CITOQUIMICA “APLICADA A LA HEMATOLOGIA” Bqca. Ivan María Victoria Hematología Clínica 2012 La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos: enzimas, metales pesados, sustancias orgánicas moléculas de depósito y otras sustancias. MORFOLOGÍA <-----> BIOQUÍMICA Son un complemento de las tinciones hematológicas. Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias inorgánicas. Así se mejora la diferenciación celular. También sirven para el diagnóstico CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS CITOMORFOLOGIA. 70-80% CITOQUIMICA. 90-95% INMUNOFENOTIPO MAS MICROSC. ELECTRN. CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR 99-100% MUESTRAS UTILIZADAS EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA PUNCION DE MÉDULA ÓSEA PUNCION DE GANGLIOS LCR TIPOS DE TINCIONES Se pueden clasificar en: Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales. Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el Dx hematológico, se dividen en tradicionales y especiales. TINCIONES VITALES Y NO VITALES Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas. Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina (eosina). Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos (azul de metileno). Colorantes neutros: neutros son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno). Colorantes indiferentes: indiferentes son los que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante (Sudán III) También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras. (MayGrünwald-Giemsa) Y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas (azul de metileno, eosina, Wright) Las reacciones citoquímicas pueden también clasificarse según el mecanismo químico involucrado 1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mínimo pero no un máximo. 2-Progresivas indefinidas: En estas la reacción continúa y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores erróneos. 3-Fugaces: Son las que pierden color rápidamente y no pueden conservarse mucho tiempo. CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS CITOQUÍMICAS CITOQUÍMICA CLÁSICA CITOQUÍMICA ELCTRÓNICA CITOQUÍMICA FLUORESCENTE INMUNOCITOQUÍMICA NO FLUORESCENTE CITOQUÍMICA AUTOMATIZADA Citoquímica Clásica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e interpretarse con el microscopio óptico común. Citoquímica electrónica: Se caracteriza por ser una metodología de elevada sensibilidad Citoquímica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoquímica, se fijan sobre distintas estructuras de las células y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores Inmunocitoquímica no fluorescente:Se basa en la marcación de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones citoquímicas intensamente coloreadas que permiten su revelación. Fisicocitoquímíca electroforética Permite reconocer determinados componentes de las organelas celulares obtenidas en solución mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un campo eléctrico y la identificación por reacciones citoquímicas, permite identificar complejos isoenzimáticos, mientras que los métodos citoquímicos simples revelan una enzima en bloque. Citoquímica automatizada: CITOQUIMICA ELECTRONICA: CITOQUIMICA FLUORESCENTE: •INMUNES •NO INMUNES S P INMUNOCITOQUíMICA NO FLUORESCENTE Inmunocitoquímica con detección indirecta y enzimática. La sección se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante después se incuban en una solución de bloqueo que satura los posibles sitios de unión inespecífica, gracias a una alta concentración de proteína como la albúmina de suero bovino. Tras cada paso de unión de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solución tamponada de fosfato (tampón fosfato), en la que también van disueltos los anticuerpos. La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el peróxido de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio ótico. CITOQUIMICA AUTOMATIZADA: Definición de reacción citoquímica Es la reacción que por el método de uno o mas reactivos químicos: aplicados a la célula en condiciones definidas; determina la formación de productos coloreados; insolubles; no difusibles; que permiten el reconocimiento microscópico; de sustancias o grupos químicos definidos; en su real ubicación citológica; para lo cual no deben destruir a la célula, y si lo hacen deben reemplazar a la sustancia identificada en su topografía