PURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN DE LIPASAS MEDIANTE SU ADSORCIÓN ESPECÍFICA A LIPASAS INMOVILIZADAS Ortiz, C.;Palomo, J.M .;Fernández–Lorente, G.; Fuentes, M.; Torres, R; Guisán, J.M.;Fernández-Lafuente, R. LABORATORIO DE BIOCATÁLISIS INSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROLEOQUÍMICA-CSIC Purificación de Enzimas PURIFICACION DE ENZIMAS E1 Reacción R a evitar O C E2 Alta actividad volumétrica N H R' Reacción deseada R'' COO E3 Reacción a evitar Reacciones indeseables Oxidaciones… Hidrólisis… Purificación de Enzimas PURIFICACION DE ENZIMAS A ESCALA LABORATORIO UV280 Ve 9Adsorción de todas las enzimas (1mg de nuestra enzima/ml) 9Desorción selectiva de nuestra enzima 9Varios procesos cromatográficos… 9No importa tiempo ni dinero Purificación de Enzimas PURIFICACION INDUSTRIAL DE ENZIMAS ¾Métodos sencillos, rápidos y baratos ¾Pocos pasos cromatográficos ¾Columnas cromatograficas pequeñas UV280 Ve Adsorción selectiva ¨ 100 mg/ml columna Conocer mucho mejor los mecanismos de interacción Purificación de Lipasas LIPASAS Activación interfacial en presencia de interfases Cara externa del Lid Conformación cerrada Conformación abierta Interfase hidrofóbica zona hidrofóbica zona hidrofílica Sitio activo Cara interna del Lid Conformación abierta Lipasas LIPASAS Diferentes conformaciones de lipasas Medios acuosos Conformación cerrada INACCESIBLE A SUSTRATOS Interfases hidrofóbicas Conformación abierta ACCESIBLE A SUSTRATOS Lipasas LIPASAS Las lipasas muestran actividad esterásica en ausencia de interfases zona hidrofóbica zona hidrofílica HIPÓTESIS: Equilibrio entre las distintas conformaciones de lipasas en medios acuosos homogéneos Purificación de Lipasas LIPASAS Adsorción interfacial sobre soportes a baja fuerza iónica Soporte Hidrofóbico Conformación cerrada Conformación abierta Pequeños bolsillo hidrofóbicos… Solo se absorben a ÇFuerza Iónica Purificación de Lipasas Actividad Residual (%) PURIFICACION DE LIPASAS POR ADSORCION SELECTIVA, A BAJA FUERZA IONICA, SOBRE A SOPORTES HIDROFOBICOS 2000 1500 HLL 1000 500 0 0 30 60 Tiempo (minutos) 90 Actividad Residual (%) Actividad Residual (%) 800 600 PFL 400 200 0 0 20 40 Tiempo (minutos) 60 800 600 RNL 400 200 0 0 30 60 Tiempo (minutos) 90 Purificación de Lipasas Mecanismo de activación interfacial y Purificación de lipasas Las lipasas se adsorben específicamente a superficies hidrofóbicas (a baja fuerza iónica) Cada lipasa se adsorbe de una forma diferente a soportes hidrofóbicos diferentes Aumento de actividad hacia sustratos solubles pequeños y alteración de su enantioselectividad Purificación de lipasas de otras proteínas (Adsorción selectiva sobre matrices hidrofóbicas) Purificación de lipasas entre sí (Desorción selectiva con detergentes o co-disolventes) Lipasas LIPASAS Las lipasas muestran actividad esterásica en ausencia de interfases zona hidrofóbica zona hidrofílica HIPÓTESIS: Equilibrio entre las distintas conformaciones de lipasas en medios acuosos homogéneos Purificación de Lipasas Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa Lipasa1 Inmovilizada Dimero Lipasa Inmovilizada- Lipasa Lipasa2 Soluble Desarrollo del Soporte NH2 LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS Y SOPORTES GLIOXIL NH2 H2N H2N H2N pH 8.0 (NO) H2N pH 10.0 (NO) NH2 H2N Regiones muy ricas en grupos aminos H2N H2N H2N pH 10.0 (SI) Desarrollo del Soporte PUNTO FINAL DE