los falsos negativos, el tubo de PCR incorpora dos tipos de controles:
- Control interno de amplificación. Su detección asegura el buen funcionamiento del
proceso de amplificación.
- Control DNA genómico. La detección de este fragmento confirma que durante la etapa de
extracción se ha aislado material genético.
La detección del producto amplificado por PCR se lleva a cabo mediante una plataforma
tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART® (Clinical Array Technology). La
plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo pero a la vez muy cómodo y eficaz que
consiste en imprimir un microarray en el fondo de un pocillo de placa microtiter (CLART® Strip-CS)
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(Figura 1), lo que simplifica todo el proceso de hibridación y visualización frente a los sistemas de
microarrays clásicos.
Figura 1. Plataforma CLART® Strip-CS en forma de tira de 8 pocillos.
El sistema de detección con Pneumo CLART bacteria® se basa en la precipitación de un
producto insoluble en aquellas zonas del microarray en las que se produce la hibridación de los
productos amplificados con las sondas específicas. Durante la PCR, los productos amplificados se
marcan con biotina. Después de la amplificación, estos productos se hibridan con sus respectivas
sondas específicas que están inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del microarray, tras lo
que se incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a través de la
estreptavidina con la biotina presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran
unidos a sus sondas específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto
insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas del microarray en
las que ocurre la hibridación (Figura 2).
Producto marcado
6
Sondas sobre array
biotina
Hibridación
Conjugado
Incubación
con el conjugado
Reacción de revelado
Precipitación
del sustrato
Figura 2: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la
superficie, capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A
través de la biotina, se une el conjugado, en este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de
rábano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la acción de la HRP, produce
un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridación.
3.-COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
El kit Pneumo CLART bacteria® contiene suficientes reactivos para el análisis de 16 ó 48
muestras clínicas. Los reactivos incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas, dependiendo de
la temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son estables en las condiciones
indicadas de conservación hasta la fecha de caducidad del kit.
3.1. Reactivos de amplificación
Se envían y se conservan a -20 ºC.
• PK (Proteinasa K 10X). Una vez descongelada se debe mantener en hielo y guardar a
4ºC. No usar este reactivo si ha transcurrido más de un mes tras su descongelación.
• Tubos de Amplificación (tubo blanco) listos para su uso. Contienen 45 µl de mezcla
de reacción. Sólo se deben descongelar sobre hielo el número preciso de tubos de
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amplificación que se vayan a procesar en ese momento, conservando el resto de los
tubos a -20ºC.
Para garantizar la integridad de los reactivos y la cadena del frío del producto, en la caja
del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de temperatura. La aparición de un
color rojizo en la ventana de visualización indica que en algún momento los productos
han sobrepasado la temperatura de conservación de –20oC y no deben utilizarse.
3.2. Reactivos de visualización
El kit de visualización se envía a 4 ºC.
¡ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, las tiras CLART Strips® (CS) deben conservarse a
temperatura ambiente.
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•
•
•
•
Tiras CS (incluyendo las sondas específicas). Se suministran en un sobre
termosellado. Conservar siempre cerrado (máx. 25ºC), a temperatura ambiente y
protegido de la luz.
SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4ºC
DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC.
CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC.
RE (Solución de Revelado). Conservar a 4 ºC y protegido de la luz.
TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4 ºC.
Soporte y tapa para tiras de 8 pocillos.
3.3. Otros componentes
Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesitan los siguientes
componentes:
•
Lector CAR® (Clinical Array Reader): permite la lectura e interpretación automática de
hasta 12 tiras de arrays CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras.
•
Adaptador metálico que se coloca sobre la bandeja del CAR, sobre el cual se acopla la
placa antes de la lectura.
•
SAICLART®: software desarrollado por GENOMICA para el procesamiento de
imágenes.
•
Software específico del kit Pneumo CLART bacteria® diseñado y validado por
GENOMICA.
CAR®
(Clinical Array Reader)
8
4.
MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
A continuación describimos todo el material requerido que no es suministrado con
el kit.
4.1. Reactivos y material
- Agua destilada.
- Guantes desechables.
- Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo.
- Recipiente con hielo picado.