Las finalidades primordiales de la citoquímica son: El reconocimiento y diagnostico celular El estudio de la fisiología y la fisiopatología celulares El Dx de la patología ESTANDARIZACION DE METODOS EN CITOQUIMICA Preparación estricta de los reactivos Practicas permanentes de las reacciones con preparados testigos Realización, la fijación y conservación adecuada de los preparados y reactivos Determinación de tiempos exactos para cada uno de los pasos Ídem de temperatura (especial para enzimas) Tiempo y condiciones de la inmersión para la lectura Diámetros y conservación idóneos de los elementos sobre los cuales se lleva a cabo la determinación Tres pasos fundamentales: Fijación: preservar las estructuras y reactividad funcional de las células. Incubación en el medio de reacción: como consecuencia se generan productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado. Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de reacción . Las reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad. Pueden ser reconocibles…. SUSTANCIAS RECONOCIBLES: ENZIMAS RECONOCIBLES 1-DNA Y RNA. 2-PROTEINAS. 3-HEMOGLOBINA. 4-HIDRATOS DE CARBONO. 5-LIPIDOS. 6-FOSFOLIPIDOS. 7-METALES 1-MIELOPEROXIDASAS (MPO) 2-FOSFATASA ALCALINA (FAL) 3-FOSFATASA ACIDA (FAC) 4-ESTERASAS (EST) 5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO RESISTENTE (FAC-TR) 6-DEHIDROGENASAS (DH) CITOQUIMICA CLASICA reconocimiento por: principios no enzimáticos principios enzimáticos Hidratos de carbonos: PAS MPO Fe hemosiderínico: PERLS FAL Lípidos: Red Oíl/Sudan Black FAL Hemoglobina fetal: elución acida ESTEARASAS CATALASAS ENZIMAS HIDROLITICAS TINCIONES CLASICAS 1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS TINCIÓN DE PAS (Peryodic Schiff Acid) Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso. -C-C- ALDEHIDOS ACIDO PERYODICO “PURPURA” SCHIFF RESULTADOS: células (+) con patrón difuso fucsia intenso, lacunar y granular de acuerdo a la progenie Serie granulocitica normal: (+) difusa en toda la serie mieloide Basófilos: (+) con patrón lacunar o (–) hasta un 50% Serie eritroide normal: negativa Serie megacariocitica normal: (+) en plaquetas con un patrón difuso mas granular o bloques Precursores linfoides: (-), hasta llegar a linfocito en el que un 30% es (+) en corona de gránulos NEUTROFILO Y ERITROBLASTOS NORMALES MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS NORMALES LINFOBLASTOS LEUCEMICOS PAS (+) LMA6 en MO PAS (+) TINCION DE PERLS Se basa en la liberación de los iones férricos de su unión con las proteínas por la acción del ácido clorhídrico; dichos iones férricos al reaccionar con el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico. Por esta reacción se detecta el Fe hemosiderínico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble. Sideroblastos en anillo Reflejando una anormalidad en la acumulación de Fe en las mitocondrias (azul de Prusia) HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parámetros: nº de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofágico. Básicamente se presentas 3 patrones: 1) nº sideroblastos alto y Fe de depósito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anémicos que cursan con sobrecarga férrica. 2) nº sideroblastos bajo y Fe de depósito disminuido o ausente: es el patrón característico de la anemia ferropénica pura; de aparición muy precoz en un balance férrico negativo. 3) nº sideroblastos bajo con acúmulo de Fe en los macrófagos medulares. Este patrón disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrófagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias. Hemocromatosis (cortes histológicos de hígado) HEMOGLOBINA FETAL Test de Kleihauer-Betke La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y álcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras. Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguíneo Rh(-). SUDAN BLACK / RED OIL Ambas se utilizan para la detección de lípidos, en el caso del Sudan Black este tiñe los fosfolípidos y esteroles de membrana de los gránulos. Es un colorante lipofilo que se une de forma irreversible a un componente granular indefinido en los granulocitos, en los eosinofilos y en algunos monocitos. El producto de la reacción es negro y granular Tiñe tanto los gránulos azurófilos inespecíficos como los específicos de los neutrofilos LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tinción de las células en maduración y de los gránulos de los eosinofilos anormales. 