Factores que Influyen la Microbiología en los Alimentos
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Factores que Influyen la Microbiología en los Alimentos Dr. Esther Z. Vega Microbiología Aplicada Bosquejo • Métodos de detección y cuantificación • Factores internos y ambientales que controlan el crecimiento bacteriano • Cinética de crecimiento bacteriano • Fisiología y metabolismo de microorganismos de origen alimentario Ecosistemas, homeostasis y tecnología de defensa • Ecología “the study of the interactions between the chemical, physical, and structural aspects of a niche and the composition of its specific microbial population” Commission on Microbial Specifications for Foods Ecosistemas, homeostasis y tecnología de defensa • Los alimentos son ecosistemas – Organismos – Ambiente • Factores intrínsecos (pH, Aw, nutrientes) • Factores extrínsecos (temperatura, ambiente gaseoso, presencia de otras bacterias) • Preservación por manipulación de los factores – Los alimentos pueden contener múltiples microambientes Microbiología clásica y sus limitaciones • Limitaciones en la detección y métodos de enumeración – – – – – – – Contaje de placas Medio selectivo, diferencial Método número más probable Técnicas de enriquecimiento Células dañadas Viable no cultivable Factores intrínsecos que influyen en el crecimiento microbiano – Factores extrínsecos que influyen en el crecimiento microbiano • Homeostasis y tecnología de defensa • Cinética de crecimiento Limitaciones de contaje de placas • Asume – Cada célula forma una colonia – Cada colonia proviene de una sola célula bacterial – Algunas colonias puede ser originadas de una “agrupamiento”de bacterias • Se reporta como - Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo ó ml. - NO como bacterias totales Limitaciones de contaje de placas • Factores que afectan la formación de colonias por una célula – Estado fisiológico de la célula – Medio de cultivo utilizado en la enumeración – Temperatura de incubación Limitaciones del contaje de placas • Sólo se consideran organismos aeróbicos • No se sabe el tipo de bacteria • El medio de cultivo permite el crecimiento de ciertas bacterias • Limitaciones visuales/Errores humanos • Difícil de distinguir entre partículas de alimentos y bacterias • No se debe utilizar en alimentos fermentados • Las colonias podrían ser muy pequeñas para verse Tipos de muestra • Líquidas – Líquidos no viscosos se miden con pipetas – Líquidos viscosos se pesan • Sólidas – Pesar asépticamente • Hisopo – Tomar muestra pasando un hisopo por un área definida • Ambientales y de envases – Enjuage el interior del envase – Abra una placa para tomar una muestra del aire – Placas RODAC Protocolo para Contaje en Placas • Prepare un homogenado de la muestra – Dilución 1:10 – 1 parte de la muestra a 10 partes del volumen total • Mezcle en licuadora o “stomacher”por 2 minutos 10 g/ml muestra 90 ml of diluyente 1:10 Dilución – 10-1 Protocolo para contaje en placas • Prepare diluciones seriadas – Diluya hasta que obtenga colonias separadas entre 25-250 en una placa – Utilice una pipeta estéril entre cada dilución – Ponga la pipeta usada en el área designada • Mezcle cada botella de dilución 25 veces en un arco de 90 grados por 7 segundos • Use amortiguador de fosfato ó peptona para diluir Diluciones Sample Homogenate Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent 10 ml 10-1 (1:10) 10 ml 10 ml 10-2 10-3 (1:100) (1:1000) 10 ml 10-4 (1:10000) 10-5 (1:100000) Placas Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish 10-1 1 ml 1 ml 10-2 1 ml 1 ml 10-3 10-4 10-5 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Protocolo Contaje de placas • Añada 18-20 ml de agar (45-50oF), a la placa petri – El agar no puede estar muy caliente porque mata las bacterias • • • • Método