- Tubos tipo eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
- Gradillas para tubos de 1,5 ml.
- Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
- Suero salino (0.9% NaCl).
4.2. Equipos
- Microcentrífuga.
- Termociclador.
- Cabina de flujo laminar para el laboratorio de extracción.
- Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para el
laboratorio de pre-PCR.
- Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir el material genético a
los tubos de amplificación.
- Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl , 20-200 µl y 200-1000 µl para el
laboratorio de post-PCR.
- Termobloque ajustable a 56°C. Compatible con tubos.
- Termobloque con agitación ajustable a 25°C, 30°C y 56 ºC. Compatible con
placas de 96 pocillos.
- Vórtex.
- Sistema de vacío.
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5.- RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
¡Muy importante para evitar contaminaciones!. Leer detenidamente antes de comenzar
la técnica.
5.1. Recomendaciones generales
1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para evitar la
contaminación de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada una de
las áreas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas, puntas, tubos,
gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas.
1. Área pre-PCR: En este área se hace la preparación de las muestras, la
extracción del ADN y la adición del material extraído a los tubos de amplificación.
Dicha preparación de las muestras para su extracción debe realizarse dentro de
una cabina adecuada y con las medidas de esterilización más amplias posibles
para evitar contaminaciones.
2. Área post-PCR: En esta área se lleva a cabo la amplificación y la visualización
del producto amplificado. El material de este área nunca ha de entrar en
contacto con el del área de extracción. Evitar ir al área de pre-PCR después de
haber estado trabajando en el área de visualización.
2. Utilizar guantes en todo momento. Ver punto 5.2.
Es recomendable cambiarse de guantes con cierta frecuencia y obligatoriamente cada vez
que se empieza a trabajar en las áreas antes descritas. Siempre hay que utilizar guantes
nuevos cuando se añada el ADN a los tubos de amplificación.
3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas) en profundidad con
lejía diluida al 10% cada vez que se procese una tanda de muestras, y obligatoriamente
después de una contaminación. En el caso de termocicladores y termomixers, se
recomienda limpiarlos antes y después de su uso, en estas mismas condiciones.
4. Emplear siempre puntas con filtro y pipetas de desplazamiento positivo para evitar
contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un juego de pipetas
diferente para cada área.
5. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo.
6. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado.
7. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes, aunque sean del mismo lote.
8. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para evitar
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contaminaciones.
9. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si se emplean
otras condiciones distintas a las indicadas.
5.2. Precauciones para la extracción y la adición del material extraído al tubo de
amplificación.
La mayoría de las bacterias que detecta el Pneumo CLART® bacteria se hayan presentes
en la superficie de la piel, es por tanto, muy importante evitar las contaminaciones con
dichos microorganismos. Para ello se deben seguir las siguientes precauciones:
•
•
•
•
•
•
Desinfectar la piel de las manos y antebrazos con gel desinfectante o etanol al
70%. Cubrir la superficie desinfectada con guantes de puño largo.
Los guantes deben colocarse sin tocar con los dedos más que el borde de los
mismos.
Evitar tocar la piel o el pelo mientras se están manipulando las muestras. En caso
de hacerlo cambiar de guantes.
Limpiar las superficies de trabajo de la cabina de extracciones con lejía diluida al
10%.
Encender el flujo laminar y la luz UV al menos 20 minutos antes de comenzar la
extracción. Apagar la luz UV cuando se esté trabajando dentro de la cabina.
La preparación de las muestras antes de su extracción, debe hacerse dentro de la
cabina.
5.3 Precauciones para la amplificación
• Colocar los tubos de amplificación en el termociclador cuando el bloque haya
sobrepasado los 90 ºC. De este modo se minimizan las posibles amplificaciones
inespecíficas debidas a incubación por debajo de la temperatura de hibridación.
5.3 Precauciones para la visualización
1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el fondo del pocillo, ya que
podría dañarse el microarray situado en el fondo/pocillo.
2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del pocillo CS, nunca directamente
sobre el fondo.
3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los productos
desnaturalizados de PCR.
4. El array no debe quedar seco en ningún momento.
5. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el microarray para
evitar que queden restos de éste y que reaccionen con la solución RE, produciendo un
precipitado inespecífico que pueda dar lugar a interpretaciones erróneas del resultado.