LA MULTI-INTERACCION ENZIMA-SOPORTE O O CH2 C O CH 2 CH 2OH O CH 2 CH 2 NH O CH 2 CH 2 NH O CH 2 CH 2 NH O CH 2 CH 2OH H O CH2 CH N O CH2 CH N NaBH4 1mg/ml O CH2 N CH O O CH2 C H Metodología Experimental Selección de la enzima adsorbente CARA FRONTAL CARA OPUESTA LYS LYS LYS LYS LYS LIPASA DE Pseudomonas fluorescens (PFL) lipasa estable y capaz de formar dímeros lipasa con las lisinas en la cara opuesta a su centro activo Metodología Experimental Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa H2N O O H2N O H H2N H H Glioxil-agarosa Tritón X-100 (pH 10, NaBH4) Lipasa 1 estabilizada Soporte inerte Lavado con agua Lipasa-Soluble Glioxil-Agarosa-lipasa 1-Lipasa 2 Glioxil-Agarosa-lipasa 1 (Soporte) Resultados 100 A ctividad Residual (%) Actividad Residual (%) Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa 80 60 40 20 0 0 6 12 18 Tiempo (h) 24 94 67 100 80 43 60 30 40 20 20.1 0 0 1 2 3 Tiempo (h) 4 1 Inmovilización de PFL sobre glioxil-agarosa Blanco Sobrenadante Suspensión Adsorción de PFL sobre glioxil-agarosa-PFL Blanco Sobrenadante 2 3 SDS-PAGE de PFL purificada Línea 1. Marcadores de peso molecular Línea 2. Extracto comercial de PFL Línea 3. PFL adsorbida sobre glioxil agarosaagarosa-PFL Resultados Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa B Actividad Residual (%) A Mr (kDa) 100 75 94 50 67 25 43 0 0 20 40 60 30 Tiempo (min) 20.1 Adsorción de BTL sobre glioxil-agarosa-PFL Blanco Sobrenadante 1 Línea Línea Línea 1. 2. 3. 2 3 Marcadores de peso molecular Extracto comercial BTL Fracción BTL adsorbida a glioxil agarosa PFL Adsorción del extracto enzimático de Bacillus thermocatenulatus (BTL) Resultados Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa Mr (kDa) 94 67 Línea Línea Línea Línea Línea Línea Línea 43 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Marcadores de peso molecular Extracto comercial RML Fracción RML adsorbida a glioxil agarosa PFL Extracto comercial HLL Fracción HLL adsorbida a glioxil agarosa PFL Extracto comercial ROL Fracción ROL adsorbida a glioxil agarosa PFL 30 20.1 1 2 3 4 5 6 7 Lipasas purificadas a partir de los extractos comerciales de •Rhizomucor miehei (RML) •Humicola lanuginosa (HLL) •Rhizopus oryzae (ROL) Resultados Desarrollo de Biocatalizador de lipasa 2 Inmovilizada sobre Soporte glioxil-agarosa-lipasa1 Ser (D-pNP) Glioxil-Agarosa-lipasa 1 Lipasa 2 Glioxil-Agarosa- Lipasa 1-Lipasa 2 Modulación de las propiedades funcionales de lipasas mediante interacción lipasa-lipasa Resultados Modulación de las propiedades funcionales de lipasas mediante interacción lipasa-lipasa Derivado PFL Actividad Específica (U/g) Conversión (%) ee E Octil-agarosa-PFL 23 14.6 97 76 S Glioxil-agarosa-PFL 0.019 15 81 9.6 S Glioxil-agarosa-PFL*-PFL 0.077 9.4 99 >100 S Hidrólisis enantioselectiva del (R,S) HPBEt 10 mM con derivados de PFL, a pH 5 y 25 ºC CONCLUSIONES CONCLUSIONES La lipasa de Pseudomonas fluorescens inmovilizada covalentemente sobre soportes glioxil-agarosa resultó ser un excelente soporte hidrofóbico para la adsorción selectiva de otras lipasas. Es posible obtener dímeros glioxil-agarosa-PFL-Lipasa, pudiéndose utilizar este método como estrategia de purificación e inmovilización de diferentes extractos crudos de lipasas. Diferentes derivados de una misma lipasa presentaron distintas propiedades catalíticas (Actividad y Enantioselectividad) en las mismas condiciones de reacción. MUCHAS GRACIAS