estándar ó agar de placa (Plate Count Agar) Mueve 10x en cada dirección Deje que solidifique Incube las placas invertidas a 35-37oC por 48 horas. – Atmósfera (aeróbico, anaeróbico, microaerófilico) – Temperatura • Enumeración – Número de colonias promedio por placa • Placas entre 25 y 250 colonias Contaje de placa aeróbica • Provee un estimado general de bacterias aeróbicas vivas • Evalúa calidad • Predictor de “shelf-life” • Monitoreo ambiental • Excluye – Anaerobos obligados – Microaerofílicos Resultados del Contaje de placa aeróbica • • • • Evalúa la sanitación de una producto Predice la durabilidad (Shelf-life) Indicador de seguridad (Safety) Monitorea el ambiente Medio microbiológico • Provee nutrientes para el crecimiento de los microorganismos – Caldo • Usualmente se utiliza para crecer cultivos puros • Utilizado para enumeración a través de la técnica de MPN Medio microbiológico •Agar sólido •Agar- agente gelatinizante sin valor nutricional •Líquido a 45oC, sólido a temperatura ambiente •Células bacteriales están atrapadas en el agar tal que puedan ser enumeradas •Utilizado para aislar •Puede ser no-selectivo, selectivo o diferencial Medio selectivo y diferencial • Selectivo – Se añade un ingrediente al medio para inhibir el crecimiento de ciertos tipos de organismos y ayudar el crecimiento de otros • Diferencial – Se le añade algo para diferenciar entre organismos diferentes i.e. cambio en color Métodos de Número más Probable (MPN) • MPN – Basado en probabilidad estadística – NO es contaje directo – Técnica líquida Métodos de Número más Probable (MPN) • Estima número de organismos en muestra cuando se encuentran en bajas concentraciones • Se utiliza comúnmente para E. coli y coliformes • Se añaden agentes selectivos • Método de 3 ó 5 tubos • Límite más bajo de sensitividad (3 tubos) <3.0 bacteria/gm MPN - Continuación El objetivo es “diluir el organismo • Seleccione la muestra más diluída con todos los tubos positivos y los próximos dos – 3,2,1 – Nuestra combinación • Determine el MPN utilizando la tabla de MPN Técnicas de enriquecimiento • Cero tolerancia – Salmonella – Listeria monocytogenes – E. coli O157:H7 • ¡No se necesita enumeración! • Detección – Medio de pre-enriquecimiento con medio selectivo enriquecido – Se pone en placa en medio selectivo – Confirmación bioquímica y genética Células dañadas Una célula puede ser dañada en lugar de matada por niveles sub-letales de calor, radiación, ácidos o agentes sanitizantes. Resultado: Menor resistencia a agentes selectivos o aumento en sus requerimientos nutricionales. Células dañadas Tabla 2.3 Valor D55C- tiempo requerido para eliminar 90% de la población a 55oC. Figura 2.3 Células dañadas: Causas ambientales • Calor subletal • Congelamiento subletal • Secado “freeze drying” • Secado • Radiación • Químicos – – – – – – – – Tintes Sodium azide Sales Metales pesados Antibíoticos Aceites esenciales EDTA Compuestos sanitizantes Células dañadas: Factores influyentes La acción de dañar una célula es un proceso complejo, influeciado por: • Tiempo • Temperatura • Concentración de agente • Cepa de organismo • Metodología experimental L. monocytogenes crecida a <28 C expuesta a 52 C reducción por muerte de 3-4 log. o o Crecida a 37 o 42oC, 2-3 logs de daño cuando se exponen a 52oC. Células dañadas: Características de las células • Aumento en el tiempo de la fase lag de crecimiento (efecto de reparación) • Aumento en la sensitividad a la variedad de agentes selectivos en el medio de cultivo – Pérdida de la habilidad de formar colonias en medio selectivo Células dañadas: Efecto de estresores ambientales en las células • Membrana celular – Daños en los componentes lípidos • Enzimas de ciclo TCA • Otras enzimas – Coagulasa – Nucleasa termoestable • Ribosomas – Pérdida de Mg+2 • DNA • RNA Células dañadas: ¿Qué significa? • Imposible recuperar la cantidad verdadera de patógenos – Eficiencia del procesamiento del alimento es sobreestimada • E.g. valor D menor • Recuperación de patógenos dañados en alimentos – Problemas de seguridad – Problemas de contaminación • Agentes selectivos pueden ser ingredientes comunes de los alimentos e.g. sal Células dañadas: S. aureus Células de S. aureus dañadas por ácido durante la fermentación para la producción de embutidos puede crecer en TSA, pero no en TSA 7.5% NaCl. Estas células pueden reparse en el embutido si se mantiene a 35oC (pero no a 5oC), crecer y producir enterotoxina. Células dañadas: Detección • Pre-enriquecimiento no selectivo seguido de placas con medio selectivos – Agentes que reparan (e.g. piruvato, catalasa, oxirasa) • Placas de medio no-selectivo y medio selectivo – No-selectivo: dañadas y no-dañadas – Selectivo: no-dañadas Organismos viables pero no cultivables (VBNC): características de las células • Organismos que no son cultivables con medio no selectivo • Activos metabólicamente – Presencia de enzimas metabólicas • Síntesis de nuevas proteínas • Cambios en los lípidos celulares – “Nutrient uptake” • Cambios morfológicos – VNBC Campylobacter jejuni Organismos viables pero no cultivable (VBNC): Detección • Metabolismo de nutrientes radioactivos o fluorogénicos para viabilidad (acridina anaranjada:DNA:RNA) • Sondas de ácidos nucléicos – No provee información de viabilidad • Contaje directo de células viables por microscopía Organismos viables pero no cultivable (VBNC): Detección Patógenos de origen alimentario pueden convertirse a VBNC cuando el alimento es puesto a temperaturas frías en un medio rico nutritivamente. Resucitación de células VNC es demostrado por un aumento en cultivilidad pero no en un aumento en el número de células. Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Teorías • Teoría original: parte del ciclo normal de la bacteria • Resultados recientes: inducido por estrés – Bajas temperaturas (<15oC) – Falta de nutrientes • Reversión a una forma cultivable – Real? – Pocas células cultivables se multiplican Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Vibrio vulnificus • Figura 2.7 Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Significado • • • • • • Campylobacter jejuni Escherichia coli Vibrio vulnificus Salmonella enteritidis Shigella Vibrio cholerae ¡Un patógeno que no se detecta! Factores intrínsecos que influyen en el crecimiento microbiano • • • • • • Factores intrínsecos- características inherentes al alimento pH Contenido de humedad (Aw) Potencial de oxidación-reducción (Eh) Contenido nutricional Constituyentes antimicrobiales Estructuras biológicas Rangos de pH óptimos para crecimiento microbiano • pH Optimum Maximum Minimum Bacteria 6.5-7.5 9.0 4.5 Hongos 4.0-6.8 8.0-11.0 1.5-3.5 Levaduras 4.5-6.5 8.0-8.5 1.5-3.5 pH • El pH de un alimento es la medida de la “acidez” o “alcalinidad” de ese producto. La escala del pH abarca valores que oscilan entre 0 y 14. Un pH inferior a 7 es ácido, un pH de 7 es neutro y un pH superior a 7 es alcalino o básico. H2O Actividad de agua (Aw ) • Actividad de agua (Aw) proporción de agua presente en un alimento. También se conoce como la humedad relativa. • Rango: 0-1.0 (agua pura) H2O H2O H2O H2O H2O Aw Staphylococcus aureus puede crecer hasta un Aw de 0.86 Aw de alimentos • • • • • • Frutas y vegetales – 0.97-1.00 Carnes – 0.95-1.0 Pan – 0.95-1.0 Queso – 0.68-1.0 Mermeladas- 0.75-0.94 Miel – 0.54-0.75 Potencial de oxidación-reducción (Eh) • Oxidación – pérdida de electrones • Reducción – ganancia de electrones • Potencial de oxi-reducción – facilidad en que un sustrato en particular gana o pierde electrones (mV) – Eh negativo: sistema anaeróbico – Eh positivo: sistema es