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6. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de los distintos
reactivos.
7. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores de
posición y que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En caso
contrario, limpiar el fondo del pocillo con un papel de celulosa impregnado de alcohol.
6. MUESTRAS:
El kit Pneumo CLART bacteria® ha sido diseñado y validado para su uso a partir de los
siguientes tipos de muestras respiratorias: esputos, lavado/exudados/aspirados
nasofaríngeos, lavado broncoalveolar (BAL), broncoaspirados (BAS). GENOMICA no se
responsabiliza de los resultados si se utilizan otros tipos de muestras.
Conservar las muestras a 4ºC siempre que se vayan a procesar en un tiempo inferior a 12h.
En caso contrario se deben almacenar congeladas a -20ºC.
7. PROTOCOLO DE TRABAJO
7.1. Extracción automática en NucliSENSTM EasyMag DNA de Biomerieux
•
•
•
•
•
Por cada serie de muestras a analizar, incluir un control negativo de extracción (suero
salino 0.9%) para comprobar que las muestras no hayan sufrido contaminaciones
durante los procesos de extracción, amplificación y visualización; lo que daría lugar a
un falso positivo.
Para muestras líquidas transferir 200µl de muestra a un tubo de 1,5ml. Para muestras
más densas añadir 1ml de suero salino, dar un vórtex y transferir 200µl de muestra a
un tubo de 1,5ml.
Añadir 50µl de PK.
Incubar 30 min. a 56ºC con agitación o en su defecto dando un vórtex cada 10 min.
Tranferir 250µl de muestra al extractor. Realizar en el equipo NucliSENSTM EasyMag
DNA una lisis interna y extracción, siguiendo la guía de usuario del equipo para el
protocolo “Generic”. Hay que identificar en el programa el volumen de elución de 25
µl.
Si se utilizara otro sistema de extracción distinto se debería optimizar el volumen de
elución en el rango de 20-30 µl y tomar el mismo volumen de muestra de partida.
GENOMICA ha validado únicamente esta extracción automática por lo que puede
haber pequeñas diferencias en el resultado si se emplean otros métodos distintos.
7.2. Reacción de amplificación
Recomendaciones específicas para la amplificación:
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• Trabajar en el área pre-PCR, siempre en cabina de seguridad y siguiendo las
recomendaciones del punto 5.1.
• Añadir el ADN, siempre en cabina y siguiendo las recomendaciones del punto 5.1.
Durante el proceso mantener los tubos separados y en refrigerados.
1. Descongelar un tubo de amplificación por cada muestra a analizar. Mantenerlos en hielo y
no usar temperaturas superiores a 37ºC para la descongelación.
2. Centrifugar unos segundos los tubos de amplificación con el fin de que quede todo el
líquido en el fondo del tubo (si no se dispone de adaptadores de microcentrífuga, se pueden
utilizar en su lugar tubos de un tamaño mayor a los que se les haya cortado la tapa).
3. Añadir 5 µl del ADN extraído de la muestra al tubo de amplificación y resuspender varias
veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el hielo.
4. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas:
1 ciclo
45 ciclos:
1 ciclo
95ºC 15 min
95ºC 30 seg
59ºC 60 seg
72ºC 60 seg
72ºC 10 min
5. Iniciar el programa y colocar los tubos de amplificación en el termociclador cuando el
bloque haya sobrepasado los 90 ºC.
7.3. Visualización del producto amplificado en CLART Strip® (CS)
Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización:
EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL ÁREA
POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL ÁREA DE PRE-PCR.
1. Encender el CAR® (Clinical Array Reader) al comienzo del proceso. La autocalibración del
equipo tarda unos minutos y es necesario además introducir el nombre de las muestras de
cada pocillo en el programa antes de la lectura.
2. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de placas ha estado a
56ºC al menos 1 hora.
3. Colocar la SH en el termomixer en el momento que se encienda a 56ºC.
4. Preparar la solución de lavado antes de cada ensayo, no reutilizar soluciones o restos
preparadas con anterioridad.
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5. Usar una punta con filtro diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se añada un
reactivo.
6. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas para aspirar las
soluciones, desechar los peines después de cada uso o descontaminarlos con una solución
de lejía diluida al 10% tras cada ensayo. Asegurarse de que la bomba aspira
adecuadamente y no deja restos en el fondo del pocillo.
7. Aspirar completamente las diferentes soluciones dentro de los pocillos sin tocar el array.
VISUALIZACIÓN:
1. Desnaturalización: Colocar los tubos amplificados en el termociclador cuando éste haya
alcanzado 95ºC e incubar los tubos durante 10 minutos. No sobrepasar los 10 min. para
evitar que los tubos se abran y puedan aparecer contaminaciones.
Sacar los tubos de la incubación a 95ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con
hielo.
2. Preparación de la Solución TL diluida:
Por cada tira CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado diluida,
añadiendo 1 ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada, agitar suavemente.
3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los CS añadiendo 200
µl de Solución TL diluida a cada pocillo. Resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta
multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la superficie del array. Se
recomienda realizar este lavado mientras se están desnaturalizando los amplificados y
mantener la solución de lavado en los pocillos hasta que se vaya a proceder a la adición
de los mismos. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba
de vacío.
El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer seco. Añadir
la siguiente solución inmediatamente.
4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH calentarla a 56ºC hasta la desaparición de los
cristales. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de solución SH
(evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los CS. Añadir a cada pocillo 5 µl de
producto de PCR desnaturalizado del tubo de amplificación que se haya utilizado por
muestra.
Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación SH, con
cuidado de no tocar el fondo del pocillo. Se recomienda cargar cada tira de manera
independiente y separada del resto para evitar contaminaciones. Incubar la tira cubierta
con la tapa de plástico transparente en el termomixer de placa tapado durante 1 hora a
56º C, agitando a 550 rpm.
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Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH de los CS con pipeta o bomba
de vacío: El array debe quedar sin restos de solución. Añadir la siguiente solución
inmediatamente. (Dejamos programado el termomixer de placa a 30ºC para su utilización
posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura).
5. Doble Lavado: añadir 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10
a 15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o
preferiblemente con bomba de vacío multicanal sin dejar remanente. Repetir la
operación. Este paso se debe realizar con puntas diferentes para cada pocillo en ambos
lavados. Si llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30º C, se dejan los
pocillos con esta solución hasta que el termomixer alcance la temperatura.
6. Bloqueo y conjugado: se recomienda centrifugar la solución CJ durante 10 segundos antes
de usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Por cada tira CS, se añade 1 ml
de solución DC y 7.5 µl de Solución CJ.
Desechar la Solución TL diluida sin dejar restos de solución y añadir a cada pocillo del CS
100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos en el termomixer de
placa a 30oC, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la
solución rápidamente con pipeta o bomba de vacío multicanal. (Dejar programado el
termomixer de placa a 25oC para su utilización posterior en el paso 8. Podemos quitar la
tapa para que baje antes la temperatura).
7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS,
resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y desechar completamente la
solución con la pipeta o vacío. Repetir la operación dos veces más.
Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la
Solución RE dando lugar a una señal inespecífica.
8. Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida completamente y añadir 100 µl de
solución RE a cada pocillo del CS e incubar 10 minutos a 25oC en el termomixer de placa
sin agitación.
¡Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación
9. Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array debe quedar seco.
10. CAR (Clinical Array Reader): Se coloca en el CAR el adaptador y encima la placa para tomar
las imágenes de todos los pocillos para posteriormente ser analizadas automáticamente.
8. LECTURA DE RESULTADOS
El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de forma
automática. El equipo de lectura y análisis presenta un informe en el que se indican los resultados.
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En la pantalla del equipo aparece una tabla con dos columnas, en la columna de la izquierda se
muestran las especies que se caracterizan en el array. En la columna de la derecha, el resultado
analítico: positivo, negativo, no concluyente, no válido.
9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos negativos
debidos, bien a una calidad inadecuada del ADN extraído de la muestra (por toma de cantidad
insuficiente de muestra, por degradación del ADN debida a una incorrecta conservación, o por
pérdida del ADN de la muestra durante su extracción), o bien a la presencia de inhibidores de la
ADN polimerasa en las muestras en las que se quiere analizar la presencia del microorganismo
(hemoglobina, sales, etc).