2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS MIELOPEROXIDASA La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reacción. BENCIDINA H2O2 MPO Resultados…. siempre patrones granulares! ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS (etanol) GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : (+) patrón granular intenso en toda la serie granulocítica mieloide y en menos del 3% de los blastos en MO. Los blastos mieloides dan un patrón característico polar, en casquete. EOSINÓFILO (+) en la membrana granular, el fondo del granulo conserva la coloración parda. BASÓFILO (+) en 50% LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS MONOCITOS: (+) patrón granular escaso o disperso NORMALES. . PATOLOGICOS… “ESTRES OXIDATIVO” Scorificación de MPO en granulocitos: Se categorizaron los neutrófilos de acuerdo al contenido de gránulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente. Grado 0: Sin granulaciones teñidas. (fig. 1 y 2) Grado 1: Escasas granulaciones teñidas dispersas (fig.3 y 4) Scorificación de MPO en granulocitos: Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el núcleo (fig. 5) Grado 3: abundantes granulaciones teñidas en todo su citoplasma sin llegar a cubrir completamente el núcleo. (fig.6 ) Scorificación de MPO en granulocitos: Grado 4: granulaciones que cubren la célula completamente dándoles un aspecto de casquete. (fig.8 y 9) FOSFATASA ALCALINA La FA es una fosfomonoesterasa que es activa francamente a ph alcalino y actúa sobre grupos esteres fosforados liberando el ion fosfato. La actividad de la FA granulocítica es marcadora de la granulación especifica de los neutrófilos. Inicialmente se pensó que la FA estaba localizada en gránulos específicos (secundarios), pero se demostró que esta asociada con un componente membranoso del citoplasma identificado como una estructura tubular de forma irregular distinta de los gránulos 1 o 2 y de otras organelas citoplasmáticas. Alfa-naftil fostato ph alcalino FAL naftilo fosfato Colorante diazoico Compuesto diazotado Cuidados: Efectuar la reacción en frotis de no mas de 24 hs. Conservar los preparados en heladera envueltos en papel absorbente con un desecador. Ph de la reacción . La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma Se encuentran actividad FA en algunas células maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica (segmentados y bandas) Índice de actividad de FAL Es la suma de los grados de positividad de 100 neutrófilos. Score: 95+/-20 Grado 0: sin reacción Grado I: coloración difusa o con pequeños puntos coloreados Grado II: mayor densidad cromática, por lo general en la zona del hilio nuclear. Grado III: mayor granulación oscura, tiñe todo el citoplasma. Grado IV: completamente oscuro FOSFATASA ACIDA Se basa en la hidrólisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato. La aplicación práctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los síndromes linfoproliferativos crónicos (LPC) y leucemia aguda linfoblástica (LAL), dónde existe una buena correlación entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana. FAC LT(+) Y LB (-) El 90% de las LAL de origen T dan una reacción + intensa de localización centrosómica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B. Tricoleucemia: Tinción fosfatasa ácida (+) tartrato resistente LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS. ESTEARASAS 4 sustratos: Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) Naftol-AS-D-acetato α-naftil-acetato α -naftil-butirato hidrolizados “sal diazoica” “precipitado insoluble” ESTERASAS Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar ésteres en sus componentes ácidos y alcoholes. Existen diferentes variedades según el substrato empleado. GR y su progenie Granulocitos y su progenie Linfocitos y su progenie Monocitos y su progenie Naftil butirato/ acetato Normales (-) (+) M6 (-) o con algunas granulaciones F Resit (-) o + débil (+++++) Fluoruro sensible Naftil cloro acetato Idem (+++++) (-) (+) LMA5 (monocitica) MO “TINCION DE ESTERASAS COMBINADAS”: monoblastos teñidos de marrones (esterasas no especificas) y un neutrófilo teñido de azul (cloroacetoesterasa) EN RESUMEN….. PAS Fe MPO FAL FAC ANAE NCAE Sudan Black Granulocitos Linfocitos Mb Seg Lbl Lin Monocitos Mbl Mon Plaquetas Mg Pq Eritrocitos PEbl GR |