aeróbico • Un producto oxidado es +; uno reducido es - Potencial oxi-reductor (O-R) • El potencial oxi-reductor de los alimentos está influenciado por: –Composición química del alimento –Tratamiento que se aplica al procesarlo –Condiciones de almacenaje Eh de algunos alimentos • Origen vegetal: +400 mV • Queso: -20 a -200 mV • Carnes – Pre-rigor: +250 mV – Post-rigor: +10 a -130 mV – Carne molida: +300 mV ¿Cuál de las siguientes representa un Eh + ? Rango de crecimiento microbiano en relación a Eh Organismo aerobios Anaerobios facultativos anaerobios Rango de Eh De +500 a +300 mV De +300 a +100 mV De +100 a -250 mV Nutrientes • Los microorganismos muestran diversidad en sus requisitos nutricionales. • ¿Qué necesitan? – – – – – – Agua Fuente de energía Fuente de nitrógeno Vitaminas Factores de crecimiento Minerales Factores antimicrobiales naturales • • • • • Lisozima en el huevo Aglutinina en la leche Lacteninas en la leche Eugenol en los clavos Ácido benzoico en los arándanos Factores extrínsecos que afectan el crecimiento microbiano • Temperatura de almacenamiento • Humedad relativa del ambiente • Presencia y concentración de gases en el ambiente • Presencia y actividades de otros organismos Temperatura Humedad relativa • Muy alta: condensación, crecimiento • Muy baja: pérdida de humedad, inhibición de crecimiento Presencia y concentración de gases • Oxígeno o aire • Atmósfera anaeróbica • CO2 • Ozono Presencia y actividades de otros organismos • General – No específica – Inhibición o destrucción de un organismos por otro – Mecanismo • No está claro – Número de inhibidores > organismos blanco – Variedad de inhibidores » Competencia por nutrientes » Alteración no-favorable del ambiente » Combinación de factores Presencia y actividades de otros organismos • Antagonismo por lactato – Sustancias con actividad antimicrobiana de bacterias productoras de ácido láctico • • • • • • • Metabolitos de oxígeno Acidos orgánicos CO2 Diacetil Acetaldehído Bacteriocinas Antibíoticos Cinética de crecimiento Fisiología microbiana y metabolismo • Fermentaciones de alimentos • Daño de alimentos • Seguridad alimentaria Fisiología microbiana y metabolismo • Bacterias aeróbicas – Glucosa…CO2 (oxidación) – Oxígeno…H2O (reducción) – 38 ATPs • Fosforilación oxidativa en el sistema de transporte de electrones • Oxígeno es el aceptador final de electrones Fisiología microbiana y metabolismo • Bacterias anaeróbicas – No tienen sistema de transporte de electrones – Reducción de compuestos a través de fermentación – 1-2 ATP/mol de hexosa – Fosforilación a nivel de sustrato • P de compuestos orgánicos es transferido a nucleótidos de adenina para formar ATP Glucólisis- Flujo de carbón y fosforilación a nivel de sustrato fosfofructocinasa aldolasa Embden Meyerhof pathway Ruta EMP • 2 ATP/mol glucosa • Bidireccional • Enzimas claves: – Fosfofructocinasa – Aldolasa Ruta Entner-Doudoroff Zymomonas y Pseudomonas 1 ATP/mol glucosa 1 3C para biosíntesis Catabolismo heterofermentativo • Leuconostoc, Lactobacillus • Basado en catabolismo de pentosas • 1 ATP/mol hexosa Ruta heterofermentativa Catabolismo homofermentativo Lactococcus, Pediococcus, algunos Lactobacillus Bacterias homolácticas utilizan Ruta EMP para producir piruvato Ciclo TCA • Utilizado por todos los aeróbicos • Genera NADH2 and FADH como sustrato para fosforilación oxidativa • Genera ATP por medio de fosforilación a nivel de sustrato • Relacionado a biosíntesis de amino ácidos Aeróbicos: regeneración de NAD y respiración • Aeróbico – NADH2…NAD (oxidación – O2 es el aceptador final de e• Azufre y nitrito en “respiración anaeróbica – Transporte de e…gradiente de protones…ATP Anaerobos: regeneración de NAD y respiración • Anaerobos – Metabolismo fermentativo • El aceptador final de e- es un compuesto orgánico