Con el kit Pneumo CLART bacteria® se han eliminado estos falsos negativos añadiendo al tubo de
amplificación un control interno, indicativo de la eficiencia de la reacción de amplificación.
También se ha incluido en el tubo un control de extracción para detectar falsos negativos debido a
fallos en la extracción.
En toda tanda de análisis que se procese se debe incluir un control negativo de extracción, para
comprobar que las muestras no hayan sufrido contaminaciones durante los procesos de
extracción, amplificación y visualización; lo que daría lugar a un falso positivo.
El tubo de amplificación contiene los siguientes oligonucleótidos:
•
Un par de oligonucleótidos que amplifican un fragmento del gen de la β-globina humana
como control de extracción de ADN del paciente.
•
Un par de oligonucleótidos que amplifican un plásmido modificado incluido en el tubo de
amplificación y que se usa como control de amplificación de la reacción de PCR.
Oligonucleótidos específicos de las dianas indicadas para los patógenos a detectar.
•
El tubo de PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de las dianas indicadas para los
patógenos a detectar frente a la de los dos controles (de extracción y amplificación). En relación a
estos últimos, la amplificación del control de extracción está favorecida sobre la del control de la
reacción de amplificación.
La razón de este diseño es:
El control de extracción es necesario para la confirmación de un verdadero resultado negativo,
ya que nos informa de la presencia de ADN del paciente en la muestra, aunque no haya habido
amplificación de ningún patógeno.
El control interno de amplificación nos permitirá distinguir entre los casos de inhibición de la
reacción de PCR y aquéllos en los que no se encontró ADN en la muestra.
Existen 3 resultados posibles para una muestra:
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1. Resultado Positivo: Presencia de una determinada bacteria en la muestra del paciente.
2. Resultado Negativo: Ausencia de una determinada bacteria en la muestra del paciente.
3. Resultado No concluyente. Existen tres posibilidades que dan lugar a ello
3.1. No concluyente con control de PCR Inhibida. Se produce un fallo en la amplificación y/o la
extracción. En cuyo caso habría que repetir desde la extracción.
3.2. No concluyente con control de No ADN. Se produce un fallo durante la extracción. En
cuyo caso habría que repetir desde la extracción.
3.3. No concluyente con control Conforme. Se dan dos casos; aquellos en que las réplicas de
una sonda del array sean muy distintas entre sí, y los que la intensidad de la señal de
absorbancia no normalizada se encuentre en el límite de detección de la técnica, cuyo rango
está establecido por el software para cada tipo de microorganismo.
En ambos casos hay que repetir la visualización.
10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
10.1 Control de interferencias conocidas:
Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos negativos
debidos a, una calidad inadecuada del ADN extraído (por insuficiente cantidad de muestra,
degradación del ADN, pérdida del ADN, almacenaje incorrecto), o a la presencia de inhibidores de
la DNA polimerasa en las muestras a procesar (alcohol, sales, etc.). Para evitar estas interferencias,
deben seguirse las indicaciones que aparecen en las secciones 5, 6 y 7 de este manual.
10.2 Especificaciones técnicas:
Parámetros Analíticos:
• Sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica se ha determinado mediante la amplificación
de diluciones seriadas de ADN de plásmidos recombinantes para cada uno de los
microorganismos detectados en el kit. Cada uno de ellos lleva inserto el producto
amplificado (incluyendo la parte complementaria a las sondas específicas de detección) de
ADN genómico de cepas tipo de colección. La visualización se realizó en CS dando lugar a los
siguientes resultados (Tabla 1):
CLON
Copias/5
ul
Moraxella catharralis
Mycoplasma pneumoniae
17
102
10
Chlamydophila pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
mec A
Staphylococcus aureus
Bordetella pertussis
102
102
102
102
102
102
Borderella parapertussis
Bordetella holmesii
Bordetella bronchiseptica
102
102
102
Tabla 1. Relación del número de copias de plásmido recombinante necesarias para obtener
una sensibilidad del 100% en la detección de cada uno de los microorganismos.
