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21-327
460-801
619-746
802-923
1143-1810
1961-2818
Kit pMBL-T vector
No. Catálogo: MBL097 (20 reacciones)
MBL236 (20 reacciones)
Versión: 05/2012
GenBank: DQ059139
Descripción: El kit pMBL-T vector es un excelente sistema para la clonación de productos
de PCR amplificados con aquellas polimerasas que colocan adenina en los extremos 3’ de la
molécula. pMBL1-T se diferencian únicamente en las enzimas de restricción incluidas en el
sitio múltiple de clonación. Ambos confieren resistencia a ampicilina, cuentan con el origen de
replicación del fago f1 y mantienen, bajo el control del promotor lac, la secuencia del αpéptido de la β-galactosidasa.
MCS de pMBL1
Aplicaciones: Este kit permite:
- La ligación del inserto de interés con el vector pMBL-T en tan solo una hora.
- Una doble selección de las colonias: (1) Selección de colonias resistentes a ampicilina.
(2) Selección de colonias positivas blancas frente a las negativas azules debido a que el
policloning interrumpe la secuencia del α-péptido.
Nhe I
Not I
Sac I
Hind III
Eco RV
Stu I
Eco RI
Sma I
Spe I
Bam HI
Sal I
Apa I
Bsp 120I
Promotor T3
CGGTACCAGC TTTTGTTCCC TTTAGTGAGG GTTAATTGCG CGCTTGGCGT AATCATGGTC ATAGCTGTTT
Concentración final
1X
5 ng/µL
Reverse
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_
CCT
1
Este plásmido no ha sido secuenciado completamente.
Los primers M13 forward y M13 reverse flanquean el sitio de clonación a una distancia aproximada de 30 a 40 pb.
A diferencia de ApaI, la enzima Bsp120I (isoesquizómero PspOMI) corta dejando extremos 5’ protuberantes.
4
A diferencia de SacI, la enzima Ecl1136II corta dejando extremos romos.
2
3
CONTENIDO KIT
0,5 U/µL
La eficiencia de clonación usando la relación vector : inserto= 1:5 es mayor a un 90%:
cantidad vector(ng) * tamaño inserto(pb)
vector
= relación
tamaño vector(pb)*cantidad banda(ng)
inserto
*
Bgl II
Inserto de PCR
En un vial mezclar:
*
Xba I
Forward
Kpn I
Envío y almacenamiento del producto: El envío a temperatura ambiente no afecta su
actividad, sin embargo el almacenamiento de rutina a -20ºC es altamente recomendado.
1 µL T4 DNA ligasa 10X Buffer
1 µL pMBL T-Vector (50 ng/µL)
x µL DNA inserto*
1 µL T4 DNA ligasa (5U)
H2O hasta 10 µL
Xho I
GAGCTCAAGC TTGATATCAG GCCTCCCGGG GAATTCACTA GTCATATATG GGATCCGTCG ACTTTGGGCC
Control de calidad: Ligación de pMBL T-Vector con distintas cantidades de inserto. En
ninguno de los casos el número de colonias negativas (azules) superaba el 10% del total de
7
las colonias obtenidas. Los controles se llevaron a cabo sobre células con competencia ≥ 10 .
1.
Kpn I
Pst I
GTAAAACGAC GGCCAGTGAC TGCAGGGTAC CACGCGTCTC GAGTCTAGAA GATCTGCTAG CAGCGGCCGC
El kit contiene:
-pMBL T-vector (1µg, 50 ng/µL)
-T4 DNA ligasa (100 U, 5 U/µL)
-T4 10X Buffer (400mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5mM ATP, pH 25ºC=7,8)
-Inserto control de 600 pb (16 ng/µL)
Protocolo
Origen de replicación f1(-)
α-péptido
MCS
Promotor lac
Origen de replicación pUC
Resistencia a ampicilina
Esta efieciencia suele reducirse a medida que el fragmento a clonar es mayor. Sin
embargo, el empleo de secuencias PIG en los extremos 5’ de los primers a emplear
en al PCR permiten la clonacion de fragmentos grandes con una alta eficiencia.
Laadicion de secuencia PIG, GTTTCTT aumenta 9 veces la eficiencia de clonacion
de un fragmento de PCR de 3,5 kb.
2.
Incubar a una temperatura de entre 20º y 22º C durante una hora.
3.
Transformar con 5 µL de la mezcla de ligación para 50 µL de células competentes. No
superar el volumen de 7,5 µL de la mezcla de ligación para esta cantidad de células.
COMPONENTES
MBL097(20 rxn)
MBL236 (20 rxn)
pMBL-T Vector
20 reacciones
20 reacciones
T4 DNA Ligasa
20 µL
20 µL
10× Buffer T4 DNA Ligasa
200 µL
200 µL
—
2 x 10 reacciones
Células Químicamente
Competentes
Podrá encontrar más información en http://www.mbl.es