• Especificidad analítica. Se llevaron a cabo experimentos de especificidad con todos los
plásmidos recombinantes, observándose que no se produce detección inespecífica de otros
microorganismos diferentes al que se quiere determinar. Por tanto, se considera que la
técnica alcanza una especificidad analítica del 100%.
Parámetros de utilidad diagnóstica:
Para determinar los parámetros diagnósticos del kit, se realizó una evaluación comparativa
de la técnica Pneumo CLART bacteria® con las técnicas de referencia de cultivo y/o PCR. Para
esta evaluación se colaboró con los centros siguientes:
•
•
Departamento de Microbiología, Hospital Universitario Germans Trias i Pujol,
Badalona, España.
Departamento de Microbiología, Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid,
España.
A partir de muestras respiratorias se extrajo el material genético y se analizó la presencia de
cada uno de las bacterias. Se analizaron un total de 267 muestras.
Para cada muestra se asumió como verdadero el resultado concordante entre la técnica de
referencia y Pneumo CLART bacteria®. Las discordancias entre ambas técnicas, se
resolvieron de la siguiente manera:
18
-
-
Resultado positivo por la técnica de referencia y negativo por Pneumo CLART
bacteria®: Se consideró correcto el dato de la técnica de referencia y, por lo tanto,
falso negativo de Pneumo CLART bacteria®.
Resultado negativo por la de referencia y positivo por Pneumo CLART bacteria: se
analizó la discrepancia mediante Nested-PCR específica y secuenciación. El
resultado obtenido es el que se consideró como verdadero.
Tabla 2. Parámetros diagnósticos de sensibilidad y especificidad para el kit Pneumo CLART
bacteria®.
1
(N= 267)
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus sp./H. influenzae
Moraxella catarrhalis
Bordetella pertussis
Bordetella parapertussis
Gold
standard
63
89
187
77
10
1
Sensibilidad(%)
89,7±2,4
89,3±1,7
96,8±0,5
98,7±1,3
100
100
Especificidad (%)
99,75±0,25
98,6±0,3
100
100
100
100
VPP (%)
99,1±0,9
96,9±0,6
100
100
100
100
VPN (%)
96,9±0,7
94,9±0,8
93,1±1,1
99,5±0,5
100
100
1
175 Esputos, 12 Aspirados nasofaríngeos, 6 BAL (Lavado bronquial), 69 BAS
(Aspirado bronquial), 4 Exudados nasofaríngeos, 1 Secreción respiratoria.
NOTA: Debido a la baja prevalencia no se ha contado con muestras positivas para los siguientes
microorganismos: Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Bordetella holmesii y
Bordetella bronchiseptica Por lo tanto, no se ha podido identificar la sensibilidad diagnóstica del kit
para estos patógenos. En todos los casos se ha evaluado la sensibilidad analítica mediante
plásmidos recombinantes y ADN de cepas de colección (colección DSMZ).
-Especificidad diagnóstica.
La técnica se ha validado con muestras tanto negativas como positivas para otros
microorganismos no contemplados en el kit, y los resultados demuestran que no hay
reacción cruzada con los mismos.
-Repetibilidad y reproducibilidad diagnóstica por tipo de muestra.
La reproducibilidad y repetibilidad diagnóstica se ha procesado desde la extracción de la
muestra hasta la visualización en CS.
19
Valoración numérica de los experimentos de Repetibilidad y Reproducibilidad:
% homología
93.7
88.7
Repetibilidad (n=58)
Reproducibilidad (n=53)
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11. BIBLIOGRAFÍA
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Methods”. Swati Kumar and Margaret R. Hammerschlag. Clinical Infectious Diseases 2007; 44:568–
76.
“Limited Utility of Culture for Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae for
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MICROBIOLOGY, Sept. 2010, p. 3380–3382
“Associations between Pathogens in the Upper Respiratory Tract of Young Children: Interplay
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Wouter A. A. de Steenhuijsen Piters, Astrid A. T. M. Bosch, Elske J. M. van Gils, Xinhui Wang,
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Begoña Cacho Calvo, María Antonia Meseguer Peinado, Antonio Oliver Palomo, Jorge Puig de la
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Batista Díaz, Ana Bordes Benítez, Oscar Díez Gil, María Lecuona Fernández, Magdalena Lara
Pérez, Protocolos SEIMC 2006.
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